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Genetic diversity of different geographical populations of Rhodiola rosea based on AFLP markers

红景天Rhodiola rosea不同地理居群遗传多样性分析



全 文 :·研究论文·
红景天 Rhodiolarosea不同地理居群遗传多样性分析
王强1,阮晓1,江浩1,孟庆文1,王立和2
(1.浙江大学 宁波理工学院,浙江 宁波 315100;
2.北京红景天技术开发有限公司,北京 100088)
[摘要] 目的:研究分布于中国新疆天山地区红景天属植物定名种红景天Rhodiolarosea不同居群的遗传多样性。方法:
野外采集18个不同居群红景天样本,进行AFLP分析,用POPGENEv131(32bit)及SPSS软件分析处理数据。结果:从2套
AFLP酶切系统(EcoRI/MseI)中筛选9对引物组合中共扩增出238条谱带,其中228条呈现多态性。等位基因平均数(Na)为
14883,有效等位基因数(Ne)13907,Nei's基因多样性指数(H)02170,Shannon's信息指数(I)03108,多态性比率(P)为
5271%,居群间遗传分化系数(Gst)0364;用UPGMA聚类分析,可将18个居群分为2个大类群。第Ⅱ大类群由6个居群组
成,且均分布于海拔3175m以上;结论:海拔高度3150~3250m分布的红景天居群遗传变异最为丰富,无论就地还是迁地
保护该区域,对于拯救红景天种质资源都是非常重要的。
[关键词] 红景天;居群;遗传多样性;AFLP
[收稿日期] 20081208
[基金项目] 国家自然科学基金项目(30470330,30770334)
[通信作者] 王强,Tel:(0574)88229545,Email:wangqiangsky@
263.net
  景天科红景天属 RhodiolaL.植物为多年生草
本,民间多以其匍匐的根状茎作为药用。早在
1200年的藏医 《四部医典》中已将其作为 “神
药”。1596年李时珍 《本草纲目》中已记为 “景
天、上品、甘涩、寒、无毒、治肺疾”。全世界已
记录的红景天种有90个,全部分布在北半球高寒
地区[1]。我国有 73个种,2个亚种和 7个变种,
主要分布在新疆天山山脉、西藏昆仑山脉和东北等
生态环境相对严酷的高寒山区。红景天属植物进行
过化学成分研究及成分预试的种32个。从上述种
中已分离出9大类60多种化合物,即香豆素、黄
酮、苷类、生物碱、无机元素、氨基酸、纤维素、
淀粉和维生素。近年来药理学研究还发现了许多红
景天属植物的新作用机制,具有显著的抗衰老、抗
缺氧、抗不良刺激、抗病毒及肿瘤、抗疲劳和对机
体双向调节等作用,其中红景天苷是最主要的药理
学成分[2]。分布于西藏、四川的红景天属植物大
花红景天R.crenulata种被列入2005年版 《中国药
典》,红景天属植物根茎及提取物已被用作近 20
种中成药、食品和饮料的组方或添加剂[3]。据项
目研究小组野外实地调查及对西藏、新疆等红景天
属植物主要产地医药管理部门生药采购数据分析估
算,全国生药年需求量超过1000t[4]。作为高寒
山区极端脆弱草类藓类高山冻原植被和高山流石滩
植被类型的建群种,红景天属植物居群数量和遗传
多样性水平由于人为采挖、过度放牧以及自身生殖
生态学特性的影响已呈明显下降趋势,急待采取有
效措施对其进行科学保护。
本实验是针对红景天属植物定名种红景天
R.rosea的研究,该植物种在中国分布于新疆天
山山脉地区,垂直分布范围相对较广,从海拔
2000~3600m均可发现生长的踪迹。作者前
期研究发现,代表红景天属植物利用价值的主要
药理学成分红景天苷和苷元酪醇含量在该种中
最高,而毒理学成分百脉根苷含量较低,是已进
行过化学成分研究及成分预试的红景天属植物
中最具潜在利用和保护价值的种[5]。Kobayashi
等[6]研究了红景天 R.rosea根甲醇提取物对大
鼠血浆和消化道脂肪酶活性的抑制作用;El
ameen等[7]利用 AFLP分子标记技术分析了分布
于挪威的65个红景天 R.rosea种群内个体间遗
传分化与变异;本研究工作是在对其野外生境及
异质性特征作详细观察记录的基础上,用 2套
AFLP酶切系统(EcoRI/MseI)9对引物组合,对分
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布区内发现的6个相对独立生境上 18个居群样
本的基因组 DNA进行选择性扩增,以期揭示该
植物种种内遗传变异特征和物种最适生境,为制
定切实有效的保护措施和资源人工培育提供理
论依据。
1 材料与方法
1.1 材料 研究材料采自于中国新疆天山山脉,样
点分布及描述见表1。样品采集于2005年至2007
年9-10月。根据采集地生境特征和居群分布格
