全 文 :麦冬多糖口服吸收促进剂的研究
林晓1,卢智玲1,2,徐德生1,3,冯怡1,沈岚1
(1.上海中医药大学 中药现代制剂技术教育部工程研究中心,上海 201203;
2.杭州市药品检验所,浙江 杭州 310017;
3.上海中医药大学 附属曙光医院,上海 200021)
[摘要] 目的:研究适用于麦冬多糖(OJP)的口服吸收促进剂,为寻求利用吸收促进剂来实现 OJP口服给药提供依据。
方法:通过Caco2细胞模型,对薄荷油、丁香油、冰片、三七花皂苷、麦冬皂苷、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1和癸酸钠的吸收促进
作用和细胞毒性进行评价。通过大鼠在体肠段试验,对 OJP在各肠段的吸收情况以及癸酸钠对吸收的促进作用进行研究。
结果:癸酸钠是既有效又安全的吸收促进剂,而丁香油、薄荷油、麦冬皂苷的吸收促进作用与细胞毒性高度相关。OJP在十二
指肠、回肠和结肠段中均有少量吸收,其中在十二指肠中的吸收情况最好,回肠次之,而在结肠段最差。在使用癸酸钠之后,
各肠段对OJP的吸收均有显著提高,尤以结肠段最为明显。结论:吸收促进剂的吸收促进作用往往与其细胞毒作用相关,选
用安全而有效的吸收促进剂来增加麦冬多糖的口服吸收是有效且具有应用价值的一种方法。
[关键词] 麦冬;多糖;Caco2细胞;吸收促进
[收稿日期] 20081208
[基金项目] 国家中医药管理局中医药科学技术专项(0607ZQ04);
上海市青年科技启明星计划(07QA14050);上海市教委重点学科项
目(J50302)
[通信作者] 林晓,Tel:(021)51322211,Email:shutcm@163.com
麦冬多糖(OJP)是相对分子质量约3400的果
聚糖[1],近来被证实具有抗心肌缺血活性[2]。前期
在体大鼠肠吸收试验证实,肠道内并无明显的 OJP
降解产物出现,但其口服生物利用度仅17%。进
一步研究发现经细胞旁路的吸收方式是限制其口服
生物利用度的主要因素[3]。因为 OJP相对分子质
量小于5000,故利用吸收促进剂来可逆地打开肠细
胞间隙可能是促进 OJP口服吸收的有效且具有应
用价值的方法。
目前广泛研究的肠道吸收促进剂的种类繁
多[4],但多数的作用与其细胞毒性作用相关,仅少
数具有安全的吸收促进作用,如中链脂肪酸钠盐类、
一氧化氮供体等小分子化合物和壳聚糖及其衍生
物、巯基化聚合物等大分子聚合物。
本研究采用 Caco2细胞模型对来源于中药的
具有良好透皮吸收促进作用的挥发油[5]和据报道
有抗心肌缺血作用的皂苷类(有一定的表面活性,
因此可能具有黏膜吸收促进作用,同时希望和麦冬
多糖产生协同治疗作用)应用于口服吸收促进的可
行性进行了研究,并在此基础上通过大鼠在体肠段
吸收试验对利用吸收促进剂来实现麦冬多糖口服给
药的可能性进行了研究。
1 材料
Hepaclass100二氧化碳培养箱(英国 Thermo
Electron);XDS1B倒置生物显微镜(上海精密仪器
仪表有限公司);5810R高速冷冻离心机(美国
Beckman公司);F4500荧光分光光度计(日本Hita
chi公司);LC20AB高效液相色谱仪、RF10AXL荧
光检测器(日本 Shimadzu公司);MilicelERS跨膜
电阻仪(美国 Milipore公司);MilicelTM膜(04μm
poresize,06cm2,美国Milipore公司);细胞培养皿
(美国Corning公司)。
麦冬多糖OJP(自制,数均分子量3400,聚分散
度141);异硫氰酸荧光素(FITC)(美国 Sigma公
司);薄荷油和丁香油(自提,并用无水硫酸钠脱
水);三七花皂苷和麦冬皂苷(自制);人参皂苷Rg1、
三七皂苷R1、冰片(中国药品生物制品检定所,批号
分 别 为 110723200424,110745200415,110743
200504);癸酸钠(美国 Sigma公司);十二烷基硫酸
钠(华美生物工程公司);DMEM高糖培养基、高灭
活胎牛血清、非必需氨基酸、青链霉素、025%胰蛋
