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Vol. 34，Issue 1
January，2009
第 34卷第 1期
2009年 1月
·学术探讨·
药用植物功能基因克隆新方法——
成分差异表型克隆法
王学勇 1,2， 崔光红 2， 高 伟 2， 黄璐琦 2*
（1.北京中医药大学 中药学院，北京 100102；
2.中国中医科学院 中药研究所，北京 100700）
[摘要] 针对目前大多数药用植物遗传背景薄弱，有效成分复杂，一般克隆方法难以获得有效成分生物合成相关功能
基因的困境，笔者提出并实践了“成分差异表型克隆法”，介绍了其概念、原理及方法，通过实例验证了该方法的可行性。
指出该方法尤其在有效成分次生代谢途径不明确、相关功能基因背景信息未知的情况下，进行功能基因克隆具有比较突出的
优势。为中药功能基因克隆研究探索了新的研究思路和方法，将为深入开展药用植物基因工程、道地药材形成机制等研究奠
定基础。
[关键词] 药用植物；成分差异表型克隆法；功能基因；次生代谢
*
在后基因组时代，功能基因成为关注和研究热点。这
些功能基因的研究往往是建立在基因序列比较清楚的情况
下进行的。药用植物功能基因与农作物相比，其分子遗传研
究背景往往比较薄弱，这给药用植物有效成分生物合成相关
基因的克隆研究带来了较大困难。目前药用植物常用的基因
克隆方法是基于 PCR 为基础的同源克隆法，该方法虽然具
有简便经济等优点，但是其前提要求所克隆的目的基因信息
清楚，至少需要从其他物种获取含有该基因序列信息。这在
药用植物有效成分代谢途径不明确，有效成分次生代谢关键
酶的编码基因未知的情况下，基于 PCR 同源克隆方法显得
无能为力。为此，如何在药用植物遗传背景比较薄弱的情况
下克隆药用植物有效成分的生物合成的功能基因，从基因水
平上调控药用植物有效成分的生产等问题，已经成为严重制
约药用植物次生代谢基因工程研究的技术瓶颈。经典的功能
基因克隆方法，是基于同位素示踪法获悉具体次生代谢途径
内的基础上普遍采用的同源克隆方法。由于该方法操作起来
有一定难度，再加上同位素发射性污染等因素，一定程度上
限制了其广泛应用。笔者介绍了一种药用植物有效成分生物
合成途径（或次生代谢途径）及其功能基因克隆研究的新思
路与方法，即“成分差异表型克隆法”。该方法不需要清楚
有效成分具体代谢途径和目的功能基因同源序列信息，具有

[收稿日期] 2008-07-02
[基金项目] 国家重点基础研究发展计划(973)项目(2006CB504700)；
国家高技术研究发展计划(863）项目(2007AA02Z104)
[通信作者] *黄璐琦，Tel：(010)64014411-2956，E-mail：huangluqi@
263. net
克隆速度快、高通量等优点。这无疑为解决药用植物次生代
谢的基因调控和相关基因工程研究的瓶颈问题提供了新的
研究思路和有效的手段。结合药用植物功能基因研究现状，
就本方法的概念、原理和方法、优势与应用并以丹参功能基
因克隆为研究实例进行介绍。
1 药用植物功能基因研究的现状
药用植物功能基因研究，特别是次生代谢相关功能基因
的研究存在的最大困难是遗传信息背景即基因信息基础较
薄弱。与农作物不同，绝大多数药用植物遗传背景信息非常
少。王伟等对 2 300种药用植物的基因组、蛋白质及表达序
列标签(EST)的注册统计表明，66%的药用植物没有核酸序
列报道，77%的药用植物没有蛋白质序列注册[1]。据报道[2]，
药用植物功能基因克隆主要集中于长春花、青蒿、甘草、红
豆杉、天麻、银杏、雪莲、毛地黄、葛等 32属 42种药用植
物，其中黄酮类(酚类)合成基因、细胞色素 P450 基因克隆
最多。药用植物功能基因研究日本最多，美国次之，德国第
3，中国第 4。美国对长春花、红豆杉有关的基因克隆走在
世界前沿。德国在生物碱合成，包括长春花和萝芙木中的生
物碱主要合成酶基因的克隆研究较多。日本药用植物基因克
隆主要包括了黄连、杜仲、甘草、紫草、黄芪、人参以及天
仙子等。
笔 者 在 检 索 NCBI 的 公 共 数 据 库 （ http ：
//www.ncbi.nih.gov/，Revised：September 15，2008.）中发
现，目前在 GenBank注册的序列中，丹参 Salvia miltiorrhiza
核酸序列 10 423条（包含 EST），蛋白氨基酸序列 51条；
人参 Panax ginseng的核酸序列 10 449条，蛋白氨基酸序列