局,将分布区划分为6个独立生境,每个独立生境间
距离50km以上。根据山体地质特征、森林植被和
河流分布划分生境内居群,居群间距离 3~5km。
每个居群选择15株生长良好,无病虫害植株作为研
究样本,采样个体间距15~20m。样本植株上取幼
嫩叶片,硅胶干燥,液氮冷冻保存(Thermolyne10
L)。居群内独立保存15份样本,研究中对共18个
居群270份样本分别进行了 DNA提取、扩增分析。
每个样本设置3个重复。采集样本生物学鉴定由新
疆农业大学植物教研室杨昌友教授和王冰副教授
完成。
表1 18个红景天种群地理分布
生境 种群 地理位置 海拔/m 纬度N 经度E
A A1 新疆农业大学实习林场 2738 43°20′ 86°49′
  A2   2795 43°20′ 86°52′
  A3   2884 43°19′ 86°51′
B B1 天然林保护基地新疆巴克林场 2100 42°19′ 93°15′
  B2   2357 42°19′ 93°14′
  B3   2785 42°20′ 93°14′
C C1 天山1号冰川 3580 43°06′ 86°50′
  C2   3419 43°08′ 86°51′
  C3   3692 43°06′ 86°42′
D D1 天山天池 2751 43°22′ 90°10′
  D2   2825 43°20′ 90°11′
  D3   2935 43°21′ 90°14′
E E1 天然林保护基地新疆巩流林场 3428 43°14′ 82°40′
  E2   3152 45°13′ 82°40′
  E3   3507 45°16′ 82°39′
F F1 天山博格达峰 2911 44°35′ 83°21′
  F2   2984 44°37′ 83°19′
  F3   3024 44°39′ 83°21′
1.2 基因组 DNA提取与含量测定 基因组 DNA
提取方法见文献[8]。
1.3 AFLP分析 EcoRI和MseI限制性内切酶购自
MBI公司,T4DNA连接酶购自 Promega公司,接头,
引物,dNTP,TaqDNA聚合酶购自上海生工生物工程
技术服务有限公司。接头、引物碱基序列见表2。
表2 用于AFLP分析的接头与引物序列
名称 序列
EcoRIrecognitionsequence   5GAATTC3′
MseIrecognitionsequence   5′TTAA3′
EcoRIadaptor   5′CTCGTAGACTGCGTAGG3′,3′CATCTGACGCATGGTTAA5′
MseIadaptor   5′GACGATGAGTCCTGAG3′,3′TACTCAGGACTCAT5′
EcoRI+1primer   5′GACTGCGTACCAATTC3′
MseI+1primer   5′GATGAGTCCTGAGTAA3′
EcoRI+3/MseI+3primers E1+M1 5′GACTGCGTACCAATTCACA3′,5′GATGAGTCCTGAGTAACAA3′
  E1+M2 5′GACTGCGTACCAATTCACA3′,5′GATGAGTCCTGAGTAACAC3′
  E1+M3 5′GACTGCGTACCAATTCACA3′,5′GATGAGTCCTGAGTAACTT3′
  E2+M1 5′GACTGCGTACCAATTCACC3′,5′GATGAGTCCTGAGTAACAA3′
  E2+M2 5′GACTGCGTACCAATTCACC3′,5′GATGAGTCCTGAGTAACAC3′
  E2+M3 5′GACTGCGTACCAATTCACC3′,5′GATGAGTCCTGAGTAACTT3′
  E3+M1 5′GACTGCGTACCAATTCACG3′,5′GATGAGTCCTGAGTAACAA3′
  E3+M2 5′GACTGCGTACCAATTCACG3′,5′GATGAGTCCTGAGTAACAC3′
  E3+M3 5′GACTGCGTACCAATTCACG3′,5′GATGAGTCCTGAGTAACTT3′
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  DNA双酶切、连接反应、DNA扩增、扩增产物分
离与检测方法见文献[8]。每对引物选择性扩增均
重复3次,以获得可重复数据。
1.4 数据分析 AFLP带为显性标记,电泳图谱中
特定Rf值位置出现条带设为(1),没有出现设为
(0),只选择在3次重复中均出现的带记录。其结
果为二进制矩阵,将其输入 POPGENEv131(32
bit)软件处理计算遗传多样性参数:等位基因平均
数Na(averagenumberofalelesperloci),有效等位
基因数Ne(efectivenumberofalelesperloci),Nei's
基因多样性指数 H(genediversity),Shannon's信息
