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www.moderninstrs.org.cn2012年 第18卷 第3期研究报告
摘 要 目的 建立相思子毒素的凝胶 HPLC分析方法，用于测定相思子毒素纳米
粒的包封率。方法 采用 TSKgel G2000SWXL凝胶色谱柱；流动相为 20mmol/L PB，
pH =7.3，流速为 0.8mL/min；柱温为 25℃；分析时间为 20min；紫外检测波长为 214
nm；进样量 60μL。结果 2种纳米粒上清液对于相思子毒素的测定均无干扰；相
思子毒素保留时间为 10.35±0.55min（n=20）；在浓度范围 12.5~400μg/mL内，峰
面积与相思子毒素含量成良好的线性关系：y=52.85676x-342.656, R=0.9999（n=6，
P<0.0001）；相思子毒素日内平均回收率为 100.47%~107.73%，RSD为 0.17%~0.25%；
日间回收率为 100.87%~106.33%，RSD为 1.48%~2.18%；温度对于相思子毒素含量
变化影响很小，5日内，相思子毒素样品在室温、4℃以及 -20℃保存均较为稳定，检
测浓度平均回收率为 98.04%~106.86%，RSD<3%；蛋白的最低检测限为 49.5ng。结
论 该方法专属性强，可用于相思子毒素纳米粒包封率和释药率的测定，也可用于较
低含量相思子毒素的定量分析。
关键词 相思子毒素 凝胶 HPLC 纳米粒 包封率
Abstract Objective: To developed a Gel-HPLC method for the determination of loading
efficiency of the abrin nanoparticles. Methods: The chromatographic column TSKgel
G2000SWXL was used with 20mmol/L PB (pH=7.3) as the mobile phase. The fl ow rate
was 0.8 mL/min, analytical time was 20 min, UV detection wavelength was set at 214 nm,
temperature was 25℃, and injection volume was 60 μL. Results: The results indicated that
there were excellent linearity between peak area and concentration of abrin in the concen-
tration range of 12.5~400μg/mL: y=52.85676x-342.656, the correlation coeffi cients was
0.9999(n=6, P<0.0001). The low limit of detection was 49.5ng.The intra-day and inter-day
RSDs were 0.17%~0.25%, 1.48%~2.18%, the method recoveries were 100.47%~107.73%,
100.87%~106.33%, respectively (n=5). Abrin could be preserved for five days at room
temperature, 4℃ and -20℃, while the recoveries were 98.04%~106.86%, and RSDs were
less than 3%. Conclusion: The method is accurate, reliable and reproducible for determina-
tion of abrin entrapment effi ciency and loading effi ciency in nanoparticles or low content of
abrin in other situation.
Key words Abrin Gel-HPLC Nanoparticles Loading effi ciency
凝胶HPLC测定相思子毒素纳米粒包封率 *
Determination of loading effi ciency of the abrin
nanoparticles by Gel-HPLC
* 基金项目：国家重大新药创制项目（2009ZX09103-384）
** 通讯作者：李丽琴，中国人民解放军防化研究院第四研究所，邮编：102205
宋良才 李丽琴 ** 徐建富
Song Liangcai Li Liqin
Xu Jianfu
（中国人民解放军防化研究院第四研
究所 北京 102205）
(Research Institute of Chemical De-
fense, Being 102205)
中图分类号：O657.7 R93 文献标识码：A 文章编号：1672-7916(2012)03-0024-04
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《现代仪器》 2012年 第18卷 第3期 研究报告
