全 文 :·研究论文·
红景天 Rhodiolarosea不同地理居群遗传多样性分析
王强1,阮晓1,江浩1,孟庆文1,王立和2
(1.浙江大学 宁波理工学院,浙江 宁波 315100;
2.北京红景天技术开发有限公司,北京 100088)
[摘要] 目的:研究分布于中国新疆天山地区红景天属植物定名种红景天Rhodiolarosea不同居群的遗传多样性。方法:
野外采集18个不同居群红景天样本,进行AFLP分析,用POPGENEv131(32bit)及SPSS软件分析处理数据。结果:从2套
AFLP酶切系统(EcoRI/MseI)中筛选9对引物组合中共扩增出238条谱带,其中228条呈现多态性。等位基因平均数(Na)为
14883,有效等位基因数(Ne)13907,Nei's基因多样性指数(H)02170,Shannon's信息指数(I)03108,多态性比率(P)为
5271%,居群间遗传分化系数(Gst)0364;用UPGMA聚类分析,可将18个居群分为2个大类群。第Ⅱ大类群由6个居群组
成,且均分布于海拔3175m以上;结论:海拔高度3150~3250m分布的红景天居群遗传变异最为丰富,无论就地还是迁地
保护该区域,对于拯救红景天种质资源都是非常重要的。
[关键词] 红景天;居群;遗传多样性;AFLP
[收稿日期] 20081208
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30470330,30770334)
[通信作者] 王强,Tel:(0574)88229545,Email:wangqiangsky@
263.net
景天科红景天属 RhodiolaL.植物为多年生草
本,民间多以其匍匐的根状茎作为药用。早在
1200年的藏医 《四部医典》中已将其作为 “神
药”。1596年李时珍 《本草纲目》中已记为 “景
天、上品、甘涩、寒、无毒、治肺疾”。全世界已
记录的红景天种有90个,全部分布在北半球高寒
地区[1]。我国有 73个种,2个亚种和 7个变种,
主要分布在新疆天山山脉、西藏昆仑山脉和东北等
生态环境相对严酷的高寒山区。红景天属植物进行
过化学成分研究及成分预试的种32个。从上述种
中已分离出9大类60多种化合物,即香豆素、黄
酮、苷类、生物碱、无机元素、氨基酸、纤维素、
淀粉和维生素。近年来药理学研究还发现了许多红
景天属植物的新作用机制,具有显著的抗衰老、抗
缺氧、抗不良刺激、抗病毒及肿瘤、抗疲劳和对机
体双向调节等作用,其中红景天苷是最主要的药理
学成分[2]。分布于西藏、四川的红景天属植物大
花红景天R.crenulata种被列入2005年版 《中国药
典》,红景天属植物根茎及提取物已被用作近 20
种中成药、食品和饮料的组方或添加剂[3]。据项
目研究小组野外实地调查及对西藏、新疆等红景天
属植物主要产地医药管理部门生药采购数据分析估
算,全国生药年需求量超过1000t[4]。作为高寒
山区极端脆弱草类藓类高山冻原植被和高山流石滩
植被类型的建群种,红景天属植物居群数量和遗传
多样性水平由于人为采挖、过度放牧以及自身生殖
生态学特性的影响已呈明显下降趋势,急待采取有
效措施对其进行科学保护。
本实验是针对红景天属植物定名种红景天
R.rosea的研究,该植物种在中国分布于新疆天
山山脉地区,垂直分布范围相对较广,从海拔
2000~3600m均可发现生长的踪迹。作者前
期研究发现,代表红景天属植物利用价值的主要
药理学成分红景天苷和苷元酪醇含量在该种中
最高,而毒理学成分百脉根苷含量较低,是已进
行过化学成分研究及成分预试的红景天属植物
中最具潜在利用和保护价值的种[5]。Kobayashi
等[6]研究了红景天 R.rosea根甲醇提取物对大
鼠血浆和消化道脂肪酶活性的抑制作用;El
ameen等[7]利用 AFLP分子标记技术分析了分布
于挪威的65个红景天 R.rosea种群内个体间遗
传分化与变异;本研究工作是在对其野外生境及
异质性特征作详细观察记录的基础上,用 2套
AFLP酶切系统(EcoRI/MseI)9对引物组合,对分
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布区内发现的6个相对独立生境上 18个居群样
本的基因组 DNA进行选择性扩增,以期揭示该
植物种种内遗传变异特征和物种最适生境,为制
定切实有效的保护措施和资源人工培育提供理
论依据。
1 材料与方法
1.1 材料 研究材料采自于中国新疆天山山脉,样
点分布及描述见表1。样品采集于2005年至2007
年9-10月。根据采集地生境特征和居群分布格
局,将分布区划分为6个独立生境,每个独立生境间
距离50km以上。根据山体地质特征、森林植被和