白酶002%EDTA消化液均购自美国 Gibco公司;
Hank's缓冲盐溶液(HBSS)和磷酸盐缓冲溶液
(PBS)均自配;细胞培养用水为新鲜三蒸水;其他所
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用试剂均为分析纯。
Caco2细胞株(购自北京协和医院,实验用的
细胞代数30~60代)。SD大鼠,雄性,(200±20)
g上海中医药大学动物试验中心,合格证号 SCXK
(沪)20030002。
2 方法
2.1 OJP的FITC标记
参照文献方法[6],并加以调整。取 OJP1g溶
于含 10滴吡啶的 10mL二甲亚砜中,加入 01g
FITC和20mg二丁基二月桂酸锡,密闭,95℃反应
1h,取出,冷却至室温,加10倍体积的氯化钠饱和
无水乙醇,所得沉淀经无水乙醇洗涤数次,将游离
FITC完全洗净,得FITCOJP089g。
2.2 细胞培养
参照文献方法[7],Caco2细胞株接种于常规培
养皿中,培养液为DMEM高糖,包括10%胎牛血清,
1%非必需氨基酸,1%丙酮酸钠,1%谷氨酰胺和
1%青链霉素。置于37℃ C02培养箱中,通入5%
CO2(RH90%)。当细胞汇合程度达到80%时,胰
酶消化,对于转运试验,将细胞按每孔2×105个接
种于MilicelTM膜AP侧,接种后每2d换液1次,1
周后每日换液,培养至21d。培养过程用跨膜电阻
仪定期检测跨膜电阻值(TEER)。
2.3 吸收促进剂对OJP细胞转运的影响
2.3.1 供试品溶液的配制 参考文献[7],一般吸
收促进剂都在01%左右,因此本研究也控制所使
用的吸收促进剂为01%,FITCOJP的质量浓度为
475mg·L-1。具体配制方法如下:分别取薄荷油、
丁香油、或冰片约50mg,精密称定,加入5mL1%
聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(Tween80)作为增溶
剂,混匀,再加入25mL950mg·L-1FITCOJP,用
HBSS定容至50mL。或分别取三七花皂苷、麦冬皂
苷、人参皂苷Rg1、三七皂苷 R1、癸酸钠或十二烷基
硫酸钠约50mg,精密称定,加入25mL950mg·
L-1FITCOJP,用HBSS定容至50mL。
2.3.2 FITCOJP细胞转运试验 取在MilicelTM膜
上培养21d,并且经细胞完整性验证合格的 Caco2
细胞,用于转运试验。试验前用空白 pH74HBSS
等渗溶液37℃培养20min后,HBSS清洗3遍,洗去
细胞单分子层表面的杂质。将04mL以上各供试品
溶液加到Caco2细胞微绒毛面AP侧作为供给液,同
时在基底面BL侧加入06mL空白pH74的HBSS
溶液作为接受液。将该装置放入37℃ CO2恒温培养
箱中孵育。分别于05,1,2,3h从接受室取样03
mL,同时补加等量空白pH74的HBSS溶液。
2.3.3 吸收促进剂的毒性评价 通过 Lowry法测
细胞蛋白渗漏[8]来评价吸收促进剂的毒性。标准
曲线的制备:试管中分别加入0,02,04,06,08,
10mL520mg·L-1的标准牛血清白蛋白溶液,加
水补至1mL,加入 folin酚试剂甲5mL,摇匀,室温
放置10min,再依次加入 folin酚试剂乙05mL,立
即摇匀,室温放置30min,测 A650。样品液的测定:
取给药孵育3h后的各孔AP侧药液,为避免其中有
细胞悬浮,10000r·min-1高速离心5min,取上清
液01mL,加水稀释至1mL,同上操作,测定A650。
2.4 FITCOJP大鼠肠段吸收试验
禁食12~18h但自由饮水的大鼠经腹腔注射
25%乌拉坦(04mL·100g-1)麻醉后,仰卧位固
定,颈动脉插管,腹部切口,分别暴露各肠段(胃起
10cm作为十二指肠段,小肠的最后10cm作为回
肠段,自盲肠起作为结肠段),用 pH74磷酸盐缓
冲液清洗内容物后,在所需部位的两端插管(各肠
段取7cm),密封一端。自另一端给FITCOJP4mg
和癸酸钠6mg,而后密封,缝合腹部切口。于给药后
