全 文 ：三七总皂苷合用黄芪总皂苷对 ＭＣＡＯ再灌注大鼠
脑组织 ＮＦκＢ表达的抑制作用
任周新１，孙建宁２，罗永明３，赵辉２，钟静２，王斌２
（１．河南中医学院，河南 郑州 ４５０００８；
２．北京中医药大学，北京 １００１０２；３．江西中医学院，江西 南昌 ３３０００４）
［摘要］ 目的：研究三七总皂苷（ＰＮＳ）合用黄芪总皂苷（ＴＳＡ）对大鼠大脑中动脉阻塞模型（ＭＣＡＯ）脑组织ＮＦκＢ，ＩκＢα
表达的影响。方法：制作ＭＣＡＯ再灌注大鼠模型，分别在缺血２ｈ、再灌注１４ｈ腹腔注射三七总皂苷（ＰＮＳ）８０ｍｇ·ｋｇ－１，ＰＮＳ
ＴＳＡ５６ｍｇ·ｋｇ－１和１１２ｍｇ·ｋｇ－１，再灌注２２ｈ，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ半定量检测缺血脑组织中ＩκＢα，ｐＩκＢα，免疫组化法检测ＮＦκＢ
的表达。结果：与假手术组比较，模型组缺血区皮层ＮＦκＢ免疫反应阳性颗粒在细胞中大量表达，在细胞核中也表达广泛，阳
性表达面积、累积吸光度明显增加（Ｐ＜００１）。与模型组比较，ＰＮＳＴＳＡ５６，１１２ｍｇ·ｋｇ－１组和ＰＮＳ组ＮＦκＢ免疫反应阳性表
达物多在胞浆，阳性表达面积、累积吸光度明显降低（Ｐ＜００１）。ＰＮＳＴＳＡ５６ｍｇ·ｋｇ－１组与ＰＮＳ组比较，阳性表达面积、累积
吸光度明显降低（Ｐ＜００５或００１）。与假手术组比较，模型组脑组织中 ｐＩκＢα蛋白表达量显著增加（Ｐ＜００１），ＩκＢα蛋白
表达量显著减少（Ｐ＜００１）；与模型组比较，ＰＮＳＴＳＡ５６，１１２ｍｇ·ｋｇ－１组和 ＰＮＳ组 ｐＩκＢα蛋白表达量显著降低（Ｐ＜００５～
００１），而ＩκＢα蛋白表达量显著增加（Ｐ＜００１）。结论：ＰＮＳ能抑制缺血再灌注脑组织中 ＮＦκＢ的活化，该作用与其抑制
ＩκＢα的磷酸化有关；ＰＮＳ合用ＴＳＡ后，抑制ＮＦκＢ活化的作用增强。
［关键词］ 三七总皂苷合用黄芪总皂苷；脑缺血再灌注；核因子κＢ；κＢ抑制物；磷酸化κＢ抑制物
［收稿日期］ ２００８１１２０
［通信作者］ 罗永明，Ｔｅｌ：（０７９１）７１１８８５０，Ｅｍａｉｌ：ｌｏｙｍ＠ｔｏｍ．ｃｏｍ
［作者简介］ 任周新，Ｔｅｌ：（０３７１）６５６８０６１７，Ｅｍａｉｌ：ｒｅｎｚｈｏｕｘｉｎ１２３＠
１２６．ｃｏｍ
作者前期的研究发现，三七总皂苷（ｔｏｔａｌｓａｐｏ
ｎｉｎｓｏｆＰａｎａｘｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ，ＰＮＳ）与黄芪总皂苷（ｔｏｔａｌ
ｓａｐｏｎｉｎｓｏｆＡｓｔｒａｇａｌｕｓ，ＴＳＡ）合用（ＰＮＳＴＳＡ），抑制
大脑中动脉阻塞（ｍｉｄｄｌｅｃｅｒｅｂｒａｌａｒｔｅｒｙｏｃｃｌｕｓｉｏｎ，
ＭＣＡＯ）再灌注大鼠脑组织损伤，具有协同作用［１］，
尚需要对其作用机制进行探讨。近年来，核因子κＢ
（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｋａｐｐａＢ，ＮＦκＢ）信号通路激活在缺