河流分布划分生境内居群,居群间距离 3~5km。
每个居群选择15株生长良好,无病虫害植株作为研
究样本,采样个体间距15~20m。样本植株上取幼
嫩叶片,硅胶干燥,液氮冷冻保存(Thermolyne10
L)。居群内独立保存15份样本,研究中对共18个
居群270份样本分别进行了 DNA提取、扩增分析。
每个样本设置3个重复。采集样本生物学鉴定由新
疆农业大学植物教研室杨昌友教授和王冰副教授
完成。
表1 18个红景天种群地理分布
生境 种群 地理位置 海拔/m 纬度N 经度E
A A1 新疆农业大学实习林场 2738 43°20′ 86°49′
A2 2795 43°20′ 86°52′
A3 2884 43°19′ 86°51′
B B1 天然林保护基地新疆巴克林场 2100 42°19′ 93°15′
B2 2357 42°19′ 93°14′
B3 2785 42°20′ 93°14′
C C1 天山1号冰川 3580 43°06′ 86°50′
C2 3419 43°08′ 86°51′
C3 3692 43°06′ 86°42′
D D1 天山天池 2751 43°22′ 90°10′
D2 2825 43°20′ 90°11′
D3 2935 43°21′ 90°14′
E E1 天然林保护基地新疆巩流林场 3428 43°14′ 82°40′
E2 3152 45°13′ 82°40′
E3 3507 45°16′ 82°39′
F F1 天山博格达峰 2911 44°35′ 83°21′
F2 2984 44°37′ 83°19′
F3 3024 44°39′ 83°21′
1.2 基因组 DNA提取与含量测定 基因组 DNA
提取方法见文献[8]。
1.3 AFLP分析 EcoRI和MseI限制性内切酶购自
MBI公司,T4DNA连接酶购自 Promega公司,接头,
引物,dNTP,TaqDNA聚合酶购自上海生工生物工程
技术服务有限公司。接头、引物碱基序列见表2。
表2 用于AFLP分析的接头与引物序列
名称 序列
EcoRIrecognitionsequence 5GAATTC3′
MseIrecognitionsequence 5′TTAA3′
EcoRIadaptor 5′CTCGTAGACTGCGTAGG3′,3′CATCTGACGCATGGTTAA5′
MseIadaptor 5′GACGATGAGTCCTGAG3′,3′TACTCAGGACTCAT5′
EcoRI+1primer 5′GACTGCGTACCAATTC3′
MseI+1primer 5′GATGAGTCCTGAGTAA3′
EcoRI+3/MseI+3primers E1+M1 5′GACTGCGTACCAATTCACA3′,5′GATGAGTCCTGAGTAACAA3′
E1+M2 5′GACTGCGTACCAATTCACA3′,5′GATGAGTCCTGAGTAACAC3′
E1+M3 5′GACTGCGTACCAATTCACA3′,5′GATGAGTCCTGAGTAACTT3′
E2+M1 5′GACTGCGTACCAATTCACC3′,5′GATGAGTCCTGAGTAACAA3′
E2+M2 5′GACTGCGTACCAATTCACC3′,5′GATGAGTCCTGAGTAACAC3′
E2+M3 5′GACTGCGTACCAATTCACC3′,5′GATGAGTCCTGAGTAACTT3′
E3+M1 5′GACTGCGTACCAATTCACG3′,5′GATGAGTCCTGAGTAACAA3′
E3+M2 5′GACTGCGTACCAATTCACG3′,5′GATGAGTCCTGAGTAACAC3′
E3+M3 5′GACTGCGTACCAATTCACG3′,5′GATGAGTCCTGAGTAACTT3′
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DNA双酶切、连接反应、DNA扩增、扩增产物分
离与检测方法见文献[8]。每对引物选择性扩增均
重复3次,以获得可重复数据。
1.4 数据分析 AFLP带为显性标记,电泳图谱中
特定Rf值位置出现条带设为(1),没有出现设为
(0),只选择在3次重复中均出现的带记录。其结
果为二进制矩阵,将其输入 POPGENEv131(32
bit)软件处理计算遗传多样性参数:等位基因平均
数Na(averagenumberofalelesperloci),有效等位
基因数Ne(efectivenumberofalelesperloci),Nei's
基因多样性指数 H(genediversity),Shannon's信息
指数I(Shannon'sinformationindex)和居群间遗传分