指数I(Shannon'sinformationindex)和居群间遗传分
化系数(Gst)。
多态位点百分比 =(总谱带数 -共有带数)/总谱带
数×100%
居群间基因流Nm=(1/Gst-1)/4
  SPSS100软件根据样本间遗传距离进行不加
权成对算术平均法(UPGMA)聚类分析,采用Mantel
检验。
2 结果分析
2.1 红景天居群遗传多样性分析 引物 EACC/
MCAA扩增红景天基因组 DNA获得的6%变性聚
丙烯酰胺凝胶电泳图,见图 1。研究中所选用的 9
对AFLP引物组合在18个居群中扩增出了清晰有
效、重复性好的238个条带,共有带10条,多态性比
率9561%。其中,引物7扩增出32个条带,引物
8,1,6分别扩增出30,29,28个条带,引物2,3扩增
出25个条带,引物4,5,9扩增出24个条带;扩增产
物大小介于200~1000bp。多数引物在供试样本
中没有获得共同谱带,只有引物9获得5条共同谱
带,引物1获得3条共同谱带,引物2,6获得1条共
同谱带。以居群内15个个体样本中均出现的条带
代表居群特征谱带用于分析。
POPGENEv131(32bit)软件进行居群间遗传
多样性分析结果见表3。18个居群中等位基因平均
数(Na)介于13900~16094,平均为14883;有
效等位基因数(Ne)介于13115~14860,平均为
13907;Nei's基因多样性指数(H)介于01721~
02694,平均为 02170;Shannon's信息指数(I)介
于02466~03919,平均为03108;多态位点百
分比P介于3888~6112,平均为5271;居群间遗
传分化系数(Gst)为0364,即636%的遗传变异发
  
字母为地区代号,含义同表1。
图1 AFLP扩增产物6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
(引物EACC/MCAA)
生在居群内;居群内基因流(Nm)值为0433;分布
于6个独立生境上的18个居群中,E生境3号居群
的遗传多样性水平最高,而 C生境2号居群的遗传
多样性水平最低。
2.2 红景天居群间 AFLP聚类分析 18个居群数
据两两相比,计算遗传距离和遗传一致性。基于遗
传距离的 UPGMA法居群间聚类分析结果见图 2。
居群间Nei氏无偏遗传距离最大为07472,发生在
C3和E2居群之间;最小为02199,发生在 B3和 D2
居群之间;遗传一致性指数在04737~08596变
化;结果还显示可将18个红景天居群划分为2个大
类。居群A3,C1,C2,C3,E3,F1聚成类群Ⅰ,其余12
个居群聚成类群Ⅱ。类群Ⅱ下又可聚成1个大亚类
群和1个单一居群构成的小亚类群。大亚类群由居
群A1,A2,B1,B2,B3,D1,D2,D3,E1,F2,F3聚成,小亚
类群由居群E2构成。
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表3 AFLP标记检测红景天遗传多样性水平
种群 Na Ne H I P/%
A1 15395(04995) 14316(03996) 02398(02220) 03434(03180) 5395
A2 15286(04855) 14210(03985) 02376(02170) 03102(03016) 5381
A3 15504(05135) 14422(04007) 02420(02270) 03766(03344) 5409
B1 14298(04961) 13439(03969) 01910(02205) 02736(03158) 4298
B2 14401(04987) 13511(03997) 02004(02300) 02841(03161) 4310
B3 14195(04980) 13367(03941) 01816(02110) 02631(03155) 4286
C1 13904(04889) 13123(03911) 01735(02173) 02485(03112) 3904
C2 13900(04881) 13115(03806) 01721(02100) 02466(03078) 3888
C3 13908(04897) 13131(04016) 01749(02246) 02504(03146) 3920
D1 14561(04992) 13649(03993) 02027(02219) 02903(03177) 4561
D2 14559(04991) 13645(03988) 02019(02210) 02887(03012) 4560
D3 14563(04993) 13653(03998) 02053(02280) 02919(03342) 4562
E1 16053(04899) 14842(03919) 02690(02177) 03853(03118) 6053
