全 文 ：应用 ｃＤＮＡＡＦＬＰ研究甘草不同变异类型特异
表达的基因
杨全１，魏胜利２，王文全２，刘春生２，张春荣１
（１．广东药学院 中药学院，广东 广州 ５１０００６；
２．北京中医药大学 中药学院，北京 １００１０２）
［摘要］ 目的：探讨生态环境和遗传背景相同条件下８种不同变异类型甘草在基因表达水平上的差异，旨在揭示甘草种
内变异的分子机制。方法：采用ｃＤＮＡＡＦＬＰ、生物信息学等方法，对不同变异类型甘草在生长旺盛期根部组织特异表达的基
因进行分析和功能预测；采用反相Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交对特异表达的基因进行验证。结果：共获得１４条差异表达基因片段，有６个
基因序列编码的蛋白功能未知，其余的基因片段编码的蛋白参与了植物的抗菌，调节生物体内代谢，增加植物的抗热（高温）
性，提高植物体固氮能力等生物过程。结论：首次克隆了不同变异类型甘草特异表达的基因，为筛选优良变异类型、品种选
育、功能基因组的研究奠定基础。
［关键词］ 甘草；变异类型；ｃＤＮＡＡＦＬＰ；差异表达基因
［收稿日期］ ２００９０２２６
［基金项目］ 国家自然科学基金项目（３０４００５８８）；北京市自然科学
基金项目（６０４２０２１）
［通信作者］ 王文全，Ｔｅｌ：（０１０）８４７３８６２３，Ｅｍａｉｌ：ｗｗｑ５７＠１２６．
ｃｏｍ
ｃＤＮＡＡＦＬＰ（ｃＤＮＡａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）［１］是在ＡＦＬＰ基础上发展起来的一种
研究特异基因表达的技术，具有假阳性低，特异性
高，重复性好，能够对没有任何分子生物学背景的材
料进行研究等特点，被广泛应用于植物，微生物等特
异表达基因的克隆与分离［２］。
甘草ＧｌｙｃｙｒｈｉｚａｕｒａｌｅｎｓｉｓＦｉｓｃｈ．具有清热解毒、
止咳祛痰、补脾和胃、调和诸药等功效［３］，为常用大
宗药材。甘草在野生群落和人工栽培群体中，存在
丰富的变异分化，不同甘草个体之间在根、茎、叶、
花、荚果等器官的外观形态特征，有效成分含量等方
面均存在显著差异［４５］。不同变异类型甘草形态特
征和有效成分含量的变化是否有遗传学基础，在基
因表达上有差异否，未见报道。本实验采用 ｃＤＮＡ
ＡＦＬＰ技术，对生态环境、遗传背景一致的不同变异
类型甘草根部组织的基因表达进行分析，揭示不同
变异类型甘草在基因表达水平上的差异，为筛选优
良变异类型，品种选育奠定基础，也为甘草功能基因
组的研究积累数据。
１ 材料
２００５年９月，在内蒙古杭锦旗人工栽培甘草试
验基地，选择种子来源、栽培管理措施相同的四年生
甘草群体为研究对象，以《中国植物志》对甘草的形态
描述为依据，选择容易观察的茎表皮颜色、叶片平展
或皱褶、茎表皮刺毛密度、结果与否等４项指标进行
变异类型的划分。分别命名为：①绿茎茎光滑结果类
型；②绿茎茎光滑类型；③绿茎叶片皱褶类型；④普通
类型；⑤绿茎茎稀刺毛类型；⑥绿茎茎密刺毛类型；⑦
紫红茎茎光滑类型；⑧紫红茎基茎光滑类型，依次分
别编号为１～８号。对变异类型植株分株进行编号，
移栽至北京中医药大学药用植物园内，使用砂壤土，
以盆栽的形式，进行常规管理。２００６年８月，取不同
变异类型甘草根部组织，提取总 ＲＮＡ。甘草原植物
由北京中医药大学刘春生教授鉴定为Ｇ．ｕｒａｌｅｎｓｉｓ。
２ 方法
２．１ 总ＲＮＡ提取、ｃＤＮＡ合成、ｃＤＮＡＡＦＬＰ分析
参照文献［６］的异硫氰酸胍法提取总ＲＮＡ。取适量
甘草主根顶端，去掉栓皮，在液氮中速冻并研磨成粉
末，溶于异硫氰酸胍抽提液中，再用酸性水饱和酚和
氯仿抽提后，用异丙醇沉淀总 ＲＮＡ，最后溶于经
ＤＥＰＣ处理的水中，－７０℃贮存待用。用甲醛变性
胶检测ＲＮＡ的质量，用分光光度计检测 ＲＮＡ的质
量和浓度。
ｃＤＮＡＡＦＬＰ分析体系、引物、扩增程序等参照
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文献［７］。ｃＤＮＡ的合成按ＴａＫａＲａ的ｃＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
ｋｉｔ（ＭＭＬＶｖｅｒｓｉｏｎ）操作说明进行，合成的 ｃＤＮＡ
经ＰｓｔⅠ和 ＭｓｅⅠ双酶切并加上接头进行预扩增。
将预扩增产物稀释３０倍作为模板，采用选择性扩增
引物组合进行选择性扩增。扩增产物在６％变性聚
丙烯酰胺凝胶电泳上进行银染检测。
２．２ 差异表达片段回收、二次扩增及纯化 在胶片
观察箱上观察聚丙烯酰胺凝胶电泳胶板并找到差异
条带，用锋利刀片将条带割下，放入１５ｍＬ的离心
管中，加入４００μＬ高盐溶液（２０％乙醇、１ｍｏｌ·Ｌ－１
ＬｉＣｌ和１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＴｒｉｓＨＣｌ），室温浸泡２４ｈ后；
