全 文 ：ＨＰＬＣＥＬＳＤ法测定清开灵注射液中１９种氨基酸含量
白玉静，高晓燕，张宏桂，高凤阳，卢建秋
（北京中医药大学，北京 １００１０２）
［摘要］　目的：建立用高效液相蒸发光散射检测器（ＨＰＬＣＥＬＳＤ）测定清开灵注射液中氨基酸含量的方法，增加清开灵
注射液的质量控制指标。方法：ＰｒｅｖａｉｌＣ１８色谱柱（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）；流动相乙腈（Ａ）５０ｍｍｏｌ·Ｌ
－１七氟丁酸的
０５％三氟乙酸溶液（Ｂ），梯度洗脱；柱温２０℃；漂移管温度１２０℃；气体流量２６Ｌ·ｍｉｎ－１。结果：此法可对清开灵注射液中
的１９种氨基酸进行含量测定。结论：该法不需要对氨基酸进行衍生，操作简便、灵敏度高、结果准确可靠。
［关键词］　ＨＰＬＣＥＬＳＤ；清开灵注射液；氨基酸
［收稿日期］　２００９１０１５
［基金项目］　中药注射剂安全性研究技术平台建设项目
［通信作者］　 卢建秋，Ｔｅｌ：（０１０）８４７３６４０７，Ｅｍａｉｌ：ｌｕｊｑ＠
ｖｉｐｓｉｎａｃｏｍ
　　清开灵注射液是由古方安宫牛黄丸通过拆方改
制而成的一种中药注射剂，具有清热解毒，镇静安神
的功效。处方由板蓝根、金银花、栀子、珍珠母、水牛
角、胆酸、猪去氧胆酸和黄芩苷等８味药组成，其中
水牛角为方中臣药，珍珠母为方中使药。在清开灵
注射液的生产中，水牛角和珍珠母分别提取后以混
合水解液的形式入药，板蓝根以水提液的形式入药。
水牛角经水解后生成１７种氨基酸，珍珠母水解后生
成１７～１９种氨基酸［１］。对清开灵注射液中氨基酸
的测定，大多采用的是氨基酸自动分析仪。其价格
昂贵，难以得到广泛应用［２］；清开灵注射液中已明
确含量成分占总固体量的２４１％，还有大量氨基酸
类成分没有进行明确的质量控制，为了使清开灵注
射液的质量更加可控，本研究在鄢丹等［３］的基础上
对色谱条件进行优化，将测定的氨基酸的种类提高
至１９种，尝试用 ＨＰＬＣＥＬＳＤ法对清开灵注射液中
的１９种未衍生氨基酸直接进行测定。该法快速、简
单，结果令人满意。
１　材料
Ａｇｉｌｅｎｔ１１００型 高 效 液 相 色 谱 仪，Ａｌｔｅｃｈ
２０００ＥＳ蒸发光检测器。氨基酸对照品（美国 Ｓｉｇｍａ
公司，批号 ＬＯ７９１Ｈ０７６２）：甘氨酸（Ｇｌｙ）、丝氨酸
（Ｓｅｒ）、天门冬氨酸（Ａｓｐ）、胱氨酸（Ｃｌｙ）、丙氨酸
（Ａｌａ）、苏氨酸（Ｔｈｒ）、鸟氨酸（Ｏｒｎ）、谷氨酸（Ｇｌｕ）、
γ氨基丁酸（γＡｂａ）、赖氨酸（Ｌｙｓ）、组氨酸（Ｈｉｓ）、
精氨酸（Ａｒｇ）、脯氨酸（Ｐｒｏ）、缬氨酸（Ｖａｌ）、甲硫氨
酸（Ｍｅｔ）、酪氨酸（Ｔｙｒ）、异亮氨酸（Ｉｌｅ）、亮氨酸
（Ｌｅｕ）、苯丙氨酸（Ｐｈｅ），纯度均大于 ９９０％，三氟
乙酸、七氟丁酸均为分析纯，乙腈为色谱纯（美国
Ｆｉｓｈｅｒ公司），水为重蒸水。清开灵注射液（北京中
医药大学药厂生产，批号 ９１１９０４Ａ，９１２００５Ａ，
９１２１０２Ａ）。
２　方法
２１　色谱条件