相思子毒素 (Abrin)是存在于豆科藤本植物相思子
(Abrus Precatorius)种子中的一种蛋白毒素，分子量约
60~62KD，属Ⅱ型核糖体失活蛋白 (RIPs)[1]。研究表明，
相思子毒素可用于恶性肿瘤的治疗，对于大多数肿瘤具有
杀伤作用。根据文献 [2]报道，相思子毒素对艾氏腹水瘤、
Lweis肺癌、B16黑色素瘤、白血病、纤维肉瘤、卵巢肉
瘤、恶性黑色素瘤、Ewing’肉瘤等都具有显著的抑制作用。
但是由于毒素的毒性较大，Fodstad等 [1]用相思子毒素原
型药物进行的临床实验最终未能继续下去。
药物经纳米化后在理化性质、药代动力学、药效学、
毒理学等方面往往会呈现出与普通制剂显著的差异，通常
会产生许多新的治疗效果。纳米粒在作为抗肿瘤药物载体
方面的应用尤为引人注目 [3]，借助纳米载药系统可能有
望实现相思子毒素的高效、缓释和靶向给药，从而有助于
将其开发成为一种新型、有效的抗癌药物。
相思子毒素作为一种蛋白毒素，最早普遍用免疫
检测方法来检测。主要有放射免疫分析法 [4]（Radioim-
munoassay，RIA）和酶联免疫吸附法 [5~6](Enzyme-linked
immunosorbent assay，ELISA)。免疫法分析毒素具有灵敏、
准确的特点，适合极微量毒素的分析鉴定，可以用于追踪、
研究毒素在体内的代谢、转化过程。但缺点是毒素的抗体
不容易获得，也不便于长期保存，放免法对于环境有一定
的影响，ELISA法时间也过长。
应用高效液相色谱分析蛋白因其快速、准确的优点近
年来引起关注 [7]。凝胶过滤液相色谱是根据分子量相对
大小将其进行分离的一种色谱技术，其主要是依赖分子筛
原理来实现对大分子蛋白的分离。凝胶过滤液相色谱的分
辨力不及反相色谱，但它是一种温和的色谱技术，尤其适
合于生物大分子的分离和分析 [8]。本文将采用凝胶高效
液相建立一种快速、准确的相思子毒素分析方法，以用于
测定相思子毒素在纳米给药系统中的包封率，为相思子毒
素的药物开发打下基础。
1 仪器和试药
相思子毒素（abrin P2）为本实验室提取于云南西双
版纳产相思豆 , 并经质谱、肽指纹图谱、小鼠急性毒性实
验鉴定；其余试剂均为国产分析纯或进口分装。
0.22μm 微孔滤膜（北京黎明化工厂）；Agilent
1200 高效液相色谱仪（美国 Agilent 公司）；TSKgel
G2000SWXL凝胶柱（5μm，7.8×300mm，日本 TSK公司）；
Sartorius BT-25S分析天平（德国 Sartorius公司）；sigma
3K30 超速冷冻离心机（sigma公司）；Pall Purelab Plus纯
水仪（Pall公司）；Mettler toledo实验室 pH计（梅托利公司）；
Bruker Ultrafl ex TOF/TOF型生物质谱仪（德国布鲁克公司）。
2 方法和结果
2.1 样品制备
相思子毒素标准品制备：精密称取相思子毒素 2.50
mg，溶于 1mL超纯水中，充分混匀溶解，配成 2.5μg/μL
的溶液，用 0.22μm的微孔滤膜过滤后，置 4℃冰箱中保
存备用。
相思子毒素纳米粒上清液制备：分别取离子交联法反
应后得到的相思子毒素壳聚糖纳米粒混悬液、乳化挥发法
制备得到的相思子毒素聚乳酸羟基乙酸纳米粒混悬液，以
及各自空白纳米粒，在 4℃、30000g条件下离心 30min，
用 0.22μm的微孔滤膜过滤后，即得相思子毒素纳米粒上
清液，置 4℃冰箱中保存备用。
2.2 色谱条件
色谱柱：TSKgel G2000SWXL，填料为硅胶；流动相：
20mmol/L 磷酸盐缓冲液 PB，pH =7.3；流速：0.8mL/min；
分析时间：20min；柱温：25℃；检测波长：214 nm；进样量：
60μL。
2.3 系统干扰因素实验
将相思子毒素、空白纳米粒上清液，以及混合相思子
毒素的纳米粒上清液分别单独进样，各进样 60μL，比较
与各样品单独进样时的出峰情况，考察它们对相思子毒素
分析的干扰情况。收集相思子毒素标准品单独进样时的出
峰处组分，采用生物质谱测定其分子量作鉴定。
相思子毒素进样后，仅在 10.3min左右处均有一个峰，
收集该处峰组分采用生物质谱分析测定，其分子量与相思
子毒素标准品分子量吻合，表明该组分即为目标产物相思
子毒素（见图 1）。经多次测定分析，相思子毒素保留时
间为 10.35±0.55min（n=20）。壳聚糖纳米粒、PLGA纳
图 1 相思子毒素 HPLC 色谱图和质谱图
a.相思子毒素 (abrin P2)；b.质谱测定结果，其中 60923.5为分子
离子峰，30509.5为双电荷离子峰
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米粒 2种空白纳米粒上清液在本文所建立的分析方法中
均未检出明显吸收峰，而混合蛋白后在 10.3min左右处
检出蛋白吸收峰，表明它们对相思子毒素的测定和分析
均无干扰。
2.4 线性关系考察
将毒素标准品分别用纯水稀释至如下浓度：400μg/mL，
200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，
分别进样 60μL，每个浓度连续进样 3次，以相思子毒
