全 文 :水飞蓟素纳米混悬剂冻干粉的制备及表征
赵晓宇,王国华,张保献,李慧,聂其霞,臧琛,赵小妹
(中国中医科学院 中药研究所,北京 100700)
[摘要] 目的:制备水飞蓟素纳米混悬剂以及冻干粉并进行相关的理化表征。方法:采用沉淀法,分别将聚氧乙烯脱水
山梨醇单油酸酯(Tween80),十二烷基硫酸钠(SDS),泊洛沙姆(Poloxamer188),3种表面活性剂作为稳定剂制备水飞蓟素纳
米混悬剂,同时为保持制剂稳定性,以5%甘露醇作为冻干载体制备混悬剂冻干粉;采用激光散射粒径仪测定混悬剂的粒径、
多分散指数、Zeta电位;采用透射电镜观察其形态,采用X光衍射及差示扫描量热法考察其物相变化。结果:成功制备了水飞
蓟素纳米混悬剂及冻干粉,电镜观察形态圆整,大小均一,粒径为100~300nm,X光射线衍射显示水飞蓟素纳米混悬剂有其
专属特征。结论:将水难溶性的有效部位制备成纳米混悬剂可行,同时为中药新剂型开发提供实验依据。
[关键词] 水飞蓟素;纳米混悬剂;纳米晶体;X光射线衍射;差示扫描量热法
[收稿日期] 20090113
[基金项目] 中国中医科学院基本科研业务费自主选题项目
(ZZ2006124)
[通信作者] 张保献,Tel/Fax:(010)640144112957,Email:zhang
baoxian925@163.com
[作者简介] 赵晓宇,硕士研究生,Email:zxy204@126.com
水飞蓟素(silymarin)是从菊科植物水飞蓟Sily
bummarianumGaertner种子中提取分离而得到的黄
酮木脂素类化合物,主要由水飞蓟宾(silymarin)、异
水飞蓟宾(isosilybin)、水飞蓟宁(silydianin)、水飞蓟
亭(silychristin)组成[1],研究表明水飞蓟素具有稳
定细胞膜,改善肝功能的作用,对急慢性肝炎、肝硬
化和代谢中毒性肝损伤具有较好的疗效。
目前上市的产品主要有国产的益肝灵片和德国
进口的利加隆(Legalon于1969年德国上市)胶囊,
水飞蓟素为水难溶性药物,在水中的溶解度只有
00401g·L-1,因此作为口服吸收药物,生物利用
度很低(仅有20%~50%[2]),是目前临床应用的主
要问题。
纳米混悬剂,是利用表面活性剂的稳定作用,将
药物微粒分散在水中,通过粉碎或控制析晶等技术
形成稳定的纳米胶态分散体。纳米混悬剂中药物以
纳米状态存在,高度分散,利于体内吸收,能显著提
高药物的生物利用度。本研究通过沉淀法(precipi
tation[3])成功制备水飞蓟素纳米混悬剂,考察了处
方因素对纳米混悬剂的影响,并对制得的水飞蓟素
纳米混悬剂进行相关的表征。
1 材料
马尔文粒度测定仪(附带有 pH自动滴定仪,
MastersizernanoZS,英国 Malvern公司);X射线衍
射仪(D/Max2500VB2+/PC,Rigaku);差示扫描量
热仪(Pyris1,PERKINELMER);水浴锅(HHS型,
巩义市予华仪器有限责任公司);旋转蒸发仪(RE
85A,巩义市予华仪器厂);电子投射显微镜(JEM
1010,日本电子公司);冷冻干燥机(CHRISTAL
PHFA24LSC,德国);超声波清洗器(KQ100B
40KHZ100W,昆山超声仪器有限公司)。
水飞蓟素(盘锦华城制药有限公司,批号
20070805);聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(Tween
80)(国 药 集 团 化 学 试 剂 有 限 公 司,批 号
F20080203);十二烷基硫酸钠(北京化学试剂公司,
批号950331);Poloxmer188(WPIC630C,北京风礼精
求 商 贸 有 限 责 任 公 司,原 产 地 德 国,批 号
WPIC630C);甘露醇(北京中联化工试剂厂,批号
970915);氢氧化钠、浓盐酸、3%醋酸双氧铀染色剂
均为分析纯。
2 方法
2.1 水飞蓟素纳米混悬剂的制备