ＰｒｅｖａｉｌＣ１８色谱柱（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）；流
动相乙腈（Ａ）５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１七氟丁酸的０５％三
氟乙酸溶液（Ｂ），梯度洗脱：０～１５ｍｉｎＡＢ（０∶
１００），１５～３０ｍｉｎＡＢ（１５∶８５）；流速 ０６ｍＬ·
ｍｉｎ－１；柱温 ２０℃；漂移管温度 １２０℃；气体流量
２６Ｌ·ｍｉｎ－１；进样量１０μＬ。
２２　混合对照品溶液的制备
精密称取１９种氨基酸对照品各适量置于同一
量瓶中，用００２ｍｏｌ·Ｌ－１盐酸溶解配置成质量浓度
各约为０６ｇ·Ｌ－１对照品混合溶液。
２３　游离氨基酸样品的制备
精密量取清开灵注射液４ｍＬ，置于锥形瓶中，
加入２ｍＬ磺基水杨酸摇匀，过滤，弃去初滤液，准确
量取续滤液１ｍＬ置于２５ｍＬ的量瓶中，加水稀释至
刻度，备用。
２４　水解氨基酸样品的制备
精密量取清开灵注射液１ｍＬ置于水解管中，加
入６ｍｏｌ·Ｌ－１盐酸１０ｍＬ，水解管中充满氮气后立
即密封，于１１０℃烘箱中水解２２ｈ，取出放冷，过滤，
挥干溶剂，少量蒸馏水溶解后，蒸干，以除去残存的
盐酸。残渣用００２ｍｏｌ·Ｌ－１盐酸溶解定容至刻度。
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第３４卷第２４期
２００９年１２月
　　　　　 　 　 　 　 　　　　　 　 　 　 　
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２５　方法学考察
２５１　线性关系及检测限　分别精密吸取对照品
混合溶液２，５，１０，１５，２０，２５，３０，５０ｍＬ注入液相色
谱仪，以各种氨基酸峰面积对数值 Ｙ为纵坐标，氨
基酸进样量对数值 Ｘ为横坐标，得线性回归方程见
表１。在线性范围内，各种氨基酸的进样量对数值
与峰面积的对数值呈现良好的线性关系。当信噪比
为３时，测定各种氨基酸的检测限在 ５５～１７０
μｇ·Ｌ－１。
表１　１９种氨基酸线性方程
Ｎｏ 成分 线性方程 ｒ
１ 甘氨酸（Ｇｌｙ） Ｙ＝５．８３１１Ｘ－０．３１９２ ０．９９９５
２ 丝氨酸（Ｓｅｒ） Ｙ＝５．１７２５Ｘ＋０．４４０６ ０．９９９４
３ 天门冬氨酸（Ａｓｐ） Ｙ＝６．１０５６Ｘ＋０．４９３６ ０．９９９３
４ 胱氨酸（Ｃｌｙ） Ｙ＝５．４６２４Ｘ＋１．５３４１ ０．９９９３
５ 苏氨酸（Ｔｈｒ） Ｙ＝４．３７８１Ｘ＋２．４７３１ ０．９９９４
６ 丙氨酸（Ａｌａ） Ｙ＝６．５０５Ｘ＋０．９８９３ ０．９９９５
７ 鸟氨酸（Ｏｒｎ） Ｙ＝５．２３Ｘ＋１．４９２６ ０．９９９３
８ 谷氨酸（Ｇｌｕ） Ｙ＝４．４８９２Ｘ＋２．９８８９ ０．９９９３
９ γ氨基丁酸（γＡｂａ） Ｙ＝４．６９０１Ｘ＋１．８２６２ ０．９９９４
１０ 赖氨酸（Ｌｙｓ） Ｙ＝５．６３７７Ｘ＋１．０２１１ ０．９９９８