血性脑中风中的作用，倍受关注。有研究表明，ＰＮＳ
能抑制中性粒细胞内ＮＦκＢ的活化，减少细胞间黏
附分子表达及中性粒细胞黏附而起到心肌保护的作
用［２］；ＴＳＡ中的重要组成成分黄芪甲苷能显著抑制
缺氧／复氧引起的血管内皮细胞 ＮＦκＢ表达，对缺
氧／复氧损伤的血管内皮细胞具有保护作用［３］。作
者推测ＰＮＳ，ＰＮＳＴＳＡ可能具有抑制ＭＣＡＯ再灌注
大鼠脑组织 ＮＦκＢ的活化的作用。本研究探讨了
ＰＮＳ以及 ＰＮＳＴＳＡ对 ＭＣＡＯ再灌注大鼠脑组织
ＮＦκＢ，ＩκＢα表达的影响，通过比较 ＰＮＳ与 ＰＮＳ
ＴＳＡ的差异性，进一步探索 ＰＮＳＴＳＡ合用的协同作
用机制。
１ 材料
１．１ 动物
ＳＤ大鼠，雄性，（２９０±５）ｇ，清洁级，维通利华
实验动物技术有限公司提供。动物许可证号 ＳＣＸＫ
（京）２００２００３。
１．２ 药物
三七药材购自江西省樟树市医药公司、黄芪药
材购自江西省南昌市医药公司，分别经江西中医学
院药学院赖学文副教授鉴定为五加科植物三七 Ｐａ
ｎａｘｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ（Ｂｕｒｋ．）Ｆ．Ｈ．Ｃｈｅｎ的干燥根和豆
科植物蒙古黄芪 ＡｓｔｒａｇａｌｕｓｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓＢｇｅ．ｖａｒ．
ｍｏｎｇｈｏｌｉｃｕｓ（Ｂｇｅ．）Ｈｓｉａｏ（Ａ．ｍｏｎｇｈｏｌｉｃｕｓＢｇｅ．）的
干燥根。采用大孔吸附树脂法分别制备三七总皂
苷、黄芪总皂苷，为易吸湿的淡黄色粉末，皂苷含量
分别为 ８７５％，７３８％。江西中医学院药学系提
供。临用前用生理盐水稀释、溶解。
１．３ 试剂
ＳＰ９００１ＨｉｓｔｏｓｔａｉｎＴＭＰｌｕｓＫｉｔｓ，ＺＹＭＥＤ公司；
ＮＦκＢ多克隆抗体 ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司产品；ＩκＢα多克
隆抗体，ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司产品；ｐＩκＢα多克隆抗体，
ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司产品；βａｃｔｉｎ内参，ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司
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产品；ＥＣＬ显色剂，Ａｍｅｒｓｈａｍ公司产品；辣根酶标记
山羊抗兔ＩｇＧ，中山金桥生物公司产品。
１．４ 仪器
ＭＵＬＴＩＳＫＡＮＭＫ３酶标仪（Ｔｈｅｒｍｏ）；ＬＧＲ１０
４２型离心机（北京医用离心机厂）；ＡＬ１０４电子天
平（ＭｅｔｌｅｒＴｏｌｅｄｏ公司）；ＴＹ２０型脱色摇床（上海
西巴斯生物技术有限公司）；ｅｃｌｉｐｓｅＴＥ２０００Ｕ荧光