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424条；银杏 Ginkgo biloba核酸序列 20 096条，蛋白氨基
酸序列 405条；藏红花 Crocus sativus核酸序列 6 812条，
蛋白氨基酸序列 62条；薄荷 Mentha haplocalyx 核酸序列 8
条，蛋白氨基酸序列 8条；东北红豆杉 Taxus cuspidata核酸
序列 199条，蛋白氨基酸序列 44条。然而，在诸多基因核
苷酸序列或氨基酸序列当中，功能基因特别是与有效成分次
生代谢相关的功能基因的研究报道极少。以丹参为例，在
Genbank注册的 10 399条核苷酸序列中，与丹参酮类成分
次生代谢相关的功能基因，目前只报道如下几条 HMGR
（AAU87798），DXR（ABJ80680），以及笔者注册的 CMK
（ABP96842），它们分别位于萜类化合物次生代谢的上游途
径，甲羟戊酸（MVA）途径和 1-去氧木糖-5-磷酸（DXP）
途径。因此，在药用植物有效成分次生代谢途径及其相关功
能基因克隆研究时，首先遇到的困难就是药用植物遗传背景
基础薄弱。
药用植物有效成分次生代谢途径不清楚是药用植物有
效成分功能基因克隆研究的又一难点之一。有效成分次生代
谢的基因调控研究重点和难点往往是次生代途径中下游的
功能基因的克隆。虽然药用植物有效成分化学结构明确，但
其在植物体内的次生代谢途径不清楚，给功能基因的克隆研
究和后续的次生代谢基因工程研究等带来了巨大困难。目前
水稻和拟南芥基因组测序工作均已完成。正如人基因组测序
工作完成以后进入后基因组时代即功能基因研究时代一样，
植物的后基因组时代也聚焦于功能基因的研究。此间，参照
拟南芥基因信息，许多重要的植物功能基因将被发现。然而，
药用植物有效成分与拟南芥次生代谢产物结构往往相差很
远，代谢途径差异较大，很难根据拟南芥提供的基因组信息，
基于基因的保守结构域， 设计合成寡核苷酸简并引物，克
隆获得次生代谢相关的功能基因。由于大多数药用植物有效
成分次生代谢途径不清楚，按相似序列同源克隆的方法克隆
药用植物有效成分相关功能基因极为困难。所以说新的克隆
思路和策略将是解决问题的关键所在。
2 药用植物功能基因研究新方法的提出
鉴于药用植物研究的特殊性，采用相似基因同源克隆的
方法往往难以获得新的功能基因，更不用说次生代谢途径的
研究。因此，迫切需要一种理想的药用植物功能基因克隆方
法，以推动整个药用植物功能基因研究的快速发展。在这里，
笔者首次提出并成功实践了“有效成分差异→功能基因表达
差异→功能基因克隆→次生代谢途径”的研究思路和方法。
2.1 成分差异表型克隆法的概念
成分差异表型克隆法(ingredient difference phonetypical
cloning)，是基于植物次生代谢产物的差异(包括某类成分含
量差异和某些成分的有无)为表型特征，运用差异表达基因
相关克隆技术来获取次生代谢相关未知基因的一种克隆思
路和方法，属于表型克隆的范畴。该方法具有高通量、快速，
克隆效率高等特点，适用于未知次生代谢途径中未知功能基
因的克隆以及次生代谢途径研究，是该方法的最突出优势。
2.2 成分差异表型克隆法的原理与方法
植物细胞在外界环境变化如各种协迫、诱导子刺激等异
常状态下，常有些与次生代谢有关的基因特异性表达或表达
异常地增高，导致次生代谢产物特异性生产或积累急剧增
加，与正常条件培养的对照组比较，人为造成药用植物有效
成分差异和基因表达差异，通过各种差异表达基因克隆技术
如差异显示 PCR、抑制性消减杂交和 cDNA 微阵列(cDNA
microarray)等技术克隆所需要的次生代谢相关的目的功能
基因。
因此，在进行成分差异表型克隆法实验设计时，首先
考虑在人为可控条件下，如何促使有效成分差异最大。比
如人为的加入诱导子，重金属等促使植物细胞受到异常状
态刺激，次生代谢活动增强，迅速特异的产生或快速积累
次生代谢产物（有效成分）。其次，经测定并比较对照组
与刺激组有效成分的含量差异，选择有效成分差异最大
（有效成分有无或含量高低）的 2组样本做基因表达差异
研究。最后，筛选出表达差异大的基因克隆，测序、分析
和验证后，进行全长序列的克隆、功能验证等工作。成分
差异表型克隆实验流程见图 1。