E2 16012(04844) 14824(03900) 02686(02112) 03787(03085) 5994
E3 16094(04954) 14860(03938) 02694(02242) 03919(03151) 6112
F1 15088(05010) 14070(04008) 02261(02227) 03238(03189) 5088
F2 15112(05132) 14103(04000) 02325(02301) 03301(03212) 5100
F3 15064(04888) 14037(04016) 02197(02153) 03175(03166) 5076
平均 14883(04958) 13907(03966) 02170(02203) 03108(03156) 5271
总计 19561(02052) 15835(03103) 03410(01420) 05095(01814) 9561
图2 基于AFLP标记红景天居群聚类图
3 讨论
3.1 AFLP标记显示的红景天遗传变异 遗传多样
性研究主要是根据遗传标记来进行,从19世纪孟德
尔用纯表现型性状分析遗传差异到今天多种多样的
分子手段,遗传多样性研究经历了从简单到复杂、从
宏观到微观、从定性到定量的发展过程。AFLP分
子标记技术结合了基于传统限制性内切酶酶切位点
特异性与PCR扩增引物序列识别专一性的优点,被
成功应用于多个植物种的遗传多样性和种间遗传关
系的分析研究[9]。本研究结果显示,9对 AFLP引
物组合在18个红景天居群中扩增出了清晰有效、重
复性好的 238个条带,多态性比率 9561%。从遗
传距离获得的聚类图显示,18个红景天种内居群间
的最大遗传差异在50%左右,AFLP指纹图谱数据
足以用于红景天种内分类、演化及其与地理分布间
关系的研究。
3.2 红景天居群遗传结构与分化 本研究以独立
生境为研究单元,Shannon多样性指数(I)和 Nei基
因多样性指数(H)变化趋势分析结果完全一致,即
研究单元间遗传多样性水平出现了E>A>F>D>
B>C的变化趋势。研究的红景天种在物种水平上
遗传多样性为 H=0341和 I=05095,而虞泓
等[10]用RAPD标记对大花红景天 R.crenulata和长
鞭红景天R.fastigiata研究获得的种内遗传多样性水
平分别为H=01614,I=02583和H=02068,I=
03139。与此相比可知,研究种的遗传多样性水平
在同属植物中较高。
Hamrick和 Godt[11]研究认为,地理变化与遗
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传多样性有相当大的关联,对于分布受到地理限
制的植物种类,个体间基因交流存在障碍,物种
遗传多样性水平一般较低。在研究的 6个生境
中,红景天遗传分化系数(Gst)0364,636%的
遗传变异发生在居群内,居群内个体间基因交流
相对较多,而居群间个体之间基因交流相对较
少。结合对表1,3数据的分析,可以看出分布于
独立生境 E上的 3个红景天居群海拔高度在 3
152~3228m,居群水平上遗传变异最为丰富,
是最具保护价值的红景天居群。分布于独立生
境 C 的 3 个 红 景 天 居 群 海 拔 高 度 在
3380~3692m,居群水平上遗传变异最低。对
于研究的红景天种来说,居群内遗传变异最为丰
富的区域在海拔高度 3150~3250m,种分布上
限在3700m。结合对表 1,图 2分析,可以看出,
构成类群Ⅰ的6个居群均分布在海拔3175m以
上,而类群Ⅱ中仅居群 E1分布于3175m以上。
3.3 基于遗传分析的保护策略 野外观察发
现,研究的红景天种居群数量呈明显下降趋势。
作者认为2个因素导致出现这种状况,一是由该
植物种自身生殖生理学特性所引起,另一是由生
境特征及其人为干扰所造成。就生殖生理学特
性而言,花粉表面光滑,几乎没有突起,只有一些
纵横交错的条纹,光滑的花粉不利于昆虫携带和
柱头接受,减少了受精的可能机会;花粉存在二
型性,圆形花粉可在药室内提前萌发,长形花粉
没有生活力,二种花粉均存在胚珠受精障碍;小
孢子发育过程中绒毡层细胞过迟解离,导致小孢
子发育期营养不良,使部分小孢子出现败育,降
低了可生育花粉的数量。就生境特征及其人为
干扰而言,研究种生长在高寒山区雪线以下,森
林上限以上风化很强的流石滩中,以高山为中心
被森林和河流相间隔的岛状分布区,属于极端脆
弱的草类藓类高山冻原植被和高山流石滩植被
生态系统,适宜生境面积小,空间上存在斑块性;
分布区土壤为酸性高山草甸土,pH5~6,土层薄
流沙和碎石多,种子落入土壤的概率小;分布区
内风大,海拔高,气温低,气候多变,不适宜传粉
昆虫生存,花粉受精率极低。红景天属植物主要
分布区在森林上限以上,林业和草原管理部门对
该类地区均疏于管理,夏秋季过渡放牧现象时有
发生,严重破坏红景天属植物居群生存状况。此
外,随着红景天属植物新药理作用的不断被发
