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Regulating effects of Paecilomyces cicadae polysaccharides on immunity of aged rats

蝉拟青霉多糖对老年大鼠免疫功能的调节作用



全 文 :蝉拟青霉多糖对老年大鼠免疫功能的调节作用
杨介钻1,卓 佳2,陈柏坤2,金丽琴3,吕建新2,李兰娟1
(1.浙江大学 医学院 附属第一医院 传染科,卫生部传染病重点实验室,浙江 杭州 310003;
2.温州医学院 生命科学学院,浙江 温州 325023;
3.温州医学院 生物化学教研室,浙江 温州 325023)
[摘要] 目的:研究蝉拟青霉水提物多糖对老龄大鼠免疫功能的调节作用。方法:以生理盐水处理的10~12
周龄SD青年大鼠、18月龄SD老龄大鼠为对照组,实验组以不同剂量蝉拟青霉水提物多糖(50,100,200mg·kg-1
·d-1)处理老龄大鼠3周,观察对照组、实验组大鼠腹腔、肺泡巨噬细胞对葡萄球菌的吞噬作用;以MTT法检测大
鼠脾组织细胞分别在刀豆蛋白A(ConA),磷酸脂多糖(LPS)诱导下的淋巴细胞增殖活性;同时检测大鼠脾组织细
胞内酸性磷酸酶(ACP),乳酸脱氢酶(LDH),精氨酸酶(ARG)等酶活力,并于透射电镜下观察大鼠脾组织超微结
构。结果:与青年组比较,老龄组大鼠巨噬细胞的噬菌能力及脾组织淋巴细胞的增殖反应显著降低(P<001),脾
细胞内ACP,LDH,ARG等酶活力也显著低下(P<001)。各种剂量蝉拟青霉多糖作用3周后老龄大鼠的这些指标
均有改善,脾组织超微结构显示线粒体、内质网结构明显且数量增多。结论:蝉拟青霉水提物多糖能提高老龄大鼠
腹腔、肺泡巨噬细胞吞噬功能和脾细胞免疫功能及增殖反应能力,使老龄大鼠低下的免疫功能得以改善,可能具有
一定的抗衰老作用。
[关键词] 蝉拟青霉;多糖;巨噬细胞;增殖反应;免疫功能
[中图分类号]R285.5 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)03029205
[收稿日期] 20070310
[基金项目] 浙江省教育厅科研基金(20020471);国家973计
划(2003CB515506)
[通讯作者] 李兰娟,Tel:(0571)87236756,Email:ljli@zjw
st.gov.cn
  蝉拟青霉 Paecilomycescicadae(Miquel)Samson
是麦角菌科 Clavicipitaceae真菌蝉棒束孢菌及其寄
主山蝉幼虫的干燥复合体,又称蝉花P.cicadae。医
学家们认为蝉花是一种与冬虫夏草相近(与冬虫夏
草的无性型同属)的珍贵药材。有关文献记载[1],
蝉花性寒味甘,具散风热、定惊、镇痛解痉等功效。
蝉拟青霉水提物之一蝉拟青霉多糖(paecilomyces
cicadaepolysaccharide,PCPS)能改善大鼠的营养状
况并能提高机体的非特异性免疫功能[2,3];同时对
老龄大鼠组织器官的免疫功能和外周血脂含量具有
一定的调节作用[4,5]。本实验拟就 PCPS对老龄大
鼠的肺泡巨噬细胞(alveolarmacrophages,AMφ)、腹
腔巨噬细胞(peritonealmacrophages,PMφ)的吞噬
功能,对脾淋巴细胞增殖反应的影响进行检测,同时
研究了 PCPS对大鼠脾细胞内酸性磷酸酶(acid
phosphatase,ACP)、乳酸脱氢酶(lactatedehydrogen
ase,LDH)、精氨酸酶(arginase,ARG)等酶活力及脾
细胞超微结构的影响。
1 材料
1.1 主要试剂 刀豆蛋白 A(ConA)、脂多糖
(LPS)及四噻唑盐(MTT)均购自美国 Sigma公司;
RPMI1640培养基(GIBCOBRL公司);DTNBSwitz
erland分装;TEPSIGMA公司产品;对硝基苯酚磷酸
酯为德国 MERCK公司产品;LDH测试盒(批号
041017)由宁波慈城生化试剂厂生产;ACP测试试
剂由本室配制;胎牛血清为杭州四季清产品;其余试
剂均为国产分析纯。
1.2 蝉拟青霉及其水提物多糖制备 蝉拟青霉菌
丝体(fermentedmyceliaofPcicadae)由陈祝安研究
员(浙江省科学院亚热带作物研究所)提供。其水
提物的制备方法见文献[5],所得多糖溶液经真空
冷冻干燥后得淡褐色多糖粉末(苯酚硫酸法测定含
糖量为8413%)。取多糖粉末用无菌生理盐水配