显微镜（Ｎｉｋｏｎ公司）；垂直电泳槽（大连竞迈生物技
术公司）；转移电泳槽（大连竞迈生物技术公司）；
ＣＪ１Ｓ超净工作台（泰斯特仪器有限公司）。
２ 方法
２．１ 模型制作
根据Ｌｏｎｇａ方法制作鼠右侧大脑中动脉阻塞再
灌注模型［４］。手术前夜禁食不禁水。１０％水合氯
醛３ｍＬ·ｋｇ－１腹腔注射麻醉大鼠，仰卧固定，颈部
正中切开，逐层分离组织，暴露右侧颈总动脉（ｃｏｍ
ｍｏｎｃａｒｏｔｉｄａｒｔｅｒｙ，ＣＣＡ）、颈外动脉（ｅｘｔｅｒｎａｌｃａｒｏｔｉｄ
ａｒｔｅｒｙ，ＥＣＡ）、颈内动脉 （ｉｎｔｅｒｎａｌｃａｒｏｔｉｄａｒｔｅｒｙ，
ＩＣＡ），永久结扎 ＣＣＡ近心端、ＥＣＡ根部，微动脉夹
暂时夹闭ＣＣＡ的远心端，在 ＣＣＡ结扎处远心端剪
一斜口，插入顶端成球面的尼龙线，经 ＣＣＡ分叉处
通过ＩＣＡ入颅至大脑前动脉的起始部，从而闭塞大
脑中动脉（ｍｉｄｄｌｅｃｅｒｅｂｒａｌａｒｔｅｒｙ，ＭＣＡ）的起始部，造
成了ＭＣＡ供血相关区的梗死。尼龙线插入深度为
２０ｍｍ，结扎 ＣＣＡ远心端以固定尼龙线和防止出
血，逐层缝合，尼龙线末端暴露在体外。栓塞 ２ｈ
后，拔出尼龙线，实施再灌注。假手术组除插线１０
ｍｍ外，其余步骤同模型组。
２．２ 分组和给药
再灌注２ｈ后观察模型动物的神经功能缺失症
状。评分参照 Ｌｏｎｇａ等的方法［４］，提起鼠尾离开地
面，观察两前肢的伸展状况；然后置于地面，观察其
行走情况；采用５级评分（０～４分）标准，分数越高，
说明其神经行为损伤越重。０分，行为完全正常，步
态平稳，无神经缺损症状；１分，不能完全伸展对侧
前爪；２分，行走时向左侧转圈，成追尾状；３分，站立
不稳，向对侧倾倒；４分，不能自发行走，意识丧失。
评分在１～３分的大鼠认为模型制作成功，纳入实验
分组。实验过程中，因手术、麻醉意外等原因死亡，
出血较多，取脑时发现蛛网膜下腔出血、术后存活时
间未达取材时间要求以及再灌注时未苏醒的动物均
剔除。共分成５组，假手术组、模型组、ＰＮＳ８０ｍｇ·
ｋｇ－１组、ＰＮＳＴＳＡ５６ｍｇ·ｋｇ－１组（ＰＮＳ４０ｍｇ·
ｋｇ－１，ＴＳＡ１６ｍｇ·ｋｇ－１）、ＰＮＳＴＳＡ１１２ｍｇ·ｋｇ－１组
（ＰＮＳ８０ｍｇ·ｋｇ－１，ＴＳＡ３２ｍｇ·ｋｇ－１）。立即腹腔
注射药物，再灌注 １４ｈ后，再次腹腔注射药物，模型
组和假手术组注射等容量生理盐水，给药体积
５ｍＬ·ｋｇ－１。
２．３ 取材
手术后２４ｈ，每组各５只，麻醉后，常规胸腹联
合切口，经左心室插管，分别用生理盐水、４％多聚
甲醛的０１ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸盐缓冲液灌注固定，取出
大脑，冠状切取距离额极２～６ｍｍ的脑组织，放入
４％多聚甲醛溶液后固定，备测免疫组化。另取大
鼠，手术后 ２４ｈ，断头，在冰浴上取脑，无菌条件下４
℃生理盐水漂洗，去除血迹，去除小脑、嗅球和低位
脑干，沿大脑纵裂切开，取右脑，无菌条件下冠状切
取距离额２～６ｍｍ的脑组织，迅速置于已编号的冻