化系数(Gst)。
多态位点百分比 =(总谱带数 -共有带数)/总谱带
数×100%
居群间基因流Nm=(1/Gst-1)/4
SPSS100软件根据样本间遗传距离进行不加
权成对算术平均法(UPGMA)聚类分析,采用Mantel
检验。
2 结果分析
2.1 红景天居群遗传多样性分析 引物 EACC/
MCAA扩增红景天基因组 DNA获得的6%变性聚
丙烯酰胺凝胶电泳图,见图 1。研究中所选用的 9
对AFLP引物组合在18个居群中扩增出了清晰有
效、重复性好的238个条带,共有带10条,多态性比
率9561%。其中,引物7扩增出32个条带,引物
8,1,6分别扩增出30,29,28个条带,引物2,3扩增
出25个条带,引物4,5,9扩增出24个条带;扩增产
物大小介于200~1000bp。多数引物在供试样本
中没有获得共同谱带,只有引物9获得5条共同谱
带,引物1获得3条共同谱带,引物2,6获得1条共
同谱带。以居群内15个个体样本中均出现的条带
代表居群特征谱带用于分析。
POPGENEv131(32bit)软件进行居群间遗传
多样性分析结果见表3。18个居群中等位基因平均
数(Na)介于13900~16094,平均为14883;有
效等位基因数(Ne)介于13115~14860,平均为
13907;Nei's基因多样性指数(H)介于01721~
02694,平均为 02170;Shannon's信息指数(I)介
于02466~03919,平均为03108;多态位点百
分比P介于3888~6112,平均为5271;居群间遗
传分化系数(Gst)为0364,即636%的遗传变异发
字母为地区代号,含义同表1。
图1 AFLP扩增产物6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
(引物EACC/MCAA)
生在居群内;居群内基因流(Nm)值为0433;分布
于6个独立生境上的18个居群中,E生境3号居群
的遗传多样性水平最高,而 C生境2号居群的遗传
多样性水平最低。
2.2 红景天居群间 AFLP聚类分析 18个居群数
据两两相比,计算遗传距离和遗传一致性。基于遗
传距离的 UPGMA法居群间聚类分析结果见图 2。
居群间Nei氏无偏遗传距离最大为07472,发生在
C3和E2居群之间;最小为02199,发生在 B3和 D2
居群之间;遗传一致性指数在04737~08596变
化;结果还显示可将18个红景天居群划分为2个大
类。居群A3,C1,C2,C3,E3,F1聚成类群Ⅰ,其余12
个居群聚成类群Ⅱ。类群Ⅱ下又可聚成1个大亚类
群和1个单一居群构成的小亚类群。大亚类群由居
群A1,A2,B1,B2,B3,D1,D2,D3,E1,F2,F3聚成,小亚
类群由居群E2构成。
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表3 AFLP标记检测红景天遗传多样性水平
种群 Na Ne H I P/%
A1 15395(04995) 14316(03996) 02398(02220) 03434(03180) 5395
A2 15286(04855) 14210(03985) 02376(02170) 03102(03016) 5381
A3 15504(05135) 14422(04007) 02420(02270) 03766(03344) 5409
B1 14298(04961) 13439(03969) 01910(02205) 02736(03158) 4298
B2 14401(04987) 13511(03997) 02004(02300) 02841(03161) 4310
B3 14195(04980) 13367(03941) 01816(02110) 02631(03155) 4286
C1 13904(04889) 13123(03911) 01735(02173) 02485(03112) 3904
C2 13900(04881) 13115(03806) 01721(02100) 02466(03078) 3888
C3 13908(04897) 13131(04016) 01749(02246) 02504(03146) 3920
D1 14561(04992) 13649(03993) 02027(02219) 02903(03177) 4561
D2 14559(04991) 13645(03988) 02019(02210) 02887(03012) 4560
D3 14563(04993) 13653(03998) 02053(02280) 02919(03342) 4562