图 1 成分差异表型克隆法实验流程

在这里，有效成分含量测定一般采用高效液相色谱方
法，若关注挥发油类成分可采用气相色谱方法，若导致未知
成分的差异可选用液-质联用技术测定并分析化学成分结构
特点，以获得药用植物最明显的成分差异性状。成分差异表
型克隆法可引入目前所有的差异表达克隆研究技术。目前差
异表达的基因克隆技术主要有消减杂交 ( subtractive
hybridization， SH)，mRNA差异显示技术(mRNA differential
display reverse transcription PCR，DDRT-PCR)、抑制消减杂
交(suppression subtractive hybridization，SSH)和 cDNA微阵
列技术（cDNA microarray）等。
2.3 成分差异表型克隆法的优势与应用
2.3.1 优势 成分差异表型克隆方法最突出的优点是高通
量，效率高，一次能同时克隆次生代谢途径上的多个功能基
因。如果把功能基因克隆视为钓鱼的话，基于相似基因的同
源克隆 1次只能钓取 1条鱼，而差异基因表型克隆法可以 1
次网罗数条鱼，速度快、效率高。


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以诱导子作为外界环境刺激因子，依托丹参基因芯片
的技术平台，采用成分差异表型克隆方法克隆得到了丹参
有效成分次生代谢相关的 6个功能基因见表 1。在这些基
因中，1个基因参与了丹参水溶性成分酚酸类成分的代谢
（Sm4CL），5 个基因参与了丹参酮类化合物次生代谢
（SmAACT，SmCMK，SmIPP，SmFPPS，SmKS），并
在 GenBank 上注册了 5个与丹参酮成分代谢相关的功能
基因。
表 1 丹参次生代谢途径关键基因编码的酶、催化前体物质及产物
GenBank注册号. 编码的酶 催化前体物质 催化产物
– 4-香豆酸-CoA连接酶(Sm4CL) 4-香豆酸 4-香豆酸 CoA
F635969 乙酰 CoA酰基转运酶(SmAACT) 乙酰 CoA 乙酰乙酰 CoA
EF534309 4-(5’-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶(SmCMK) 4-(5- 焦磷酸胞苷)
-2-C-甲基-D-赤藓醇
4-(5-焦磷酸胞苷)-2-C-
甲基-D-赤藓醇-2-磷酸
EF635967 异戊烯基焦 δ异构酶(SmIPP) 羟甲基丁烯基-4-磷酸 异戊烯基焦磷酸
EF635968 法呢基焦磷酸合成酶(SmFPPS) 牻牛儿基焦磷酸(GPP) 法呢基焦磷酸(FPP)
EF635966 内根-贝壳杉烯合酶(SmKS) 古巴焦磷酸 内根-贝壳杉烯

2.3.2 应用 系统的揭示次生代谢与外界环境刺激因子之
间的生物网络关系，有利于阐明次生代谢功能基因表达调控
机制。以诱导子作为外界环境刺激因子为为例：诱导子与细
胞膜上受体的结合，这一过程会引起膜成分的变化以致引起
膜的通透性、膜内离子分布的变化。诱导子作为外界信号作
用胞质膜而引起膜上发生变化，到引起胞内基因启动、酶活
性改变的过程应该是一个级联过程，这中间需要有物质充当
胞内信使，也即第二信使，目前人们由实验推出的主要第二
信使包括 Ca2 +，cAMP，磷酸肌醇，G2蛋白，水杨酸，茉
莉酮酸及其甲氧基酯以及植物细胞壁组成成分等。诱导子信
号被传递到细胞内以后，通过控制次生代谢途径中关键酶的
合成来调节次生代谢产物的合成[3]。
采用成分差异表型克隆法克隆得到了丹参信号转导相
关的蛋白，应激原蛋白，水通道及金属相关蛋白酶基因等与
次生代谢调控相联系的一些基因，为进一步阐述有效成分功
能基因表达的调控机制奠定了基础见表 2。
表 2 成分差异表型克隆法克隆得到丹参次生代谢
功能基因的相关调控基因
克隆号
获得的差异
表达基因
诱导组与对照组
表达差异倍数
chip44d06 水通道 (PIP2;8/PIP3B) 1.610
chip39b01 CBL-交互作用蛋白激酶 2.025
chip31h02 DNA结合/转录因子 0.465
chip36h12 变应原 Cora 1 3.455
chip41b06 硫酸根载体蛋白 2.515
chip45h02 胁迫与致病响应蛋白 2.765
chip19g08 致病响应蛋白-10 2.345
chip29h02 金属硫蛋白-1 (MT-1) 0.285