05,1,15,2,25,3,4h从颈动脉插管处采血 04
mL,离心(9600r·min-1,10min),取上清液100μL
于1mL试管中,按25项所述方法进行测定。
2.5 FITCOJP测定方法
样品用 pH74Hank's液或磷酸盐缓冲液定容
至1mL后,用荧光分光光度仪测定其中的药物浓
度。测定条件:激发波长(ex)495nm;发射波长
(em)515nm;狭缝宽度(ex/em)50nm/100nm。
2.6 数据分析
在细胞转运试验中,用表观渗透系数 Papp来代
表药物转运能力的大小。
Papp=(dQ/dt)/(A×C0)
其中 dQ/dt为单位时间药物转运量(μg·
min-1);A为转运膜的面积,本试验A为06cm2;C0
(mg·L-1)为 FITCOJP的初始浓度;Papp单位为距
离/时间(cm·s-1)。
由于每次取样后都要补液,对药物的通透量产
生了稀释作用,因而药物的累计通透量 TRcum(mg·
L-1)可用以下公式进行校正:
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TRcum=An+
Vsn
VR
n-1
i=0
Ai
其中An为第n个样品通透量的测定值;Vsn为第
n个样品的采样体积;VR为接收池的体积。
3 结果
3.1 Caco2细胞完整性验证
光镜下细胞生长均匀,边界清晰,可清楚地看到
细胞之间的接触,如图1所示。电镜下可以清晰地
看到Caco2细胞的紧密连接以及微绒毛,微绒毛的
分化良好,如图2所示。TEER值是评价细胞紧密
连接的重要指标,从试验结果看,随着培养天数的增
加,TEER不断上升,在21d时达到600以上;同时,
细胞间转运标志物3H甘露醇的通透量每小时小于
05%,表明细胞间紧密连接已经形成。
图1 Caco2细胞光镜照片(200倍)
图2 Caco2细胞电镜照片
3.2 FITCOJP细胞转运情况
各种吸收促进剂对 FITCOJP表观渗透系数
Papp的影响见表1。冰片、三七花皂苷、三七皂苷 R1
和人参皂苷 Rg1对 FITCOJP的吸收均无明显促进
作用;丁香油、薄荷油或麦冬皂苷对 FITCOJP的吸
收则有显著的促进作用(P<005),但作用明显弱
于癸酸钠和十二烷基硫酸钠(P<001)。
3.3 毒性评价
以十二烷基硫酸钠作为有效性和高毒性的阳性
表1 吸收促进剂对FITCOJP转运的影响(n=3)
吸收促进剂种类 Papp/1×10-6cm·s-1
不含吸收促进剂的对照溶液 128±012
不含吸收促进剂但含1% Tween80 123±024
的对照溶液
冰片 175±037
三七花皂苷 101±015
三七皂苷R1 100±018
人参皂苷Rg1 133±027
丁香油 310±0251)
薄荷油 218±0241)
麦冬皂苷 324±0421)
癸酸钠 975±0542)
十二烷基硫酸钠 879±0332)
注:1)P<005,2)P<001,与不含吸收促进剂的对照溶液比较。
对照,将各吸收促进剂的蛋白渗出量与之对比见表
2,丁香油、薄荷油、麦冬皂苷的细胞毒性大于或等同
于十二烷基硫酸钠,显著高于吸收促进效果较好的
癸酸钠的毒性(P<005);冰片、三七花皂苷、三七
皂苷R1和人参皂苷 Rg1的细胞毒性小于或等于癸
酸钠,可进一步提高其用量来进行考察。从毒性角
度考虑,丁香油、薄荷油和麦冬皂苷不适合作为候选
促进剂。
表2 吸收促进剂对Caco2细胞的毒性(n=3)
吸收促进剂种类 A
不含吸收促进剂的对照溶液 0024±0009
不含吸收促进剂但含1% Tween80 0022±0015
的对照溶液
冰片 0060±0008
三七花皂苷 0048±0015
三七皂苷R1 0052±0010
人参皂苷Rg1 0056±0013
丁香油 0527±00312)
薄荷油 0109±00181)
麦冬皂苷 0114±00111)
癸酸钠 0069±0016
十二烷基硫酸钠 0122±0012
注:1)P<005,2)P<001,与低毒且有效吸收促进剂癸酸钠比
较。