现,外来采药人员对植物居群的破坏也越来越严
重[2]。
基于本研究结果,红景天居群内遗传变异高于
居群间遗传变异水平,居群间个体基因交流存在一
定障碍。红景天居群内仍以有性生殖方式繁衍为
主,营养生殖方式为辅。在对该红景天种迁地保护
构建种质资源库时,应尽可能多地收集不同生境的
种质资源,保存红景天种质资源遗传变异的基础;在
对该种植物就地保护时,应以海拔高度 3150~3
250m建立该植物种的核心保护区,可以对种质资
源起到更为有效的保护。此外,建议当地林业、草原
和环境管理部门加强保护宣传和行政管理,使红景
天这一具有重要药用和生态价值的植物资源能够被
可持续性的利用。
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第34卷第18期
2009年9月
                           
Vol.34,Issue 18
 September,2009
[11] HamrickJE,GodtMJ.Alozymediversityinplants
[M]//AHD,BrownMT,CleggAL.Plantpopula
tiongenetics,breedingandgeneticresources.New
York:HamrickChapman&Hal,1987:43.
Geneticdiversityofdiferentgeographicalpopulationsof
RhodiolaroseabasedonAFLPmarkers
WANGQiang1,RUANXiao1,JIANGHao1,MENGQingwen1,WANGLihe2
(1.NingboInstituteofTechnologyZhejiangUniversity,Ningbo315100,China;
2.BeijingRhodiolaTechnologyDevelopmentCo.,Ltd.,Beijing100088,China)
[Abstract] Objective:ToresearchthegeneticdiversityofdiferentRhodiolaroseageographicalpopulationsinTianshanMoun
tain,China;Method:ThegeneticdiversityofeighteenR.roseageologicalpopulationsfromsixnicheswasestimatedusingamplified
fragmentlengthpolymorphism(AFLP)markers.ThedataofamplifiedbandswereanalyzedbythesoftwarePOPGENEv1.31(32bit)
andSPSS.Result:Thenineprimersemployedproducedatotalof238discernableandreproducibleamplifiedfragments.Therewere
228polymorphicbands.Thepercentageofpolymorphicbandswithindiferentpopulationswas95.6%.Geneticdiversityanalysis
showedthataveragenumberofalelesperlociwasNa=1.4883,efectivenumberofalelesperlociNe=1.3907,Nei'sgenediversity
indexH=0.2170,Shannon'sinformationindexI=0.3108,thepercentageofpolymorphiclociP=52.71,geneticdiferentiation
amongpopulationsGst=0.364;UPGMAclusteranalysisbasedongeneticdistancedatadividedeighteenpopulationsintotwoclusters:
ClusterⅠ composedoftwelvepopulationsandClusterⅡ6populationswhichdistributedinatitudeupper3175m;Conclusion:Our
researchessuggestthatthebestnicheofR.roseawasatatitudebetween31503250m;thisregionisimportantfortheconservation
ofR.roseagermplasmresource.
[Keywords] Rhodiolarosea;population;geneticdiversity;AFLP
[责任编辑 吕冬梅]
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