制成50mg·mL-1溶液,经巴氏法消毒灭菌后,分装
于10mL抗生素瓶冷冻保存备用。
1.3 动物 清洁级雄性10~12周龄青年 SD大鼠
6只,体重(205±25)g,18月龄老龄SD大鼠24只,
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体重(536±29)g,均由温州医学院实验动物中心
(合格证号浙医动字第2203002号)提供。
2 方法
2.1 大鼠的分组与处理 老龄大鼠随机分为4组,
每组6只,分笼饲养,即老年对照组(给生理盐水,2
mL·kg-1),老年+PCPS高、中、低剂量组(50,100,
200mg·kg-1)。青年 SD大鼠作为青年对照组,处
理方法同老年对照组。大鼠于同一饲养室内经适应
性饲养1周后开始给药,每天在规定时间内于背部
皮下注射(sc)给药1次,5组大鼠在同等条件下持
续给药3周。
2.2 PMφ和AMφ灌洗与培养 末次给药后5~15
min,股动脉放血处死大鼠,常规消毒后于无菌室内
进行灌洗,获得的 PMφ和 AMφ用完全培养基(RP
MI1640+10%胎牛血清)培养备用,详见文献[6]。
2.3 PMφ和AMφ吞噬试验 操作参见文献[7]并
作改进。取 2.2项备用细胞(PMφ和 AMφ)用
025%胰酶消化,消化细胞用Hank’s液洗2遍后计
数,取一定量细胞滴入玻片培养小室内,加入经煮沸
处死的葡萄球菌,细胞与细菌的数量比约为1∶20。
混匀后将小室置于37℃,5%CO2湿度条件下孵育1
h后取出,用 Hank’s液洗后,用 2%戊二醛固定 3
min,瑞氏染色,油镜下计数100~200个巨噬细胞,
分别计算吞噬率[吞噬率(% )=吞噬细菌的巨噬
细胞数/计数的巨噬细胞总数 ×100%]和吞噬指数
(吞噬指数 =被吞噬的细菌总数/吞噬细菌的巨噬
细胞数)。
2.4 MTT法测定脾T,B淋巴细胞增殖反应 操作
参见文献[8]并作改进。无菌取处死后大鼠脾脏组
织,研磨后制成单细胞悬液,以083% NH4Cl溶解
红细胞,台盼蓝拒染法测定活细胞数为>95%,用完
全培养基调整脾细胞悬液的细胞密度为2×1010个/
L。于96孔细胞培养板测试孔加入ConA或LPS溶
液各50μL,然后每孔加入100μL脾细胞悬液,最
后补充完全培养液使每孔的终体积为 200μL,混
匀。ConA和LPS的终质量浓度分别为75,78mg
·L-1。培养板置于 5%CO2,37℃饱和湿度下培
养。48h后取出,每孔分别加入新鲜配制的MTT液
20μL(5mg·mL-1),继续培养,4h后取出离心
(200×g,5min)弃净孔内液体后每孔加入 DMSO
100μL,置培养箱10min,取出振荡5min,静置后于
酶标仪570nm波长测吸光度(A)值,以100μL/孔
的蒸馏水调零点。
2.5 大鼠脾细胞胞内酶活力测定 取灌洗完毕后
的大鼠,剥取大鼠脾脏,并剔除干净脏器表面的脂肪
块和结缔组织,组织块研磨后以双试剂终点法、速率
法和鸟氨酸的生成分别测定 ACP,LDH,ARG等酶
活力,参见文献[4]。
2.6 透射电镜观察脾组织超微结构 脾组织经
25%戊二醛前固定,电镜前处理后,于透射电镜下
观察。
2.7 统计学处理 利用 SPSS120软件进行数据
分析,方差分析或 t检验分析组间差异。实验数据
用 珋x±s表示。
3 结果
3.1 蝉拟青霉多糖对 PMφ,AMφ吞噬细菌能力的
影响 PMφ,AMφ吞噬功能的变化用其对葡萄球菌
的吞噬率与吞噬指数表示,与青年大鼠相比,老龄大
鼠的吞噬率、吞噬指数显著低下(P<001);而
PCPS能使老龄大鼠PMφ,AMφ吞噬率、吞噬指数得
到显著提高(P<005),且有一定的剂量效应关系,
见表1。
表1 蝉拟青霉多糖对老年大鼠PMφ,AMφ吞噬功能的影响(珋x±s,n=6)
组别
剂量
/mg·kg-1
PMφ
吞噬率/% 吞噬指数
AMφ
吞噬率/% 吞噬指数
青年对照 - 6437±363 1262±097 5182±426 993±100
老年对照 - 4428±3761) 890±0831) 3758±1761) 672±0741)
PCPS 50 4753±298 957±037 3957±2132) 787±0833)
  100 5028±3283) 1107±1543) 4327±2412) 825±1003)
  200 5328±3292) 1085±0912) 4528±2872) 833±0883)
  注:与青年对照组比较1)P<001;与老年对照组比较2)P<001,3)P<005