3.4 FITCOJP大鼠肠段吸收情况
在没有吸收促进剂癸酸钠的情况下,FITCOJP
在十二指肠、回肠和结肠段中均有少量吸收,其中在
十二指肠中的吸收情况最好,回肠次之,而在结肠段
最差,见图3。该结果与小肠上皮细胞间隙较大肠
宽的解剖特点相一致,是麦冬多糖口服吸收机制为
经细胞间隙扩散结论[3]的又一佐证。合用癸酸钠
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可使各肠段对 FITCOJP的吸收均显著提高(P<
001),以结肠段最为明显,说明癸酸钠可更有效地
打开结肠上皮细胞间的紧密连接。癸酸钠对十二指
肠和结肠的吸收促进作用显著大于对回肠的吸收促
进作用(P<005)。
a.与用SC时大鼠回肠吸收FITCOJP的AUC相比P<005;
b.与不用SC时相应大鼠肠段吸收FITCOJP的AUC相比
P<001。
图3 癸酸钠(SC)对大鼠各肠段吸收
FITCOJP的影响(n=4)
4 讨论
在微量多糖的测定方面,笔者曾做过一些研究,
建立了1种适用于中性多糖和非还原寡糖的 HPG
PC柱后水解并荧光衍生的测定方法[11]。该方法对
OJP的检测限可达25ng,但仍不能满足本实验研究
的要求。多糖的异硫氰酸荧光素(FITC)标记已成
功地应用于葡聚糖,FITC与单糖残基的结合率仅为
03%~2%,故这种标记对多糖化学结构的影响往
往认为是可以忽略的。鉴于上述原因,本研究选定
用FITC标记 OJP来进行试验。经测定,自制3批
FITCOJP的荧光取代度为(035±009)%,HPGPC
测定结果表明FITCOJP仍为对称的单一锐峰,相对
保留时间和峰形与 OJP相比基本没有差异,说明反
应没有引起 OJP糖链的断裂。FITCOJP跨 Caco2
细胞后以及经大鼠各肠段吸收入血后的 HPGPC测
定结果表明OJP在这些过程是稳定的,是以原型进
行转运或吸收的。
经t检验,1%的冰片、三七花皂苷、三七皂苷
R1和人参皂苷 Rg1对麦冬多糖的吸收均无明显促
进作用;1%的丁香油、薄荷油或麦冬皂苷对麦冬多
糖的吸收有显著的促进作用(P<005),但与癸酸
钠和十二烷基硫酸钠相比作用明显弱得多(P<
001)。同时,它们的细胞毒性与阳性对照物十二
烷基硫酸钠相当,显著大于癸酸钠的毒性(P<
005),表现为吸收促进作用与细胞毒性作用高度
相关。为此,选取癸酸钠对应用吸收促进剂来实现
麦冬多糖口服给药的可能性进行了研究。研究结果
表明癸酸钠吸收促进作用明显,对各个肠段均有效。
因为人的肠道运动剧烈,分泌液量大,黏膜更新较
快,故实际应用时药物和吸收促进剂的释放速率也
可能会显著影响药物的吸收情况。快速释放药物和
吸收促进剂可在吸收部位获得较高的物质浓度,但
另一方面也会导致它们的滞留时间缩短和快速被消
化液所稀释。平衡好影响药物吸收的这两个相反方
面,将有利于充分发挥吸收促进剂的作用。
[参考文献]
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OralabsorptionenhancersofOphiopogonjaponicaspolysaccharides
LINXiao1,LUZhiling1,2,XUDesheng1,3,FENGYi1,SHENLan1
(1.EngineeringResearchCenterofModernPreparationTechnologyofTraditionalChineseMedicineofMinistryofEducation,
ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China;
2.Hangzhoudrugcontrolinstitute,Hangzhou310017,China;
3.AfiliatedShuguangHospitalofShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200021,China)