存管中，在液氮中保存备用，测量ＩκＢα，ｐＩκＢα。
２．４ ＮＦκＢｐ６５免疫组化测定
２．４．１ ＮＦκＢｐ６５免疫组织化学染色 取出固定的
脑组织，常规石蜡包埋，自视交叉处连续冠状切片，
片厚４μｍ，置烤箱６０℃过夜，４℃保存备用。采用
ＳＡＢＣ免疫组织化学染色法分别进行染色：切片常
规脱蜡，３％Ｈ２Ｏ２溶液室温处理１０ｍｉｎ，蒸馏水冲洗
３次；切片浸入００１ｍｏｌ·Ｌ－１枸椽酸盐缓冲液 ＰＢＳ
浸泡５ｍｉｎ，高压锅加热２ｍｉｎ，冷却，ＰＢＳ中清洗３
次；室温孵育１５ｍｉｎ；滴加１∶１００比例稀释的一抗，４
℃过夜，ＰＢＳ冲洗２ｍｉｎ×３次；滴加生物素标记山
羊抗兔ＩｇＧ，３７℃孵育 ２０ｍｉｎ，ＰＢＳ冲洗 ３ｍｉｎ×３
次；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液（ＳＡ／
ＨＲＰ），３７℃孵育 １５ｍｉｎ，ＰＢＳ冲洗 ３ｍｉｎ×３次；
ＤＡＢ显色；蒸馏水洗涤终止显色，苏木素复染、脱
水、透明、封片。所有免疫组化反应均设阴性对照，
方法为用ＰＢＳ代替一抗，其余步骤同上。
２．４．２ 图像半定量分析 采用 ＩｍａｇｅＰｒｏＰｌｕｓ５０
高清晰度彩色病理图像系统对切片进行分析。选择
目镜５倍、物镜４０倍，分别在颞叶皮层的缺血区域，
选取面积相等的 ３个视野，测量、统计每个视野的
Ｐｏｓｉｔｉｖｅａｒｅａ和Ｉｎｔｅｇｒａｌｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ。
２．５ 对ＩκＢα蛋白表达的影响
将取好的大脑皮层组织置于１ｍＬ细胞裂解液
中，低温匀浆。１万ｒ·ｍｉｎ－１４℃离心１０ｍｉｎ，取上
清，－８０℃冰箱保存。取１μＬ上清液，ＢＣＡ法测蛋
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白含量，用细胞裂解液将上样蛋白浓度调成一致。
样品按３∶１加入５×上样缓冲液，混匀后沸水中５
ｍｉｎ变性。配制６％分离胶注入准备到玻璃板间隙
中，加入适量蒸馏水覆盖，配制浓缩胶，注入分离胶
上端，插入梳子。将玻璃板安装至电泳槽中，加入
ｌ×电极缓冲液，按 Ｍａｒｋｅｒ样品次序上样，电泳。将
电泳完毕的凝胶取出，洗去胶上的 ＳＤＳ等离子。根
据电泳后蛋白 Ｍａｒｋｅｒ的位置，裁剪所需目的蛋白、
内参对应的膜。以 ＴＢＳＴ洗膜１０ｍｉｎ。把硝酸纤维
素膜加入封闭液中置常温摇动。按每平方厘米膜加
０１ｍＬ一抗溶液（ＩκＢα稀释度为１∶６００，５％脱脂牛
奶溶于ＴＢＳＴ中），混匀后装入袋中，４℃过夜。弃去
反应液，ＴＢＳＴ洗３次，将硝酸纤维素膜转移入 ＰＢＳ
溶液中，室温下轻轻振荡１０ｍｉｎ。在膜上加入二抗：
ＩｇＧＨＲＰ溶液（１∶２０００，５％脱脂牛奶溶于 ＴＢＳＴ
中），室温下轻轻振荡２ｈ。取出膜，在 ＰＢＳ中洗膜。
ＥＣｌ显色，压片。洗片、拍照后计算机存储，在 Ｌａｂ