称取05g水飞蓟素提取物用10mL无水乙醇
稍稍加热溶解后,注入至100mL含有表面活性剂的
水相中,注入完毕后,继续超声30min得到浅黄色
乳状混悬液,转移至茄形瓶中,控制真空度 009
MPa,水浴温度50℃,旋转蒸发慢慢除去乙醇至无
醇味,继续旋蒸一段时间至乙醇完全除去,转移至量
瓶中,用蒸馏水稀释定容至刻度,摇匀即得水飞蓟素
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纳米混悬剂。
2.2 水飞蓟素纳米混悬剂冻干粉的制备
为保持水飞蓟素纳米混悬剂的稳定,本实验对
其进行冷冻干燥,采用5%甘露醇作为冻干保护剂,
将制得的纳米混悬剂置于-80℃冰箱中预冻48h,
冷冻干燥机中进行冷冻干燥:温度 -48℃,压力
001KPa,48h后取出,得到均一,疏松,复溶性好的
水飞蓟素纳米混悬剂冻干粉。
2.3 粒径、多分散指数以及Zeta电势的测定
采用激光粒度仪测定水飞蓟素纳米混悬剂及其
冻干粉的粒径、多分散指数以及 Zeta电势。水飞蓟
素纳米混悬剂的样品用蒸馏水稀释20倍后直接测
定;Zeta电势不经稀释直接测定。
水飞蓟素纳米混悬剂冻干粉的复溶:取加热至
40℃的蒸馏水,移液管精密吸取与冻干前纳米混悬
剂液相同的体积数5mL,慢慢旋转加入盛有冻干粉
的小瓶中,摇晃后可见冻干粉快速溶解,得到其复溶
后的纳米混悬液。用上述同样方法稀释后测定粒径。
2.4 pH对纳米混悬剂粒径及Zeta电势的影响
采用马尔文粒度测定仪附带的pH自动滴定仪,
滴定液分别为005mol·L-1的 NaOH溶液和005
mol·L-1的HCL溶液,设定分辨率为02个pH,在线
测定粒径以及Zeta电势变化情况,以观察pH对水飞
蓟素纳米混悬剂粒径及Zeta电势的影响。
2.5 pH对水飞蓟素纳米混悬剂中水飞蓟宾含量的
影响
按照《中国药典》2005年版一部水飞蓟含量测
定项下方法测定。色谱柱 Kromasil(46mm×250
mm,5μm);流动相 甲醇水冰醋酸(48∶52∶1);流
速1mL·min-1;检测波长287nm,柱温25℃。
样品的制备,将制得的纳米混悬剂分别用005
mol·L-1的 HCl溶液和005mol·L-1的 NaOH溶
液调节pH至30,47,62,79,分别从中精密吸取
1mL,置于 25mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇
匀,用022μm微孔滤膜滤过进样10μL测定。
2.6 纳米混悬剂形态观察
采用负染色法,将水飞蓟素纳米混悬液稀释至
适当浓度,滴1滴于密封膜上,将铜网带有碳膜的一
面接触样品液体后,用镊子小心将铜网夹起,用小滤
纸片吸去铜网边缘处多余的溶液,然后使铜网带有
碳膜一面接触3%的醋酸双氧铀染液进行染色15
min后,用镊子轻轻取下,按上述方法拭去边缘处多
余的染液,在白炽灯下烤干后透射电镜观察。
2.7 Xray衍射观察晶型改变
采用Xray衍射仪分别对水飞蓟素、甘露醇、以
及混悬剂冻干粉进行 X光衍射扫描,2θ扫描范围
5~90°,采样宽度为 002°,扫描速度为 10°·
min-1,电压40kV,电流200mA。
2.8 差示扫描量热法(DSC)观察熔点变化
适量水飞蓟素纳米混悬剂冻干粉样品于坩埚
中,以10℃·min-1从25℃升温至220℃,空白铝
质坩锅作为对照,差示扫描量热仪测定其熔点以及
焓变。
3 结果与分析
3.1 不同处方粒径、多分散指数及 Zeta电势测定
结果见表1。
表1 不同处方粒径、多分散指数及Zeta电势测定
表面活性剂种类
表面活性剂与药物的质量比
1∶2
ZAve
/nm
PDI
ZP
/mV
1∶1
ZAve
/nm
PDI
ZP
/mV
2∶1
ZAve
/nm
PDI
ZP
/mV
4∶1
ZAve
/nm
PDI
ZP
/mV
Tween80 1142 0189 -374 1469 0082 -185 2595 0137 -18 3573 017 -559