[Abstract] Objective:Toinvestigatesuitableoralabsorptionenhancer(s)forOphiopogonjaponicaspolysaccharides(OJP)
andprovidebasesofutilizingtheabsorptionenhancertorealizetheoraladministrationofOJP.Method:Theabsorptionenhancement
efectsandcytotoxicityofcloveoil,peppermintoil,borneol,Sanqisaponins,Maidongsaponins,GinsengsaponinRg1,Sanqisaponin
R1andsodiumcaprate(SC)wereevaluatedviaCaco2celculturemodel.TheabsorptionofOJPfromratintestinalsegmentsandthe
absorptionenhancementefectofSCwereinvestigatedbyinsituexperimentsofratintestinalsegments.Result:SCwasanefectiveand
safeabsorptionenhancer.However,theabsorptionenhancementefectsofcloveoil,peppermintoilandMaidongsaponinswerehighly
corelatedwiththeircytotoxicity.OJPalonewaspoorlyabsorbedfromaltheratintestinalsegments.Itwasrapidlyabsorbedwhenco
administeredwithSC,andtheabsorptionincreasewassignificantandthebestabsorptionenhancingsiteofSCforOJPwascolon.Con
clusion:Theabsorptionenhancementefectsofabsorptionenhancersareoftencorelatedwiththeircytotoxicity.Coadministratinga
powerfulandsafeabsorptionenhancerisanefectiveandvaluablemethodofenhancingoralabsorptionofOJP.
[Keywords] Ophiopogonjaponicas;polysaccharide;Caco2cel;absorptionenhancement
[责任编辑 周 驰]
《中国中药杂志》被国内外数据库收录情况和引证数据
1 国外数据库收录
美国SciFinder数据库:进入医学索引MEDLINE;进入《化学文摘》(CA);荷兰 Elsevier公司 Scopus数据
库;《国际药学文摘》(IPA);《毒物学文摘》(ToxFile);俄罗斯《文摘杂志》(AJ);波兰《哥白尼索引》(IC);
WHO西太平洋地区医学索引(WPRIM)。
2 国内数据库收录
“中国科学引文数据库”来源期刊;“中国学术期刊综合评价数据库”来源期刊;中国自然科学核心期刊;
中国中文核心期刊;中国科技核心期刊;《中国学术期刊文摘》中、英文版。
3 主要引证数据或数据库统计结果
《中国中药杂志》在中国知网(CNKI)的2008年下载量为31万,国内外用户达到2000余家。
据中国科学技术信息研究所分析研究中心发布的中国科技期刊核心版引证报告(2007):影响因子为
0.693,总被引频次3937,基金论文比0.53,被引半衰期5.68;扩展版:影响因子1.052;引文频次6853。
据中国学术期刊综合引证报告(2008版):影响因子为1.056,总被引频次6828,5年影响因子1.304。
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