６５℃温育２ｈ；取上清液加２５倍体积预冷的无水
乙醇，－２０℃，静置３０ｍｉｎ；４℃，１５０００ｒ·ｍｉｎ－１离
心１５ｍｉｎ；弃尽上清液，加１０μＬ灭菌水溶解，作为
再扩增的模板，采用相应引物，进行再扩增。ＰＣＲ
产物在１％琼脂糖凝胶上检查扩增情况。如果扩增
产物中出现弥散带，将主带用小刀切下，采用 ＤＮＡ
快速纯化试剂盒（ＴａＫａＲａ公司）进行纯化。
２．３ 反相Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析 为了进一步验证ｃＤ
ＮＡＡＦＬＰ技术研究基因差异表达的可靠性，对部分
特异表达的基因进行反相 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ验证，以排除其
他因素引入的非特异片段。探针标记、杂交、洗膜和
显色 采 用 ＤＩＧ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｋｉｔ
（ＲＯＣＨＥ公司产品）及其说明书进行。
２．４ 差异片段的克隆及同源性分析 将纯化后的
ＤＮＡ片段与 ＴａＫａＲａ的 ｐＭＤ１８ＴＶｅｃｔｏｒ载体连接，
转化大肠杆菌 ＪＭ１０９，筛选阳性克隆，由 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
公司进行测序。
基因序列通过美国国家生物技术信息中心
（Ｎａｔｉｏｎａｌｃｅｎｔｅｒｆｏｒｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＮＣＢＩ）
网站的ＧｅｎＢａｎｋ进行 ＤＮＡ差异片段的同源性分析
和功能预测。同时，对所获得的序列以 ＥＳＴ形式向
ＮＣＢＩ信息中心提交，申请注册。
３ 结果与分析
３．１ 变异类型甘草特异基因表达ｃＤＮＡＡＦＬＰ分析
采用异硫氰酸胍法提取的总 ＲＮＡ条带清晰，２８Ｓ
ｒＲＮＡ条带亮度大于１８ＳｒＲＮＡ，ＲＮＡ样品的Ａ２６０／２８０在
１８～２１，质量较好（图１）。采用６４对引物，对不同
变异类型甘草进行ＡＦＬＰ分析，扩增片段大小主要集
中在１００～１０００ｂｐ，大多数基因的表达没有明显变
化，只有少数基因特异表达，如箭头所示（图２），提示
其可能是一些起特殊作用的调控因子。
左至右为１～８号样品（图２同）。
图１ 甘草根组织总ＲＮＡ电泳（左至右为１８号样品）
图２ 甘草ＡＦＬＰ分析聚丙烯酰胺凝胶电泳
３．２ 特异基因表达片段的反相 Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析
考虑到实验材料来源有限等因素，本实验只对８
号样品特异表达的 ５个 ｃＤＮＡ片段进行了反相
Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析。８号样品的５个片段全部出现
较强的杂交信号（图３），这些结果表明，本实验的研
究结果可靠。
图３ 甘草部分差异ｃＤＮＡ片段反相Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交
３．３ ｃＤＮＡ差异片段的克隆、测序及同源性分析
本实验选用６４对引物进行差异表达分析，其中１２
对引物扩增的效果较好，条带清晰，８对引物筛选出
１６个差异表达条带。将差异表达基因片段与载体
连接，转化大肠杆菌 ＪＭ１０９，进行蓝白斑筛选，鉴定
阳性克隆（图４），由于部分条带在回收时丢失，ＰＣＲ
失败等原因，最终成功克隆测序１４个差异表达的基
因序列，序列大小在２０８～６６４ｂｐ。同时，将序列在
Ｇｅｎｂａｎｋ上进行申请注册，注册号为 ＥＬ９６５３２３
ＥＬ９６５３３６（表１）。序列在Ｇｅｎｂａｎｋ中进行同源性序
列比较和功能预测。
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图４ 甘草差异片段阳性克隆菌落ＰＣＲ电泳
（ＤＮＡＭａｋｅｒ．５０ｂｐ）
表１ 差异表达基因片段注册号
片段编号 样品编号 片段大小／ｂｐ ＮＣＢＩ注册号
６ ６ ２７９ ＥＬ９６５３２３
７ ７ ５２２ ＥＬ９６５３２４
１４ ７ ３８０ ＥＬ９６５３２５
９ １ ５０８ ＥＬ９６５３２６
１０ １ ３３０ ＥＬ９６５３２７
１９ ３ ４２２ ＥＬ９６５３２８
２０ ３ ６６４ ＥＬ９６５３２９
１７ ３ ３１９ ＥＬ９６５３３０
１８ ３ ３８１ ＥＬ９６５３３１
１ ８ ４４３ ＥＬ９６５３３２
２ ８ ４５７ ＥＬ９６５３３３
３ ８ ４８２ ＥＬ９６５３３４
１１ ８ ３２１ ＥＬ９６５３３５
１５ ８ ２０８ ＥＬ９６５３３６
ＢＬＡＳＴｘ分析结果表明，有６个基因序列（６，７，
１４，９，１７，１号片段）编码的蛋白功能未知，为假设性
蛋白，其余的基因序列具有蛋白质编码功能，分别参