SDS 2269 0197 -154 2154 0149 -431 2049 0158 -382 - - -
Poloxamer188 1762 0149 -161 1636 0045 -647 1884 0068 -123 2536 0053 -159
注:ZAve.平均粒径;PDI.多分散指数;ZP.Zeta电势;“-”.表示试验中没有测定。
3.1.1 表面活性剂加入量对药物粒径的影响 由
图1可看出随着Tween80与药物比例的增大,药物
的粒径呈现增长趋势,且变化趋势较明显,粒径可从
114nm增大至 357nm;SDS组与之趋势相反,随
SDS用量的增加,粒径呈现减小趋势;Poloxamer188
组研究则发现随表面活性剂用量的增大,粒径出现
先减小后增大的现象。由此可以看出,处方因素是
影响水飞蓟素纳米混悬剂粒径的主要因素之一,可
以通过调整表面活性剂的种类及用量来控制水飞蓟
素纳米混悬剂的粒径。
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图1 不同表面活性剂量对粒径的影响
3.1.2 表面活性剂加入对药物多分散指数的影响
一般认为,多分散指数(polydispersityindex,PDI)
小于02,颗粒的单分散性较好。本实验中分散性
均小于02,均可以看做是单分散体系。从图2看
出,药物的多分散指数值均在各表面活性剂所列处
方中存在一最小值,即分散指数最小、分散均匀度最
好的值。这说明表面活性剂加入量不仅影响药物粒
径的大小,而且影响药物粒子的分散均一性。
3.1.3 表面活性剂的加入对药物 Zeta电势的影响
图3表明表面活性剂的加入同样对 Zeta电势有
影响,其中以 Tween80和 SDS两者加入量变化最
大,当表面活性剂与药物比例从1∶2升至2∶1时,前
者Zeta电势升高了19mV,后者Zeta电势降低了28
mV;而Poloxamer188的用量变化则对 Zeta电势影
响不明显。
3.2 纳米冻干粉室温下放置3个月的稳定性观察
图2 不同表面活性剂量对多分散指数的影响
图3 不同表面活性剂量对Zeta电势的影响
将以Poloxamer188表面活性剂为稳定剂制得的
纳米混悬剂冻干粉3批样品室温下放置3个月粒径
及Zeta电势的变化,见表2。可见纳米混悬剂冷冻
干燥再复溶后与冻干前相比粒径明显增大,分散指
数亦由01增大到03左右。但冷冻干燥样品室温
放置两个月粒径变化不大,仍然保持在 300nm以
下,多分散指数有增大趋势。
表2 冷冻干燥前后及放置时间纳米混悬剂粒径和分布的变化
批次
冻干前
ZAve
/nm
PDI
冻干后0月
ZAve
/nm
PDI
冻干后1月
ZAve
/nm
PDI
冻干后2月
ZAve
/nm
PDI
冻干后3月
ZAve
/nm
PDI
1 1724 0098 2786 0308 2732 0354 2868 0417 2923 0462
2 1647 0092 2388 0293 2780 0354 2888 0464 3002 0468
3 1657 0120 2392 0333 2220 0348 2330 0378 2606 0426
3.3 pH对粒径及Zeta电势的影响
本实验考察了pH3~8水飞蓟素纳米混悬剂粒
径和电势的变化,见图4,由图中趋势和数据表明混
悬剂粒径随 pH改变不明显,最高与最低值相差10
nm;而Zeta电势绝对值缓慢升高。说明 pH在此范
围内变化不影响纳米混悬体系的粒径大小和稳
定性。
3.4 pH对水飞蓟宾含量的影响
试验结果见表3,可见在不同的 pH下,纳米混
悬剂中水飞蓟宾含量均未发生明显改变,提示
pH3~8变化不影响纳米混悬剂化学稳定性。
3.5 TEM观察
图5为水飞蓟素纳米混悬剂在透射电镜下观察
到的微观形态,药物在混悬剂中呈现球形粒子分布,
且粒径较为均一,与文献中报道的维甲酸纳米混悬
剂形态相似[4]。
