全 文 ：泰山白首乌醇提物对 ＨｅｐＧ２肝癌细胞增殖与
凋亡的调节作用
费洪荣１，王李梅１，王凤泽２
（１．泰山医学院 药学院，山东 泰安 ２７１０１６；
２．泰山医学院 生物科学系，山东 泰安 ２７１０１６）
［摘要］ 目的：研究泰山产白首乌醇提物对ＨｅｐＧ２肝癌细胞增殖与凋亡的调节及其相关分子机制。方法：白首乌９５％
的乙醇提取物，通过Ｄ１０１大孔吸附树脂梯度洗脱。ＭＴＴ法检测不同洗脱部位对 ＨｅｐＧ２细胞增殖的影响；流式细胞术检测
ＨｅｐＧ２细胞周期的变化；ＦＩＴＣＡｎｎｅｘｉｎⅤ／ＰＩ双标记检测９０％乙醇洗脱部位对肝癌细胞凋亡的影响；免疫印迹法检测 ＥＲＫ，
ＪＮＫ１，ｐ３８／ＭＡＰＫ磷酸化水平的变化。结果：泰山白首乌５０％乙醇洗脱部位和９０％乙醇洗脱部位可明显抑制 ＨｅｐＧ２细胞增
殖，减少细胞的增殖指数（ＰＩ），且９０％乙醇洗脱部位可诱导 ＨｅｐＧ２细胞发生凋亡，抑制 ＥＲＫ磷酸化并促进 ＪＮＫ１的磷酸化。
结论：泰山白首乌醇提物可抑制ＨｅｐＧ２肝癌细胞的增殖并诱发凋亡，其分子机制可能与调节 ＭＡＰＫ信号通路中 ＥＲＫ和 ＪＮＫ
磷酸化水平的平衡相关。
［关键词］ 白首乌；醇提物；细胞凋亡；肝癌；ＭＡＰＫ
［收稿日期］ ２００９０６０４
［基金项目］ 国家自然科学基金青年项目（３０８００４２２）
［通信作者］ 王凤泽，副教授，博士，研究方向：肿瘤分子生物学。
Ｔｅｌ：（０５３８）６２３６０７５
［作者简介］ 费洪荣，讲师，硕士，研究方向：天然药物有效成分的
提取分离及活性研究。Ｔｅｌ：（０５３８）６２２９７５１，Ｅｍａｉｌ：ｈｒｆｅｉ＠ｔｓｍｃ．ｅｄｕ．
ｃｎ
泰山白首乌为萝摩科鹅绒藤属植物戟叶牛皮消
ＣｙｎａｎｃｈｕｍｂｕｎｇｅｉＤｅｃｎｅ的干燥块根，具有补血益
精、延年益寿等功效。据文献报道，白首乌具有抗氧
化、抗肿瘤和保护胃粘膜损伤等方面的功效［１６］，其
中的Ｃ２１甾苷可促进肝癌细胞的凋亡
［７］。本研究应
用Ｄ１０１大孔吸附树脂对白首乌９５％乙醇提取物进
行分离，以肝癌细胞 ＨｅｐＧ２为实验材料，跟踪检测
白首乌醇提物抑制作用的活性部位，并探讨其可能
的分子机制，为研究白首乌的抗肿瘤作用及其临床
应用提供理论基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 药材与细胞株 白首乌饮片（泰安市永春
堂中药饮片有限公司）；人肝癌细胞 ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ，
美国）。
１．１．２ 试剂及来源 ＲＰＭＩ１６４０培养基（ＧＩＢＣＯ，批
号１２４３０９８），胎牛血清（杭州四季青，批号０６０３１６），
ＭＴＴ（Ｇｅｎｖｉｅｗ，批号 ｍ２１２８），碘化丙啶（Ｓｉｇｍａ，批号
０９４Ｋ３７３１），ＡｎｎｅｘｉｎⅤＦＩＴＣ细胞凋亡检测试剂盒（南
京凯基生物发展有限公司，批号ＫＧＡ１０７），ＥＣＬＷｅｓｔ
ｅｒｎｂｌｏｔ显色试剂盒（Ｐｉｅｒｃｅ，批号ＨＩ１０６３６１），ｐＪＮＫ１
抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ，批号 Ｅ２９０７），ｐｐ３８抗体（Ｓａｎｔａ
ｃｒｕｚ，批号Ｅ０５０８），ｐ３８抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ，批号Ｌ０５０７），
ＪＮＫ抗体（ＳＡＢ，批号２１２４１），ｐＥＲＫ４２／４４（ｃｅｌｓｉｇｎａ
ｌｉｎｇ，批号９１０６Ｓ），ＥＲＫ（ｃｅｌｓｉｇｎａｌｉｎｇ，批号９１０２），β
ａｃｔｉｎ抗体（Ｓｉｇｍａ，批号Ａ５４４１），山羊抗小鼠ＩｇＧ（北
京中杉金桥，批号８１０９５），山羊抗兔ＩｇＧ（北京中杉金
桥，批号８１２８３），Ｄ１０１大孔吸附树脂（天津市北方天
医化学试剂厂，批号２００６０３１６）。
１．１．３ 主要仪器 ＲＥ５２Ａ型旋转蒸发仪（上海亚
荣生化仪器厂），ＳＨＢⅢ型循环水式多用真空泵（郑
州长城科工贸有限公司），ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＦｏｒｍａ
ＣＯ２孵箱３１１（美国），Ｒａｄ４５０型全自动酶标仪（Ｂｉｏ
Ｒａｄ，美国），流式细胞仪（ＢＤＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，美国）
ＭｉｎｉＰｒｏｔｅｉｎＲＩ蛋白电泳系统（ＢｉｏＲａｄ，美国）。
１．２ 方法
１．２．１ 样品制备 取白首乌粗粉２００ｇ，用９５％乙
醇１０００ｍＬ于８０℃水浴回流提取２次（１ｈ／次），
抽滤，滤液浓缩并减压干燥得白首乌醇提物（Ａ）。
称取１００ｇＡ上Ｄ１０１大孔吸附树脂柱（预处理），
有文献报道，在醇的浓度低于５０％时，洗脱物基本
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无活性［４］，因此选用蒸馏水、５０％乙醇、９０％乙醇和
无水乙醇进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液，浓缩，
减压干燥，分别得４个洗脱部位Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ。
１．２．２ 细胞培养 肝癌细胞 ＨｅｐＧ２采用 ＲＰＭＩ
１６４０培养基，含有１０％胎牛血清，１００Ｕ·Ｌ－１青霉
素和１００μｇ·Ｌ－１硫酸链霉素，在３７℃孵箱５％ＣＯ２
条件下培养。
１．２．３ ＭＴＴ法测定 ＨｅｐＧ２细胞活力 胰酶消化
ＨｅｐＧ２细胞，计数并调整细胞浓度为２×１０５个／ｍＬ，
接种于９６孔板中，各孔细胞数约为４×１０４个，于３７
℃、５％ＣＯ２条件下培养过夜，次日进行分组加入 Ａ，
Ｃ，Ｄ，Ｅ（终质量浓度分别为１５０，１００，５０ｍｇ·Ｌ－１），
阴性对照组加入ＤＭＳＯ；继续培养２４ｈ，终止培养前
４ｈ加２０μＬ（５ｇ·Ｌ－１）的ＭＴＴ于各个孔中；然后吸
去孔中的培养液，再加入１５０μＬ的 ＤＭＳＯ，室温振
荡１０ｍｉｎ；用酶标仪（波长 ５７０ｎｍ）测定各孔的 Ａ
值。以同样的方法测６个平行孔，对结果进行统计
分析。
细胞抑制率（％）＝（Ａ对照组 －Ａ实验组）／Ａ对照组 ×１００％
１．２．４ 流式细胞术检测细胞周期与凋亡 细胞用
Ｄ处理１２ｈ后，胰酶消化实验组和对照组细胞制
备悬液，加入７５％的冷无水乙醇，４℃固定１８ｈ以
上，８００ｒ·ｍｉｎ－１离心５ｍｉｎ，细胞用 ＰＢＳ洗 ２次，
并加入 ５０ｍｇ·Ｌ－１的ＲＮａｓｅＡ，３７℃３０ｍｉｎ，冰浴
２ｍｉｎ，加入５０ｍｇ·Ｌ－１的碘化丙啶染料，４℃闭光
染色３０ｍｉｎ，然后上机检测，并用 ＣｅｌＱｕｅｓｔ软件
分析各组细胞的周期分布，分析 Ｇ０／Ｇ１期、Ｓ期和
Ｇ２／Ｍ期细胞所占比例。同时按照试剂盒说明进
行 ＡｎｎｅｘｉｎⅤＦＩＴＣ法测定细胞凋亡，根据 Ａｎｎｅｘｉｎ
Ⅴ和 ＰＩ的荧光强度计算凋亡百分率，实验重复 ３
次。
１．２．５ 免疫印迹分析 用预冷的 ＰＢＳ洗细胞 ２
次，然后加细胞裂解液（１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＴｒｉｓＨＣｌｐＨ
８０，１ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＥＤＴＡ，１５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＮａＣｌ，１％
ＮＰ４０，１ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＰＭＳＦ，１％ＳＤＳ，ｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
ｃｏｃｋｔａｉｌｓ）冰上放置２０ｍｉｎ，４℃ １３０００×ｇ离心２０
ｍｉｎ，收集上清定量分析。取３０μｇ已定量的总蛋白
进行１２％ ＳＤＳＰＡＧＥ实验，电转移至硝酸纤维素膜
上，５％脱脂奶粉封闭过夜，加入一抗，室温孵育３ｈ，
ＰＢＳＴ洗膜；再加入二抗室温孵育１ｈ，ＰＢＳＴ洗膜，应
用ＥＣＬ显色试剂盒于暗室曝光显影。
１．２．６ 统计分析 采用 ｔ检验，Ｐ＜００５认为具有
统计学显著意义。
２ 结果