１１ 组氨酸（Ｈｉｓ） Ｙ＝６．４６４８Ｘ＋０．４８８３ ０．９９９５
１２ 精氨酸（Ａｒｇ） Ｙ＝５．２３７３Ｘ＋１．４０４８ ０．９９９４
１３ 脯氨酸（Ｐｒｏ） Ｙ＝３．７６４Ｘ＋０．６４２８ ０．９９９３
１４ 缬氨酸（Ｖａｌ） Ｙ＝５．３０７９Ｘ＋１．３３５３ ０．９９９６
１５ 甲硫氨酸（Ｍｅｔ） Ｙ＝６．５１１５Ｘ＋０．４０８１ ０．９９９５
１６ 酪氨酸（Ｔｙｒ） Ｙ＝５．５３５６Ｘ＋０．７８３４ ０．９９９４
１７ 异亮氨酸（Ｉｌｅ） Ｙ＝４．０２６４Ｘ＋２．２４１９ ０．９９９０
１８ 亮氨酸（Ｌｅｕ） Ｙ＝５．４９１８Ｘ＋１．９７５８ ０．９９９３
１９ 苯丙氨酸（Ｐｈｅ） Ｙ＝５．３６７２Ｘ＋１．３６８１ ０．９９９２
２５２　精密度试验　按２１色谱条件下，精密吸取
对照品混合溶液１０μＬ，连续进样５次，测定。峰面
积的ＲＳＤ在００２％～１１％，说明本法精密度良好。
２５３　重复性试验　取同一批样品按供试品溶液
制备方法平行制备５份，分别进样１０μＬ，测得峰面
积的ＲＳＤ在０１４％～２４０％。
２５４　供试品溶液稳定性　按２１色谱条件下，取
同一供试品溶液，分别于０，２，４，８，１２，２４ｈ进样５
次，测得 ＲＳＤ在００４％ ～１７％，说明样品在２４ｈ
内稳定。
２５５　回收率试验　精密量取已知含量的清开灵
注射液（批号９１１９０４Ａ）１０ｍＬ置于锥形瓶中，加入
与之含量相当的氨基酸对照品混合溶液，按供试品
溶液制备方法操作后，测定，计算，结果平均回收率
为９１２％～１０２２％，ＲＳＤ为０８１％～３０％。
３　样品测定
按２１色谱条件下，精密量取３批清开灵注射
液分别制备游离氨基酸样品和水解氨基酸样品进行
含量测定。计算其含量及 ＲＳＤ。结果 ＲＳＤ为
０２２％～３５％，结果见图１，２及表２。
１甘氨酸（Ｇｌｙ）；２丝氨酸（Ｓｅｒ）；３天门冬氨酸（Ａｓｐ）；４胱氨
酸（Ｃｌｙ）；５苏氨酸（Ｔｈｒ）；６丙氨酸（Ａｌａ）；７鸟氨酸（Ｏｒｎ）；８
谷氨酸（Ｇｌｕ）；９γ氨基丁酸（γＡｂａ）；１０赖氨酸（Ｌｙｓ）；１１组
氨酸（Ｈｉｓ）；１２精氨酸（Ａｒｇ）；１３脯氨酸（Ｐｒｏ）；１４缬氨酸
（Ｖａｌ）；１５甲硫氨酸（Ｍｅｔ）；１６酪氨酸（Ｔｙｒ）；１７异亮氨酸
（Ｉｌｅ）；１８亮氨酸（Ｌｅｕ）；１９苯丙氨酸（Ｐｈｅ）（图２同）。
图１　氨基酸对照品色谱图
图２　清开灵注射液样品色谱图
４　讨论
蒸发光散射检测器的漂移管温度和气体流量是
影响检测结果的重要参数。研究中分别考察了漂移
管温度１１０，１１５，１２０℃，气体流量２５，２６，３２Ｌ·
ｍｉｎ－１，结果表明，在漂移管温度 １２０℃、气体流量
２６Ｌ·ｍｉｎ－１时，基线平稳，噪音较小［４］。
本研究考察了不同的水解条件：盐酸浓度５，
６，７ｍｏｌ·Ｌ－１；水解时间 ２２，２４，３６ｈ。结果表
明，盐酸浓度６ｍｏｌ·Ｌ－１、水解时间 ２２ｈ为最佳
水解条件。
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表２　清开灵样品含量测定