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图4 pH对粒径变化及Zeta电势影响
表3 不同pH下水飞蓟素纳米混悬剂有效成分
含量的变化
pH
水飞蓟
宾峰面积
水飞蓟宾
异构体峰
面积
质量浓度
/g·L-1
混悬液中水
飞蓟宾质量
分数/%
30 574467 983268 0044 0110
47 527164 890588 0040 0100
62 572844 977114 0044 0110
79 586270 1005001 0045 0112
对照品(60) 783697 924337 0048 -
图5 混悬剂放大33万倍电镜照片
3.6 X光射线衍射观察
水飞蓟素纳米混悬剂冻干粉 X光衍射见图6,
可见水飞蓟素衍射信号峰较弱,且晶体的特征吸收
峰不明显,峰型呈现很宽的谱带,显示组成水飞蓟素
的几种混合成分,有的是以无定形态存在的;甘露醇
和 Poloxamer188峰均有较强的晶体衍射信号峰出
现。在混悬剂冻干粉衍射峰中,信号强度相对于辅
料(主要为甘露醇)明显降低。结合本制剂特点,推
断是由于冷冻干燥过程中,发生了辅料(主要是甘
露醇)2次结晶的过程,但此种结晶属于基于药物纳
米粒子为核心的非均匀形核过程,最后形成的晶体
较原辅料晶粒多,晶界应变力增加,使得粉体衍射峰
宽化或者衍射锋强度降低[5](本实验结果是峰强度
明显降低)。可见水飞蓟素混悬剂冻干粉具有自身
的X光衍射特征。
A.甘露醇;B.Poloxamer188;C.纳米混悬剂冻干粉;
D.原料药X射线衍射峰。
图6 X射线粉末衍射图
3.7 差示扫描量热测定
DSC测定结果见图7,可见测得的水飞蓟素纳
米混悬剂衍射图中发生相转变峰与辅料甘露醇峰位
和峰强几乎完全一致,其中均未见 Poloxamer188的
555℃处熔点峰和药物的相变峰,这可能是由于在
整个纳米混悬剂中,因药物 Poloxamer188含量较低
并且吸收峰信号较低,被甘露醇的强吸收峰掩盖的
缘故。
4 讨论
水飞蓟素为水难溶性药物,目前研究的速释制
剂有分散片,滴丸等,尽管其在此类制剂中崩解速度
快,但是溶出速度很慢,这是影响药物在胃肠道吸收
度的限度过程,根据NoyesWhitney方程dc/dt=DS/
h(Cs-C),公式中 D代表溶解药物的扩散系数;Cs
为药物在介质中的饱和溶解度;C为 t时刻药物在
溶出介质中的浓度;S为固体药物的表面积。因此
通过增大固体药物表面积就可以提高溶出速度,而
纳米混悬剂是通过粉碎或纳米析晶技术,将药物粒
径降低至纳米范围内,从而使得同重量的药物粒子
总表面积增大,从而提高溶出速度进而增加体内药
物的吸收。
本实验成功制备了水飞蓟素纳米混悬剂及其冻
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A.Polaxamer188;B.水飞蓟素纳米混悬剂;C.水飞蓟素原料药;D.甘露醇。
图7 水飞蓟素纳米混悬剂及辅料DSC图谱
干粉,冻干粉复溶后虽然粒径有所增大,但是仍保持
在300nm以下,多分散指数在03~05,说明冻干
后仍然维持在纳米范围内,冻干品3个月粒径没有
明显改变证明冻干方式可以很好地保持纳米混悬剂
的稳定性;实验还考察了不同 pH下水飞蓟宾的含
量,结果pH在3~8水飞蓟宾含量无变化;相关的
体外释药,体内分布及生物利用度等评价将在后续
试验中作进一步研究。
本实验的模型药物水飞蓟素是从水飞蓟中提取
的有效部位,这不同于国外已上市的针对单一化学
成分的纳米混悬剂研究,首先 X光衍射数据分析中
多组分的衍射特征图谱不同于具有固定晶型的单一
化学成分,因此分析思路定不同于某些化学药物,本
研究参考有关物理学有关知识[6],对衍射图谱进行
解释,这是中药新剂型研究中的新探索,同时为中药
新剂型研究提供实验依据。
[参考文献]
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社,2002:473.