3 讨论
药用植物有效成分克隆方法和策略的局限是限制药用
植物功能基因克隆的瓶颈之一。目前药用植物功能基因的克
隆普遍采用同源性为基础的 PCR克隆策略。此法虽然简单，
经济，但它只能克隆相关物种上已克隆出的相似基因[4-6]，
使简并引物扩增效率不高，在 PCR 扩增时有一定的偶然性
和随机性，不具备高通量克隆功能基因的能力。此法克隆药
用植物有效成分生物合成上游途径相关酶基因具有一定可
行性，但对于下游未知途径、未知或同源性较低的已知基因
序列的新基因的克隆几乎不可能。基因差异表达在植物领域
研究比较广泛，但主要集中在植物胚胎发育、形态发生、信
号传导、植物抗逆、抗病、抗虫等基因的鉴定与克隆的研究
方面。例如 Wilkinson 等克隆了番茄成熟基因[7] ，Nemoto
等从小麦中克隆到几个新的盐反应早期响应基因[8]等，主要
是通过比较同一类细胞在不同生理状态下或在不同生长发
育阶段基因表达的差异。药用植物与一般植物研究的侧重点
不同，它主要关注有效成分次生代谢及其含量，目前，根据
成分变化应用基因差异表达克隆的研究报道还比较少。
成分差异表型克隆法的提出，将研究者视线再一次聚焦
到药用植物有效成分这一重要而特殊的研究对象上来。跟农
作物性状与遗传信息的关系一样，药用植物有效成分（次生
代谢产物）跟遗传信息（基因）紧密联系。成分差异表型克
隆研究为了最大限度的消除外界不可控因素的影响，其理想
状态是对药用植物采用统一可控制的培养条件，外加人为的
刺激（外因）比如加入诱导子等，促使药用植物细胞产生成
分最大差异性状，通过基因差异表达克隆技术获取相应的目
的功能基因。
此外，植物的次生代谢往往受外界环境因子的影响。因
此，成分差异表型克隆方法可广泛用于道地药材形成机制的
研究中，研究道地药材有效成分的次生代谢、基因与环境互
作之间的交互网络关系。可以预见，随着药用植物资源研究
的不断深入、药用植物道地药材形成机制研究的逐步展开，
功能基因组研究的日益白热化，成分差异表型克隆法的应用
将迅速促进功能基因组与药用植物研究紧密结合，推动药用
植物现代化的快速发展。


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[参考文献]
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[4] Velculescu V E. Serial analysis of gene expression[J]. Science，
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[5] Newman T. Genes galore：A summary of methods for accessing
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[6] Evan M. Analysis of 1.9 Mb of contiguous sequence form
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[7] Wilkinson J Q，Lanahan M B，Yen H C， et al. An ethylene- inducible
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[8] Nemoto Y，Sasakuma T. Differential stress responses of early
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2002，61(2)：129.


New method of “ingredient difference phonetypical cloning” for functional
gene cloning from medicinal plants

WANG Xueyong1，2，CUI Guanghong2，GAO Wei2，HUANG Luqi2*
(1. College of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China;
2. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medicinal Sciences， Beijing 100700，China )

[Abstract] This paper introduced a new method of “ingredient difference phonetypical cloning” for functional gene clone of
medicinal plants, which might solve the difficulties in isolating genes encoding enzymes for the biosynthesis of secondary
metabolites by usual ways. Concepts, mechanisms and methods were systematically introduced and possibility was proved by
experiments. The method showed the extra superiority of for the isolation of the genes belonged to unknown metabolic pathway and
little information about its sequences. The method provides a new way to isolate functional gene cloning from Chinese herbs and a
fundament for the further study on medicinal plant genetic engineering.
[Key words] medicinal plants; ingredient difference phonetypical cloning; functional gene；secondary metabolism
[责任编辑 吕冬梅]



封面图片简介
东北红豆杉来源于红豆杉科红豆杉属植物东北红豆杉 Taxus cuspidata Sieb. et Zucc.，别名，紫杉、赤
柏松、紫柏松、宽叶紫杉、米树等。为常绿乔木，生于海拔 500～1 600 m湿润肥沃的河岸、谷地、漫岗，
常成群或散生针阔混交林内。主要分布于中国东北、日本、朝鲜、俄罗斯（阿穆尔州、库页岛等）东北亚
地区。
全株以茎、枝、叶、根入药。主要成分含叶含槲皮素、桂皮酸、紫杉醇、紫松醇、紫松素等，茎皮中
含紫杉醇。有抗癌功能，并有抑制糖尿病及治疗心脏病的效用。研究表明，红豆杉的树皮、树根、树干等
泡水喝有一定的抗癌功能，不过提取的紫杉醇很少，仅能提取 50%左右，其中属东北长白山区野生的红豆
杉紫杉醇含量最高。
（周 繇）