E1 16053(04899) 14842(03919) 02690(02177) 03853(03118) 6053
E2 16012(04844) 14824(03900) 02686(02112) 03787(03085) 5994
E3 16094(04954) 14860(03938) 02694(02242) 03919(03151) 6112
F1 15088(05010) 14070(04008) 02261(02227) 03238(03189) 5088
F2 15112(05132) 14103(04000) 02325(02301) 03301(03212) 5100
F3 15064(04888) 14037(04016) 02197(02153) 03175(03166) 5076
平均 14883(04958) 13907(03966) 02170(02203) 03108(03156) 5271
总计 19561(02052) 15835(03103) 03410(01420) 05095(01814) 9561
图2 基于AFLP标记红景天居群聚类图
3 讨论
3.1 AFLP标记显示的红景天遗传变异 遗传多样
性研究主要是根据遗传标记来进行,从19世纪孟德
尔用纯表现型性状分析遗传差异到今天多种多样的
分子手段,遗传多样性研究经历了从简单到复杂、从
宏观到微观、从定性到定量的发展过程。AFLP分
子标记技术结合了基于传统限制性内切酶酶切位点
特异性与PCR扩增引物序列识别专一性的优点,被
成功应用于多个植物种的遗传多样性和种间遗传关
系的分析研究[9]。本研究结果显示,9对 AFLP引
物组合在18个红景天居群中扩增出了清晰有效、重
复性好的 238个条带,多态性比率 9561%。从遗
传距离获得的聚类图显示,18个红景天种内居群间
的最大遗传差异在50%左右,AFLP指纹图谱数据
足以用于红景天种内分类、演化及其与地理分布间
关系的研究。
3.2 红景天居群遗传结构与分化 本研究以独立
生境为研究单元,Shannon多样性指数(I)和 Nei基
因多样性指数(H)变化趋势分析结果完全一致,即
研究单元间遗传多样性水平出现了E>A>F>D>
B>C的变化趋势。研究的红景天种在物种水平上
遗传多样性为 H=0341和 I=05095,而虞泓
等[10]用RAPD标记对大花红景天 R.crenulata和长
鞭红景天R.fastigiata研究获得的种内遗传多样性水
平分别为H=01614,I=02583和H=02068,I=
03139。与此相比可知,研究种的遗传多样性水平
在同属植物中较高。
Hamrick和 Godt[11]研究认为,地理变化与遗
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传多样性有相当大的关联,对于分布受到地理限
制的植物种类,个体间基因交流存在障碍,物种
遗传多样性水平一般较低。在研究的 6个生境
中,红景天遗传分化系数(Gst)0364,636%的
遗传变异发生在居群内,居群内个体间基因交流
相对较多,而居群间个体之间基因交流相对较
少。结合对表1,3数据的分析,可以看出分布于
独立生境 E上的 3个红景天居群海拔高度在 3
152~3228m,居群水平上遗传变异最为丰富,
是最具保护价值的红景天居群。分布于独立生
境 C 的 3 个 红 景 天 居 群 海 拔 高 度 在
3380~3692m,居群水平上遗传变异最低。对
于研究的红景天种来说,居群内遗传变异最为丰
富的区域在海拔高度 3150~3250m,种分布上
限在3700m。结合对表 1,图 2分析,可以看出,
构成类群Ⅰ的6个居群均分布在海拔3175m以
上,而类群Ⅱ中仅居群 E1分布于3175m以上。
3.3 基于遗传分析的保护策略 野外观察发
现,研究的红景天种居群数量呈明显下降趋势。
作者认为2个因素导致出现这种状况,一是由该
植物种自身生殖生理学特性所引起,另一是由生
境特征及其人为干扰所造成。就生殖生理学特
性而言,花粉表面光滑,几乎没有突起,只有一些
纵横交错的条纹,光滑的花粉不利于昆虫携带和
柱头接受,减少了受精的可能机会;花粉存在二
型性,圆形花粉可在药室内提前萌发,长形花粉
没有生活力,二种花粉均存在胚珠受精障碍;小
孢子发育过程中绒毡层细胞过迟解离,导致小孢
子发育期营养不良,使部分小孢子出现败育,降
低了可生育花粉的数量。就生境特征及其人为
干扰而言,研究种生长在高寒山区雪线以下,森
林上限以上风化很强的流石滩中,以高山为中心
被森林和河流相间隔的岛状分布区,属于极端脆
弱的草类藓类高山冻原植被和高山流石滩植被
生态系统,适宜生境面积小,空间上存在斑块性;
分布区土壤为酸性高山草甸土,pH5~6,土层薄