２．１ 白首乌不同洗脱部位抑制ＨｅｐＧ２细胞增殖
本研究选用５０，１００，１５０ｍｇ·Ｌ－１３组梯度来
检测白首乌醇提物、５０％乙醇、９０％乙醇和无水乙醇
４个洗脱部位对 ＨｅｐＧ２细胞增殖的影响，作用时间
为２４ｈ，结果如表１所示。ＭＴＴ结果显示，Ａ，Ｃ，Ｄ
具有抑制ＨｅｐＧ２细胞增殖的活性（表１）。与 Ａ，Ｃ，
Ｅ相比，９０％乙醇洗脱部位（Ｄ）的抑制作用更明显，
在１００ｍｇ·Ｌ－１时对ＨｅｐＧ２细胞的增殖具有明显的
抑制作用，与对照组相比差异极显著（Ｐ＜００１），且
抑制作用呈剂量依赖性，ＩＣ５０为１３０ｍｇ·Ｌ
－１。
表１ 泰山白首乌不同洗脱部位抑制肝癌细胞
ＨｅｐＧ２的增殖（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
组别
质量浓度
／ｍｇ·Ｌ－１
Ａ
抑制率
／％
对照 ０５２１±００２２ ０
醇提物（Ａ） ５０ ０４２３±００６１ １８８０
１００ ０３９７±００２７ ２３８０
１５０ ０３７４±００１３１） ２８２１
５０％洗脱部位（Ｃ） ５０ ０４０８±００２２ ２１６６
１００ ０３６３±００１５１） ３０３２
１５０ ０３０３±００３７２） ４０７０
９０％洗脱部位（Ｄ） ５０ ０３６０±００３２１） ３０９０
１００ ０２６９±００２６２） ４８３５
１５０ ０２２１±００２６２） ５７５８
无水乙醇洗脱部位（Ｅ） ５０ ０５１６±００１４ １０７
１００ ０５０３±００２１ ３４６
１５０ ０４９０±００１８ ５９５
注：与对照组相比１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１（表２，３同）。
２．２ Ｄ对肝癌细胞ＨｅｐＧ２细胞周期的影响
根据 ＭＴＴ实验结果，发现样品 Ｄ与 Ａ，Ｃ，Ｅ相
比，具有更强的抑制肝癌细胞增殖作用，因此选用
Ｄ（９０％的乙醇洗脱部位）进行后续实验研究。通
过碘化丙啶（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ，ＰＩ）染色，作者应用
流式细胞术检测了 Ｄ对肝癌细胞周期的影响。通
常可以用细胞增殖指数ＰＩ（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｄｅｘ）作为
衡量细胞增殖的指标，所谓的 ＰＩ就是处于 ＤＮＡ合
成期及有丝分裂期的细胞在全部细胞中所占比
例，用公式表示为：ＰＩ＝［（Ｓ＋Ｇ２／Ｍ）／（Ｇ０／Ｇ１＋Ｓ
＋Ｇ２／Ｍ）］×１００％。ＨｅｐＧ２细胞经 Ｄ处理后，处
于 Ｇ０／Ｇ１期的细胞数量明显增多，与对照组比较差
异显著（表２），说明 Ｄ具有抑制 ＨｅｐＧ２细胞增殖
的潜势。
０２
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表２ 白首乌９０％乙醇洗脱部位对ＨｅｐＧ２细胞增殖的抑制作用（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３） ％
处理 Ｇ１ Ｓ Ｇ２ ＰＩ
对照 ４５７９±２２ ３２０４±２５ ２３２１±１６ ５２１８±１１
９０％洗脱部位（Ｄ） ６０１４±２７１） ２４０６±１４１） １７０１±０８１） ４０９４±０９２）
２．３ Ｄ诱导ＨｅｐＧ２细胞凋亡
据文献报道，白首乌中Ｃ２１甾体苷能够促进肝癌
细胞凋亡，那么Ｄ对肝癌细胞的凋亡是否也有诱导
活性呢？因此采用了 ＡｎｎｅｘｉｎⅤＦＩＴＣ法检测 Ｄ对
肝癌细胞ＨｅｐＧ２凋亡的影响。结果表明，ＨｅｐＧ２细
胞经Ｄ处理后，细胞呈凋亡趋势，且凋亡诱导作用
呈剂量依赖关系（表３）。
表３ 白首乌９０％乙醇洗脱部位诱导ＨｅｐＧ２
细胞凋亡（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）
剂量
／ｍｇ·Ｌ－１
细胞状态／％
正常细胞 早期凋亡细胞 晚期凋亡与坏死细胞
０（对照） ８８０４±３１ ６９８±１０ ４３２±０３
５０ ８５１４±２６ １０４６±１８ ４４６±０３
１００ ７５３６±２４１） ２０１６±２１１） ２１７±０４