ｗｏｒｋｓ４０Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ系统下分析图片。以样本目的
蛋白的Ｉｎｔｅｇｒａｌｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ／内参的Ｉｎｔｅｇｒａｌｏｐｔｉｃａｌ
ｄｅｎｓｉｔｙ的比值作为蛋白的表达量。
２．６ 对ＰｈｏｓｐｈｏＩκＢα蛋白表达的影响
除一抗选择抗磷酸化 ＩκＢα抗体外，其他步骤
同２．５项下。
２．７ 统计学处理
实验数据以 珋ｘ±ｓ表示，采用 ＳＰＳＳ１２０软件做
统计分析，组间差异比较用单因素方差分析Ｓｔｕｄｅｎｔ
ＮｅｗｍａｎＫｅｕｌｓｔｅｓｔ统计。
３ 结果
ＰＮＳＴＳＡ对 ＭＣＡＯ大鼠脑组织 ＮＦκＢｐ６５表
达的影响 假手术组右侧大脑皮层，细胞中 ＮＦκＢ
免疫反应阳性颗粒表达稀少、颜色浅淡，位于胞浆，
少见细胞核染色。与假手术组比较，模型组 ＮＦκＢ
免疫反应阳性颗粒在细胞中大量表达，在细胞核中
也表达广泛，阳性表达面积、累积吸光度（Ａ）明显增
加（Ｐ＜００１）。与模型组比较，ＰＮＳＴＳＡ５６，１１２ｍｇ
·ｋｇ－１组和 ＰＮＳ组 ＮＦκＢ免疫反应阳性表达物多
在胞浆，阳性表达面积和（Ａ）明显降低（Ｐ＜００５，Ｐ
＜００１）。ＰＮＳＴＳＡ５６ｍｇ·ｋｇ－１组与ＰＮＳ组比较，
阳性表达面积和Ａ也明显降低（Ｐ＜００５，Ｐ＜００１）
（表１）。
ＰＮＳＴＳＡ对 ＭＣＡＯ大鼠脑组织 ＩκＢα，ｐＩκＢα
表达的影响 与假手术组比较，模型组脑组织中 ｐ
表１ ＰＮＳＴＳＡ对缺血脑组织ＮＦκＢ表达的影响
（珋ｘ±ｓ，ｎ＝５）
组别
剂量
／ｍｇ·ｋｇ－１
阳性表达面积 Ａ
假手术 － ４７３７±４５５４ ２２１８±１９２２
模型 － ３１７６３±３５９０１） １３４０５±１９６０１）
ＰＮＳ ８０ ２６７４８±２３７９２） １１１６９±１１７１２）
ＰＮＳＴＳＡ ５６ １９８３０±２６８８２，４） ８８７２±１７４８２，３）
１１２ ２４３１５±２８５８２） １００８４±１３７７２）
注：与假手术组比较１）Ｐ＜００１；与模型组比较２）Ｐ＜００１；与
ＰＮＳ组比较３）Ｐ＜００５，４）Ｐ＜００１。
ＩκＢα蛋白表达量显著增加（Ｐ＜００１），ＩκＢα蛋白表
达量显著减少（Ｐ＜００１）；与模型组比较，ＰＮＳＴＳＡ
５６，１１２ｍｇ·ｋｇ－１组和 ＰＮＳ组 ｐＩκＢα蛋白表达量
显著降低（Ｐ＜００５，Ｐ＜００１），而ＩκＢα蛋白表达量
显著增加（Ｐ＜００１）（表２）。
表２ ＰＮＳＴＳＡ合用对缺血脑组织ＩκＢα，ｐＩκＢα
表达的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝５）
组别
剂量
／ｍｇ·ｋｇ－１
ｐＩκＢα
／βａｃｔｉｎ
ＩκＢα
／βａｃｔｉｎ
假手术 － ０６０８８±００５３３ １５９２２±０４０９０１
模型 － １９５７９±０６７４１１）０３２２３±００９００６１）
ＰＮＳ ８０ １３８３７±０３７０４２）０６０８３±０１６４９１３）