3.2 蝉拟青霉多糖对 ConA或 LPS诱导的大鼠脾
淋巴细胞增殖反应的影响 淋巴细胞的增殖反应能
力用A570表示。与青年组比较,在ConA或LPS诱导
后老年大鼠脾淋巴细胞的增殖反应显著降低(P<
001),而一定浓度的 PCPS作用后,经诱导的脾淋
巴细胞增殖反应有显著提高(P<001),见表2。
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表2 蝉拟青霉多糖对老年大鼠脾淋巴细胞
增殖反应的影响(珋x±s,n=6)
组别
剂量
/mg·kg-1
A570
ConA LPS
青年对照 - 053±005 065±003
老年对照 - 023±0031) 030±0031)
PCPS 50 037±0032) 041±0022)
  100 045±0042) 048±0032)
  200 047±0022) 048±0022)
  注:与青年对照组比较1)P<001;与老年对照组比较2)P<001
3.3 蝉拟青霉多糖对老龄大鼠脾组织胞内酶活性
的影响 与老龄对照组比较,老龄大鼠给药 PCPS3
周后,其脾组织胞内 ACP,LDH,ARG等酶的活力均
有显著提高(P<001),并且有一定的剂量效应关
系,见表3。
表3 蝉拟青霉多糖对老龄大鼠脾细胞胞
内酶活性的影响(珋x±s,n=6)
组别
剂量
/mg·kg-1
胞内酶活性(×10,U)
ACP LDH ARG
青年对照 - 353±41 805±96 237±33
老年对照 - 225±221) 50±231)142±211)
PCPS 50 256±20 584±32 166±18
  100 264±32 609±20 171±29
  200 272±22 624±36 182±16
  注:与青年对照组及PCPS作用各组比较1)P<001
3.4 蝉拟青霉多糖对脾组织超微结构的影响 与
青年对照组比较,老年组大鼠脾细胞核结构疏松,线
粒体结构不明显及数量减少,内质网少见。给药
PCPS3周后各组老年大鼠脾细胞的内质网丰富,线
粒体明显且数量增多,核内染色质致密。由于PCPS
作用后各组脾细胞超微结构无明显差别,故 PCPS
处理组只显示50mg·kg-1剂量组和青年、老年对
照组,见图1。
图1 PCPS对老龄大鼠脾细胞超微结构的影响
A.青年对照(×10K);B.老年对照(×6K);C.50mg·kg-1
PCPS剂量(×6K)
4 讨论
老年机体免疫功能的低下与淋巴细胞增殖功能
减弱关系较为密切,免疫功能的下降也是机体衰老
的表现特征之一。若老年机体的免疫功能提高了,
将有助于延缓机体衰老过程和老年病的防治。巨噬
细胞是机体非特异性免疫功能重要组成之一,老龄
机体免疫功能的下降也与巨噬细胞功能下降有关,
而ACP,LDH的活力是大鼠 PMφ的活力增加、巨噬
细胞的杀伤作用及数量提高的标志酶[9],ARG活力
的提高是大鼠脾内巨噬细胞活化表现之一[10]。已
有文献报道[11],多糖具有抗菌、抗病毒作用,在作者
研究中PCPS能促进巨噬细胞对葡萄球菌的吞噬作
用,且呈现一定的剂量效应关系,说明了一定浓度的
PCPS能促进机体的非特异性免疫功能,也表明
PCPS通过促进巨噬细胞的噬菌作用而具有一定的
抗感染作用,至于 PCPS可能的广泛抗感染作用或
对肿瘤细胞、病毒直接的抑制作用,还处于进一步的
研究中。
脾脏的重要组成细胞之一巨噬细胞在脾的免疫
功能中发挥着重要作用。实验结果表明 PCPS组脾
细胞内 ACP,LDH,ARG等酶活力显著高于对照组,
提示脾细胞内这些酶可能主要来自脾内 Mφ,这些
酶活力的提高说明了脾免疫功能的增强。从脾组织
细胞的超微结构发现,与对照组比较,多糖组细胞内
质网丰富,线粒体明显,核内染色质致密,这些结果
从结构上说明了多糖能提高脾 Mφ活力,增强其免
疫功能。至于PCPS对老龄大鼠胸腺胞内酶活力影
响没有显著作用(资料未列出),可能与老龄机体胸
腺已经萎缩或不同部位内 Mφ对多糖的应激性不
同,不同部位Mφ活化的标志酶差别有关[12]。
ConA或LPS能分别诱导脾内 T淋巴细胞与 B
淋巴细胞的增殖反应。与青年组比较,老龄大鼠脾
内T,B淋巴细胞的增殖能力显著低下,经皮下给药
PCPS3周后,老龄大鼠脾T,B淋巴细胞的增殖反应
显著提高,而T,B淋巴细胞是机体发挥特异性免疫
功能的主要细胞[13],从而说明 PCPS可能通过提高
T,B淋巴细胞的增殖反应而调节老龄大鼠的特异性
免疫功能。巨噬细胞作为抗原递呈细胞也参与机体