与了植物的抗菌，细胞正常的生理功能、调节生物体
内的代谢，增加植物的抗热（高温）性，提高植物体
固氮能力等生物过程。其中，１０号基因片断序列编
码的蛋白与蒺藜苜蓿 Ｍｅｄｉｃａｇｏｔｒｕｎｃａｔｕｌａ的抗菌蛋
白同源性为９３％，该蛋白的高量表达会提高植物对
病害的抗性；１８号基因片段序列编码的蛋白与黄瓜
Ｃｕｃｕｍｉｓｓａｔｉｖｕｓ热激蛋白７０具有９８％的同源性，该
蛋白是在高温诱导下产生的一种逆境蛋白，他的产
生能够提高植物的抗热（高温）性，增强对环境能力
的适应性［８］。２号基因片断序列编码的蛋白与烟草
Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ的 ＰＡＲ１ｂ蛋白具有７４％的同源
性，该蛋白由蔗糖和水杨酸诱导表达，为病原相关蛋
白，是植物抗逆性蛋白的一种，能够抑制病原菌的生
长［９］。３号基因片断序列编码的蛋白与黄灯笼椒
Ｃａｐｓｉｃｕｍｃｈｉｎｅｎｓｅ的类生长素和乙烯响应蛋白 ＧＨ３
有８３％的同源性，推测该蛋白可能使花期提前，并
且还可能参与控制营养生长中的茎的分枝以形成更
多的花芽，同时促进果实成熟［１０］，１１号基因片断序
列编码的蛋白与蒺藜苜蓿的ＴＳＧ１０１基因具有８４％
的同源性，该蛋白与根瘤形成有关，能够使根系产生
更多的根瘤菌，提高豆科植物的固氮能力［１１］。
４ 讨论
基因在时间和空间上的有序表达贯穿和调控了
生物个体的整个生命过程，植物体的生长发育，组织
和细胞的分化凋亡及变异都与基因的差异表达有
关，许多被诱导的基因在不同时间和空间阶段表达，
形成各种抗逆性，产生了如植物抗病虫、抗盐胁迫、
抗高、低温胁迫以及抗干早胁迫等抗性基因。本实
验克隆的１８号基因片段是在绿茎茎光滑类型甘草
中特异表达，该蛋白是逆境蛋白的一种，能够增加植
物的抗高温能力，这与该类型甘草对高温有较好的
适应能力，在４０℃高温下，具有较高的净光合速率
的特性是否有关，还需进一步研究。２号（紫红茎基
茎光滑类型中特异表达）、１０号绿茎茎光滑结果类
型中特异表达）片段编码的蛋白与植物的抗病有
关，这对甘草以后的抗性育种具有较大的实际意义，
目前甘草的病虫害多达１０几种，如甘草锈病，甘草
褐斑病等，严重影响甘草的产量及品质，本基因片断
的成功克隆为以后培育高抗病性甘草品种奠定了基
础，提供了候选基因。３号基因片段（绿茎茎光滑结
果类型中特异表达）序列编码的蛋白具有促使花期提
前，果实早熟等功能，这与绿茎茎光滑结果类型甘草
在原产地提早开花结果是否有关，也需要进一步研
究。目前，甘草播种后至少３年后才能开花结果（一
般在４年左右），在一定程度上限制了甘草种子的生
产，该基因片断的克隆为将来培育早熟型甘草品种，
开拓了基因资源。１１号片段（紫红茎基茎光滑类型
中特异表达）具有编码与根瘤形成有关的蛋白，对改
善根系微生态环境，提高土壤肥力具有重要的作用。
在１４条特异表达基因片段中，有６个差异表达
基因片段编码的蛋白功能未知，这些基因片断可能
是新的基因，是调控甘草次生代谢及控制某些性状
的关键基因。下一步的工作应该获得这些基因的全
长序列并对这些基因进行功能表达分析，进一步研
究这些基因与形态变异类型甘草形态特征、光合生
理、有效成分含量的关系。
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目前，对甘草基因组的研究尚少，所以，从某个
或某几个基因着手深入研究，取得一定的突破后，才
可能以点带面，进一步了解甘草分子生物学背景，才
能为整体提高甘草药材质量，在基因水平上调控有
效成分含量成为可能。
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ａｎｄＰＳＩＢＬＡＳＴ：Ａｎｅｗｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｄａｔａｂａｓｅｓｅａｒｃｈ
ｐｒｏｇｒａｍｓ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，１９９７，２５：３３８９．
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｎｏｍａｌｉｅｓｏｆ
ＧｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｕｒａｌｅｎｓｉｓｂｙｃＤＮＡＡＦＬＰｍｅｔｈｏｄ
ＹＡＮＧＱｕａｎ１，ＷＥＩＳｈｅｎｇｌｉ２，ＷＡＮＧＷｅｎｑｕａｎ２，ＬＩＵＣｈｕｎｓｈｅｎｇ２，ＺＨＡＮＧＣｈｕｎｒｏｎｇ１
（１．ＳｃｈｏｏｌｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅｓ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０００６，Ｃｈｉｎａ；