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性增殖性玻璃体视网膜病变的预防作用[J].南京医科大学学
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Developmentofsilymarinnanocrystalslyophilizedpowerapplying
nanosuspensiontechnology
ZHAOXiaoyu,WANGGuohua,ZHANGBaoxian,LIHui,NIEQixia,ZANGChen,ZHAOXiaomei
(InstituteofChineseMateriaMedica,ChineseAcademyofChineseMedicalScience,Beijing100700,China)
[Abstract] Objective:Topreparesilymarinnanosuspensionandlyophilizedpowerforenhancingthedissilutionofpoorlysolu
bledrugs.Method:TheprecipitationtechniquewasadaptedtoproducethesilymarinnanosuspensionsrespectivlyapplyingTween80,
SDSandPoloxamer188asstabilizers.Thelyophilizedformulacontained5% mannitolascryoprotectant.Particlesize,Polydispersityin
dexandZetapotentialweredetectedbyMastersizernanoZS(MalvernEngland)MorphologicalcharacterwasobservedwithTransmis
sionElectronMicroscopyTheproduct'sstructurewasperformedwithXraydifractometer.Result:Thesilymarinnanosuspensionwas
successfulyprepared,inwhichthedrugparticlesizewasabout100300nm,andtheparticleshadballikeshapeandgooddispersive
properties.Conclusion:ThisstudyprovidedpotentialfortheneotypedosageformdevelopmentoftheChineseTraditionalMedicine.
[Keywords] silymarin;nanosuspension;nanocrystals;Xraydifraction;diferentialscanningcalorimetry
[责任编辑 周 驰]
关于召开2009年药物溶出度国际学术研讨会的通知
拟定于2009年9月在北京和上海两地召开药物溶出度国际学术研讨会,将邀请固体制剂溶出度研究领
域的中外专家,就会议主题进行专题讲座。现将会议的有关事宜通知如下:
一、会议专题讲座:
药物溶出度及生物利用度;中国药典2010年版简介;药物缓释、控释制剂研究发展等。
二、会议征文与要求:
1.征文内容:药物溶出度法在药品检验中的应用;药物溶出度法对缓释、控释制剂质量的评价;药物溶出
度法在中药制剂及生化药物制剂中的应用;药用辅料、药用胶囊对药物溶出度的影响;药物溶出度与生物利
用度之间的关系;药物溶出度仪器的研究进展。
2.征文要求:①未公开发表的论文均可作为本次征文稿件,研究论文一般不超过3000字,综述不超过
5000字;②论文格式请按本刊稿约要求;③每篇稿件需附单位介绍信及50元审稿费;④征文截止日期2009
年7月30日;⑤投稿方式:请登录本刊在线投稿系统:进行在线投稿,“期刊栏目”请选择“2009溶出度会议
征文”;⑥论文经专家审阅后,将在本刊发表,并酌收版面费。
3.联系方式:地址:北京市崇文区天坛西里2号,中国药品生物制品检定所药物分析杂志编辑部;邮政编
码:100050;电话:01067058427;传真:01067012819;E-mail:ywfx@nicpbp.org.cn;www.ywfxzz.cn;联系人:
刘小帅。
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