的特异性免疫,故 PCPS也可以通过巨噬细胞而调
节机体的特异性免疫功能。
综上所述,PCPS能增强老龄大鼠 Mφ的吞噬功
能以及脾脏免疫功能,其功能的提高可能是通过多糖
促进Mφ内与代谢有关酶(ACP,LDH,ARG)的活力,
提高[14]及增强脾内T,B淋巴细胞的增殖反应能力来
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实现。因此认为一定浓度的 PCPS可提高老龄大鼠
的特异性和非特异性免疫功能,从而可能具有一定的
抗衰老作用,同时可能具有一定的抗感染作用。
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(1.DepartmentofInfectiousDiseases,TheFirstAfiliatedHospital,ColegeofMedicine,ZhejiangUniversity,
KeyLaboratoryofInfectiousDiseasesMinistryofPublicHealth,Hangzhou310003,China;
2.Departmentoflifescience,WenzhouMedicalColege,Wenzhou325023,China;
3.DepartmentofBiochemistry,WenzhouMedicalColege,Wenzhou325023,China)
[Abstract] Objective:ToinvestigatetheefectsofPaecilomycescicadaepolysaccharide(PCPS)ontheimmunologicalfunction
ofagedratsinvivo.Method:Theyoungandoldratswereadministeredwithnormalsalineascontrolgroups,andtheratsfromtest
groupwerescgiven50,100,200mg·kg-1·d-1dosageofPCPSfor3weeks.ThephagocytizingrateandindexofPMφ,AMφtoS.
aureaswereobserved,andthecolorimetricMTTwasusedtoanalyzetheproliferativeactivityofspleenocyteswhichhadbeenstimulated
withConAorLPS.WealsoinspectedtheabilityvaringofACP,LDH,ARGofspleen,andobservedtheultramicrostructureofspleen
undertheSEM.Result:ThephagocytosisofMφwaslowerinagedgroupthanthatinyoung’sgroup,andtheproliferativeactivityof
spleenocyteswaslowertoo.TheactivitiesofACP,LDH,ARGofspleenwereextremelydecreased(P<001)inagedratsaswel.
TheproliferativeactivityandphagocytoticratewerebothextremelyincreasedinPCPSgroups(P<001),andthemitochondrionand
endoplasmicreticulumofspleenwereaccrementitionaswel(P<001).Conclusion:PCPScouldenhancethephagocytizingfunction
ofPMφ,AMφofagedratsinvivo,andstrengthentheimmunefunctionofspleenanditsproliferativeactivityaswel.Thentheimmu
nityofagedratscouldbeimprovedThePCPSmaybeanantiagingagent.
[Keywords] Paecilomycescicadae;polysaccharides;macrophages;proliferativeactivity;immunity
[责任编辑 古云侠]
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