Ｎｏ 成分
平均质量浓度／ｇ·Ｌ－１
游离氨基酸 水解氨基酸
１ 甘氨酸（Ｇｌｙ） ０．２４ １．３１
２ 丝氨酸（Ｓｅｒ） ０．３１ ０．３２
３ 天门冬氨酸（Ａｓｐ） ０．６３ ０．８３
４ 胱氨酸（Ｃｌｙ） ０．１６ ０．１６３
５ 苏氨酸（Ｔｈｒ） ０．１２ ０．１１８
６ 丙氨酸（Ａｌａ） ０．３７ １．４８
７ 鸟氨酸（Ｏｒｎ） ０．４０ ０．５３
８ 谷氨酸（Ｇｌｕ） ２．３４ ２．８４
９ γ氨基丁酸（γＡｂａ） ０．２０ ０．２２
１０ 赖氨酸（Ｌｙｓ） ０．３５ ０．５５
１１ 组氨酸（Ｈｉｓ） ０．０３７ ０．０４１
１２ 精氨酸（Ａｒｇ） ０．３０ ０．３５
１３ 脯氨酸（Ｐｒｏ） ２．２８ ２．６３
１４ 缬氨酸（Ｖａｌ） ０．５４ １．３２
１５ 甲硫氨酸（Ｍｅｔ） ０．２４ ０．１１９
１６ 酪氨酸（Ｔｙｒ） ０．６１ ０．６２
１７ 异亮氨酸（Ｉｌｅ） ０．４２ ０．６３
１８ 亮氨酸（Ｌｅｕ） １．３３ １．７０
１９ 苯丙氨酸（Ｐｈｅ） １．０３ １．１２
总质量浓度 １１．９０７ １６．８９１
　　实验结果表明，结合氨基酸存在于清开灵注射
液中，其总质量浓度为４９８４ｇ·Ｌ－１。清开灵注射
液的不良反应以过敏反应最为明显，这种异体蛋白
的存在可能和其有关，本实验的研究可为此提供基
础。
本研究首次采用 ＨＰＬＣＥＬＳＤ法将清开灵注射
液中的１９种氨基酸进行分离测定，此法不需要对氨
基酸进行衍生，省去了衍生反应所需要的繁琐步骤，
操作简便，结果准确、可靠。
［参考文献］
［１］　高晓燕，范强，李娜，等．清开灵注射剂及其生产过程各中间体
中氮的存在形式及含量［Ｊ］．中国中药杂志，２００８，３３（１４）：
１６７３．
［２］　陈鼎雄，林立．ＨＰＬＣＥＬＳＤ法测定复方氨基酸注射液（３ＡＡ）
中三组分的含量［Ｊ］．药物分析杂志，２００７，２７（１０）：１６４９．
［３］　鄢丹，张毅，韩玉梅，等．ＨＰＬＣＥＬＳＤ法测定疏血通注射液中
１７种未衍生氨基酸含量［Ｊ］．药物分析杂志，２００７，２７（４）：
５５８．
［４］　ＤａｎＹ，ＧｕｏＬ，ＸｉａｏＨＸ，ｅｔａｌ．Ｄｉｒｅｃｔｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｆｏｕｒｔｅｅｎ
ｕｎｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｆｒｏｍＷｈｉｔｍａｎｉａｐｉｇｒａｂｙｕｓｉｎｇｌｉｑｕｉｄ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅｌｉｇｈｔｓｃａｔｅｒｉｎｇｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪＣｈｒｏ
ｍａｔｏｇｒＡ，２００７，１１３８：３０１．
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