素蛋白浓度为横坐标、峰面积平均值为纵坐标对样品浓
度作线性回归，得相思子毒素含量的标准曲线方程为：
y=52.85676x-342.656，R=0.9999（n=6，P<0.0001）， 在
相思子毒素浓度为 12.5~400μg/mL的范围内中，测定结
果较为准确，蛋白含量与峰面积积分值之间呈现良好的
线性关系。
2.5 精密度测定
称取相思子毒素样品，按高、中、低水平配成 320
μg/mL，100 μg/mL，20 μg/mL 3个不同浓度，以所确
定的色谱条件连续进样 5次，同一样品再连续测定 5日，
每天进样 1次，分析批内变异情况，考察日内和日间精密
度，考察结果（见表 1），日内 RSD为 0.17%~0.25%，日
间 RSD为 1.48%~2.18%，表明方法精密度良好。
表 1 回收率 (n=5)
浓度 (μg/mL)
日内 日间
精密度 RSD(%) 精密度 RSD(%)
320 0.17 1.48
100 0.23 2.07
20 0.25 2.18
2.6 回收率测定
重新称取相思子毒素样品，按高、中、低水平配成
320 μg/mL，100 μg/mL，20 μg/mL 3个不同浓度，以
所确定的色谱条件连续进样 5次，同一样品再连续测定 5
日，每天进样 1次，分析批内变异情况，并根据所得峰面
积按照 2.4项下所得的标准曲线计算回收率。考察结果表
明，相思子毒素在日内平均回收率为 100.47%~107.73%；
日间回收率为 100.87%~106.33%，表明精密度和回收率均
良好。具体测定结果（见表 2）。
表 2 回收率 (n=5)
加入浓度
(μg/mL)
日内 日间
测定浓度 (μg/mL) 回收率 (%) 测定浓度 (μg/μL) 回收率 (%)
320 323.71±0.55 101.16 324.34±4.80 101.36
100 100.47±0.24 100.47 100.87±2.09 100.87
20 21.55±0.05 107.73 21.27±0.46 106.33
2.7 稳定性考察
配制 3份相思子毒素样品，浓度均为 40μg/mL。将 3
份样品分别放置在室温、4℃、-20℃下保存，每天测定 1
次，连续测定 5日，考察不同温度条件对相思子毒素稳定
性的影响。稳定性考察结果（见表 3）。从表中可知，5日
内，相思子毒素样品在室温、4℃以及 -20℃下冰冻保存
均较稳定，峰面积 RSD小于 3%，检测浓度平均回收率为
98.04%~106.86%，其中 4℃以及 -20℃下冰冻保存样品测
定结果更加稳定。在反复冻融的情况下相思子毒素含量几
乎无变化，提示反复冻融对其影响很小，相思子毒素对温
度变化可能具有一定的耐受性。
表 3 相思子毒素稳定性
样品
保存
条件
样品浓度
(μg/mL)
测定结果 (μg/mL) RSD
(%)
回收率
(%)1 2 3 4 5 平均
室温 40 40.20 40.82 43.90 43.95 44.84 42.74 2.08 106.86
4℃ 40 38.68 38.81 38.39 40.21 39.99 39.22 0.82 98.04
-20℃ 40 41.21 41.04 41.45 40.88 41.26 41.17 0.22 102.92
2.8 最低检测限测定
取稀释的相思子毒素标准品进行 HPLC 分析，所得
结果在 10.3min处采用手动积分，逐次减少进样量至信噪
比低于 3，最终确定毒素蛋白的最低检测限为 49.5ng。
3 讨论
凝胶高效液相色谱柱是近年来新发展的一种分析柱，
尤其适于生物大分子如蛋白质、多肽、糖类的分离和定量，
具有准确、可靠、重复性高、条件温和的特点。缺点是对
于压力、有机溶剂、pH值耐受能力较弱，对样品的富集
能力也不如反相柱，另外柱子使用寿命偏短、价格还比较
昂贵也是其不足之处，目前该方法尚在进一步发展之中。
有文献 [9]报道可采用 C18柱用于相思子蛋白的定量
分析，本文在建立相思子毒素分析方法时也曾尝试采用反
相 C18柱和 C4柱（孔径均为 5μm），但是均未能实现蛋
白的分离，采用生物质谱对各疑似峰鉴定，表明均非目标
产物，分析原因可能是是由于相思子毒素分子量太大，在
反相柱中几乎全部被保留。
对相思子毒素在 190~450nm范围内紫外扫描表明在
214nm和 280nm处出现最大吸收，其中 214nm处吸收更
高。在选用流动相时，曾采用纯水、醋酸盐缓冲液等作为
流动相，但是效果均不如磷酸盐缓冲液，纯水作为流动相
时会产生分裂缝，醋酸盐缓冲液的背景吸收过高。另外，
过高的盐浓度容易形成结晶而影响系统的运行寿命，故最
终确定缓冲液为 20mmol/L的磷酸盐缓冲液。实验中还发
现，当降低流动相的 pH值时，样品保留时间会稍有延长，
反之则会相应的有所缩短，多次比较最终确定选用 pH7.3
时最为合适。
（上转第20页）
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4 结论
本文建立相思子毒素 P2的凝胶 HPLC分析方法，该
方法专属性强，检测灵敏，操作简单、快捷，可用于相思
子毒素 P2纳米粒包封率和释药率的测定，也可用于较低
含量相思子毒素 P2的定量分析。
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