１５０ ６７２０±１９２） ２８４７±２１２） ３３５±０２
２００ ６０１０±２７２） ３６２４±１９２） ３３７±０３
２．４ Ｄ对ＭＡＰＫ信号途径的影响
促细胞分裂原活化蛋白激酶（ＭＡＰｋｉｎａｓｅ）是一
类丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，可改变转录因子的磷酸
化状态而参与细胞增殖、凋亡和分化等生理过程的
调控。为了进一步研究 Ｄ促进肝癌细胞凋亡的可
能分子机制，采用免疫印迹实验检测不同浓度 Ｄ对
ＨｅｐＧ２细胞外信号调节的蛋白激酶（ＥＲＫ）、ｃＪｕｎ
氨基端激酶（ＪＮＫ）／应激激活蛋白激酶（ＳＡＰＫ）和
ｐ３８ＭＡＰＫ磷酸化水平的影响。免疫印迹结果显示
（图３），Ｄ具有促进 ＪＮＫ１磷酸化的活性，同时抑制
ＥＲＫ的磷酸化，ｐ３８的磷酸化水平未见明显变化，暗
示Ｄ可能通过调节ＪＮＫ和ＥＲＫ之间磷酸化水平的
平衡实现对肝癌细胞的增殖与凋亡的调控。
３ 讨论
本实验以泰山产白首乌为实验材料，将其醇提
物过大孔吸附树脂后，发现５０％和９０％的乙醇洗脱
部位均具有抑制肝癌细胞ＨｅｐＧ２的活性，前者所含
化学成分定性实验表明主要含有甾体类，有文献报
道甾体是白首乌抗肿瘤的有效部位［８］。对于９０％
的洗脱部位，未见相关的研究，因此本实验主要探讨
白首乌９０％的乙醇洗脱部位抗肿瘤作用及其机制，
１．未处理对照组；２．５０ｍｇ·Ｌ－１；３．１００ｍｇ·Ｌ－１；
４．１５０ｍｇ·Ｌ－１。
图３ 免疫印迹检测白首乌９０％乙醇洗脱部位对ＭＡＰＫ
途径相关蛋白表达水平的影响
为进一步综合利用白首乌提供实验基础。
本研究结果显示，当ＨｅｐＧ２细胞用高浓度９０％的乙
醇洗脱部位处理后，细胞增殖受到抑制，处于 Ｇ０／Ｇ１
期的细胞数量明显增加。ＡｎｎｅｘｉｎⅤＦＩＴＣ双染结果
证实，９０％乙醇洗脱部位还具有诱导 ＨｅｐＧ２细胞凋
亡的活性，这可能与其调节 ＭＡＰＫ信号通路成员
ＥＲＫ和ＪＮＫ的磷酸化水平相关。ＭＡＰＫ信号转导
通路是近年来细胞信号转导方面非常活跃的研究领
域，该信号通路具有调控肿瘤细胞增殖与分化等功
能，ＥＲＫ（Ｐ４２／Ｐ４４ＭＡＰＫ），ＪＮＫ／ＳＡＰＫ，ｐ３８ＭＡＰＫ３
条通路与肿瘤的发生密切相关［９１０］。ＥＲＫ通路主要
被分裂原激活，活化的ＥＲＫ可转入细胞核内并磷酸
化转录因子ｃＪｕｎ，ｃＦｏｓ，ｃＭｙｃ等多种因子，调控相
关基因的表达，从而促进细胞的增殖和抑制细胞凋
亡［１１１２］。而ＪＮＫ／ＳＡＰＫ通路能被包括肿瘤坏死因
子（ＴＮＦ）在内的多种胞外刺激而激活，是细胞增殖
与凋亡的重要调控分子。通常认为，当 ＪＮＫ被磷酸
化激活后，即可调控下游靶基因的表达或靶蛋白的
活性而介导细胞凋亡［１３］。
总之，白首乌醇提物具有抑制肝癌的活性，可促
进ＨｅｐＧ２肝癌细胞凋亡。但９０％的乙醇洗脱部位
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中究竟含有哪些成分，以及何种化合物对肝癌的抑
制起主要作用则需要进一步的实验研究。
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ＥｆｅｃｔｓｏｆｒｏｏｔｏｆＣｙｎａｎｃｈｕｍｂｕｎｇｅｉｅｔｈａｎｏｌｉｃｅｘｔｒａｃｔｏｎ
ｈｅｐａｔｏｍａＨｅｐＧ２ｃｅｌｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓ
ＦＥＩＨｏｎｇｒｏｎｇ１，ＷＡＮＧＬｉｍｅｉ１，ＷＡＮＧＦｅｎｇｚｅ２
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｔａｉａｎ２７１０１６，Ｃｈｉｎａ；
２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ＴａｉｓｈａｎＭｅｄｉｃａｌｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉａｎ２７１０１６，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｅｃｔｏｆａｎｅｔｈａｎｏｌｉｃｅｘｔｒａｃｔｆｒｏｍＣｙｎａｎｃｈｕｍｂｕｎｇｅｉ（ＣＤＴ）ｏｎｈｅｐａ