流沙和碎石多,种子落入土壤的概率小;分布区
内风大,海拔高,气温低,气候多变,不适宜传粉
昆虫生存,花粉受精率极低。红景天属植物主要
分布区在森林上限以上,林业和草原管理部门对
该类地区均疏于管理,夏秋季过渡放牧现象时有
发生,严重破坏红景天属植物居群生存状况。此
外,随着红景天属植物新药理作用的不断被发
现,外来采药人员对植物居群的破坏也越来越严
重[2]。
基于本研究结果,红景天居群内遗传变异高于
居群间遗传变异水平,居群间个体基因交流存在一
定障碍。红景天居群内仍以有性生殖方式繁衍为
主,营养生殖方式为辅。在对该红景天种迁地保护
构建种质资源库时,应尽可能多地收集不同生境的
种质资源,保存红景天种质资源遗传变异的基础;在
对该种植物就地保护时,应以海拔高度 3150~3
250m建立该植物种的核心保护区,可以对种质资
源起到更为有效的保护。此外,建议当地林业、草原
和环境管理部门加强保护宣传和行政管理,使红景
天这一具有重要药用和生态价值的植物资源能够被
可持续性的利用。
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RhodiolaroseabasedonAFLPmarkers
WANGQiang1,RUANXiao1,JIANGHao1,MENGQingwen1,WANGLihe2
(1.NingboInstituteofTechnologyZhejiangUniversity,Ningbo315100,China;
2.BeijingRhodiolaTechnologyDevelopmentCo.,Ltd.,Beijing100088,China)
[Abstract] Objective:ToresearchthegeneticdiversityofdiferentRhodiolaroseageographicalpopulationsinTianshanMoun
tain,China;Method:ThegeneticdiversityofeighteenR.roseageologicalpopulationsfromsixnicheswasestimatedusingamplified
fragmentlengthpolymorphism(AFLP)markers.ThedataofamplifiedbandswereanalyzedbythesoftwarePOPGENEv1.31(32bit)
andSPSS.Result:Thenineprimersemployedproducedatotalof238discernableandreproducibleamplifiedfragments.Therewere
228polymorphicbands.Thepercentageofpolymorphicbandswithindiferentpopulationswas95.6%.Geneticdiversityanalysis
showedthataveragenumberofalelesperlociwasNa=1.4883,efectivenumberofalelesperlociNe=1.3907,Nei'sgenediversity
indexH=0.2170,Shannon'sinformationindexI=0.3108,thepercentageofpolymorphiclociP=52.71,geneticdiferentiation
amongpopulationsGst=0.364;UPGMAclusteranalysisbasedongeneticdistancedatadividedeighteenpopulationsintotwoclusters:
ClusterⅠ composedoftwelvepopulationsandClusterⅡ6populationswhichdistributedinatitudeupper3175m;Conclusion:Our
researchessuggestthatthebestnicheofR.roseawasatatitudebetween31503250m;thisregionisimportantfortheconservation
ofR.roseagermplasmresource.
[Keywords] Rhodiolarosea;population;geneticdiversity;AFLP
[责任编辑 吕冬梅]
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第34卷第18期
2009年9月
Vol.34,Issue 18
September,2009