ＰＮＳＴＳＡ ５６ ０８６８５±０１０８５３）０７３６４±０１４５２６３）
１１２ １２１７０±０２７５９２）０７０４２±０２２０５４３）
注：与假手术组比较１）Ｐ＜００１；与模型组比较２）Ｐ＜００５，３）Ｐ＜
００１。
４ 讨论
ＮＦκＢ作为细胞内的重要信息转导分子，在缺
血再灌注脑组织损伤中发挥重要作用。抑制ＮＦκＢ
活化的多种药物，能够发挥神经保护作用，减轻脑组
织损伤［５８］。
脑组织中的ＮＦκＢ主要指ｐ６５，ｐ５０２个亚基组
成的二聚体，正常情况下与ＩκＢα组成三聚体，存在
于胞浆中，表达量少且不能进入细胞核。一旦 ＮＦ
κＢ从三聚体中游离出来，进入细胞核（核转位），与
相应的靶基因结合，则称为ＮＦκＢ的活化。ＩκＢα主
要与ＮＦκＢ蛋白的Ｒｅｌ同源区的氨基酸残基发生作
用，从而掩盖了核定位信号区（ｎｕｃｌｅａｒｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ
ｓｉｇｎａｌ，ＮＬＳ），抑制了 ＮＦκＢ的核转位，使之保留于
胞浆。ＩκＢα分子的磷酸化，导致 ＩκＢαＮ端的
Ｌｙｓ２１和 Ｌｙｓ２２处分别共价结合上泛素分子，促使
ＩκＢα发生构象改变，最后泛素化的 ＩκＢα被２６Ｓ蛋
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白酶小体降解，暴露出 ＮＦκＢ蛋白上的 ＮＬＳ，这样
ＮＦκＢ便能通过核膜上的受体进入细胞核内。本研
究结果表明，模型大鼠再灌注后２２ｈ，缺血脑组织
ＮＦκＢ蛋白的表达量以及核转位显著增加，上述结
果和文献报道基本一致［５６］。ＰＮＳ，ＰＮＳＴＳＡ抑制
ＮＦκＢ活化的作用表现在减少 ＮＦκＢ蛋白表达量
和核转位，这种作用至少与其抑制 ＩκＢα磷酸化有
关。在脑缺血再灌注进程中，ＩκＢα的磷酸化涉及
复杂的生化过程，ＰＮＳ，ＰＮＳＴＳＡ抑制 ＩκＢα磷酸化
的机制有待于研究。
前期的研究发现，ＰＮＳＴＳＡ５６ｍｇ·ｋｇ－１（ＰＮＳ
４０ｍｇ·ｋｇ－１，ＴＳＡ１６ｍｇ·ｋｇ－１）是抑制大鼠 ＭＣＡＯ
再灌注脑组织损伤的优化剂量［１］。本研究发现，优
化剂量抑制 ＮＦκＢ活化的作用强于 ８０ｍｇ·ｋｇ－１
ＰＮＳ，提示ＰＮＳ联合应用少量的ＴＳＡ，可以减少 ＰＮＳ
的用量、增强抑制 ＮＦκＢ活化的效应，部分揭示了
ＰＮＳＴＳＡ抑制大鼠 ＭＣＡＯ再灌注脑组织损伤的协
同作用机制。从结构上分析，除大豆皂苷元外，黄芪
总皂苷的苷元均为环阿尔廷烷型的五环三萜类；三
七总皂苷元大多数是达玛烷型四环三萜类，二者在
结构上差异较大，是否因为作用于细胞上的不同受
体，启动不同的机制，强化了抑制 ＮＦκＢ活性的作
用，这一假设尚需研究证实。
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Ｓｃａｎｄ，２００５，１１１（６）：３６０．
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