ｔｏｍａＨｅｐＧ２ｃｅｌｓｉｎｖｉｔｒｏｗａｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．ＭＴＴｍｅｔｈｏｄｗａｓｅｍｐｌｏｙｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔＨｅｐＧ２ｃｅｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｍｅｔｈｏｄｗａｓ
ｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｃｅｌｃｙｃｌｅｓ．ＡｎｎｅｘｉｎⅤＦＩＴＣａｐｏｐｔｏｓｉｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎｋｉｔｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｃｅｌｓ．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｗａｓｅｍｐｌｏｙｅｄ
ｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＥＲＫ，ＪＮＫ１，ａｎｄｐ３８．ＷｅｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔＣ．ｂｕｎｇｅｉｅｘｔｒａｃｔｃｏｕｌｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅ
ｇｒｏｗｔｈｏｆＨｅｐＧ２ｃｅｌｓ．ＡｎｎｅｘｉｎＦＩＴＣａｐｏｐｔｏｓｉｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎｋｉｔａｎｄｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＣ．ｂｕｎｇｅｉｅｔｈａｎｏｌｉｃｅｘｔｒａｃｔｃｏｕｌｄ
ｉｎｄｕｃｅｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆＨｅｐＧ２，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｎｈｉｂｉｔｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｄｕｃｅｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｍａｙｖｉａｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｐｈｏｓ
ｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｂａｌａｎｃｅｏｆＥＲＫａｎｄＪＮＫ．Ｉｎｓｕｍｍａｒｙ，Ｃ．ｂｕｎｇｅｉｅｔｈａｎｏｌｉｃｅｘｔｒａｃｔｃａｎｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＨｅｐＧ２ｃｅｌａｎｄｉｎｄｕｃｅ
ｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｃｅｌｓｖｉａｔｈｅｐａｔｈｗａｙｏｆＭＡＰＫ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｃｙｎａｎｃｈｕｍｂｕｎｇｅｉ；ｅｔｈａｎｏｌｉｃｅｘｔｒａｃｔ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ｈｅｐａｔｏｍａ；ＭＡＰＫ
［责任编辑 张宁宁］
２２
第３４卷第２１期
２００９年１１月
Ｖｏｌ．３４，Ｉｓｓｕｅ ２１
Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２００９