２．ＳｃｈｏｏｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｙ，ＢｅｉｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１０２，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｎｇｅｎｅｔｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎｗｉｔｈｉｎｓｐｅｃｉｅｓ，ａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｄｉｆｅｒｅｎｔｉ
ａｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓａｍｏｎｇ８ａｎｏｍａｌｉｅｓｏｆＧｌｙｃｙｒｈｉｚａｕｒａｌｅｎｓｉｓｕｎｄｅｒｔｈｅｓａｍｅｇｅｎｅｔｉｃｂａｃｋｇｒｏｕｎｄａｎｄｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｍｅｔｈ
ｏｄ：ＴｈｅｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓｉｎｒｏｏｔｓｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔａｎｏｍａｌｉｅｓｏｆＧ．ｕｒａｌｅｎｓｉｓｉｎｖｉｇｏｒｏｕｓｇｒｏｗｉｎｇｓｔａｇｅｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｃＤＮＡ
ＡＦＬＰａｎｄｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙｒｅｖｅｒｓｅＮｏｒｔｈｅｒｎｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｉｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓｗｅｒｅｉｎｆｅｒｅｄｔｈｒｏｕｇｈｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｆｏｕｒｔｅｅｎ
ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ，ａｍｏｎｇｗｈｉｃｈ，ｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆ６ｗｅｒｅｕｎｋｎｏｗｎ，ａｎｄｔｈｅｒｅｓｔｗｅｒｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ，ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ｅｎｈａｎｃｉｎｇｔｈｅｈｅａｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｂｉｌｉｔｙ，ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｔｈｅｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄｏｔｈｅｒｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．Ｃｏｎ
ｃｌｕｓｉｏｎ：Ｆｏｒｔｈｅｆｉｒｓｔｔｉｍｅ，ｔｈｅｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍｔｈｅｄｉｆｅｒｅｎｔａｎｏｍａｌｉｅｓｏｆＧ．ｕｒａｌｅｎｓｉｓ．Ｔｈｉｓｐｒｏｖｉｄｅｄ
ｔｈｅｂａｓｉｓｆｏｒｔｈｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｆｉｎｅａｎｏｍａｌｉｅｓａｎｄｖａｒｉｅｔｉｅｓ，ａｎｄｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｏｍｉｃｓ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｇｌｙｃｙｒｈｉｚａｕｒａｌｅｎｓｉｓ；ａｎｏｍａｌｙ；ｃＤＮＡＡＦＬＰ；ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓ
［责任编辑 吕冬梅］
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第３４卷第１３期
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