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Vol.34，Issue 2
January，2009
第 34 卷第 2 期
2009 年 1 月
麦冬多糖在正常和缺血大鼠心脏分布的比较研究
林 晓 1*，卢智玲 1，2，徐德生 3，冯 怡 1
（1. 上海中医药大学，上海 201203；2. 杭州市药品检验所，浙江 杭州 310017；
3. 上海中医药大学 附属曙光医院，上海 200021）
[摘要] 目的：研究麦冬多糖在正常和缺血大鼠心脏分布差异程度，并分析差异原因，为其作用机制的确定提供进一步
的理论依据。方法：以 50 mg·kg-1剂量静脉注射给予正常组和心肌缺血组大鼠麦冬多糖，分别于给药后的 5，10，30，60 min
时间点取心脏，用 HPGPC-RF 测定多糖组织分布情况。结果：心肌缺血组除 30 min 时间点外，其余各个时间点均比正常组
的分布明显增多，且经 SPSS 软件统计有显著性差异。结论：缺血所导致的增强的透过和滞留效应（即 EPR 效应，the enhanced
permeability and retention effect）要强于血流减少对麦冬多糖分布所带来的负面影响，有利于麦冬多糖靶向心肌缺血区而发
挥其药理活性。
[关键词] 麦冬；多糖；EPR 效应；心肌缺血
21随着对多糖生物活性的深入研究和理解，多糖
已成为新药开发的重要方向之一。本课题组在对麦
冬多糖进行了多年的深入研究后，从中分离得到 1
个重均分子质量为 4.8×103，聚分散度（Mw/ Mn）
为 1.41，以 2→1 连接的呋喃型果糖为主，平均每
2.8 个主链残基上有一个 Fruf（2→6）Fruf（2→分
支）β-D-果聚糖的麦冬多糖 OJP[1]。OJP 的抗心肌
缺血作用已经从离体和整体动物药理实验及细胞
分子生物学水平进行了研究，结果表明，OJP①可
以使缺血再灌的大鼠心脏收缩幅度和冠脉流量较
快地恢复，抑制心率加快，降低缺血后血浆中乳酸
脱氢酶的释放[2]；②对缺氧心肌细胞和人微血管内
皮细胞 （HMEC-1）具有明显的保护作用和抑制其
凋亡的作用；③可上调鞘氨醇激酶 1（SPHK1）和
1-磷酸鞘氨醇受体 1（S1P1） mRNA 及其蛋白表达，
可诱导 Akt 和 ERK 磷酸化，促进 HMEC-1 迁移、
分泌碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和形成管腔。
因此，在心肌缺血时，OJP 可能是一方面通过激活
S1P/Akt/ERK 信号通路起到保护作用，增加细胞膜
的稳定性，增强细胞的存活；另一方面，促进缺血
条件下的新生血管的生成，改善缺血心肌的血液和

[收稿日期] 2008-10-10
[基金项目] 上海市青年科技启明星计划（07QA14050）；国家中医
药管理局中医药科学技术专项 (06-07ZQ04)
[通信作者] ＊林晓, Tel：(021) 51322211，E-mail：shutcm@163.com
能量供给，从而达到治疗心肌缺血的作用。而上述
作用的发挥均需要 OJP 分布于心肌缺血区。
从对麦冬多糖单次静脉注射给药后在正常大
鼠体内的组织分布研究结果来看，OJP 大多数以原
形经肾排泄，其他组织中含药量分布顺序从高到低
依次为肺、胃、心、脾、肝和脑，心脏对 OJP 有一
定的摄取能力。由于心肌缺血后一方面会导致血管
通透性增加，从而有利于大分子药物的分布；但另
一方面，组织分布多少往往与其血流量正相关，研
究缺血对麦冬多糖的心脏分布情况产生怎样的影
响，对于确证 OJP 的作用机制和指导下一步的制剂
工作有重要的意义。
1 材料
麦冬多糖 OJP（自制，重均分子质量 4.8×103）；
异硫氰酸荧光素（FITC，Sigma 公司）；盐酸异丙
肾上腺素（上海信谊制药公司）；三氯乙酸（分析
纯，国药集团化学试剂有限公司）；氢氧化钠（分
析纯，上海试剂四厂）；磷酸二氢钠（分析纯，上
海新华化工厂）；磷酸氢二钠（分析纯，国药集团
化学试剂有限公司）；三蒸水（实验室自制）。
LC-20AB 高效液相色谱仪和 RF-10AXL 荧光
检测器（日本 Shimadzu 公司）；5417R 高速冷冻离
心机（德国 Eppendorf 公司）；F6/10 超细匀浆器（上
海弗鲁克流体机械制造有限公司）；QL-9010 旋涡混
合器（江苏麒麟医用仪器厂）；电子天平（上海梅


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特勒-托利多仪器有限公司）；Power lab 8/30 心电图
机（澳大利亚 ADinstruments 公司）。
SD 大鼠，雄性，(250±50) g，7~8 周龄，上海
中医药大学动物试验中心提供，合格证号 SCXK
（沪）2003-0002。
2 方法
2.1 OJP 的 FITC 标记
参照文献方法[3]进行，并作适当的调整和改进。
取麦冬多糖 OJP 1 g 溶于含 10 滴吡啶的 10 mL 二甲
亚砜中，加入 0.1 g FITC 和 20 mg 二丁基二月桂酸
锡，密闭，95 ℃反应 1 h，取出，冷却至室温，加
10 倍体积的氯化钠饱和无水乙醇，所得沉淀经乙醇
洗涤数次，至游离 FITC 完全洗净。
2.2 FITC-OJP 组织样品高效凝胶过滤色谱分析方
法的建立
2.2.1 色谱条件 色谱柱 Shodex Sugar ks-802（日
本昭和电工）；流动相 0.1 mol·L-1 NaH2PO4-Na2HPO4
缓冲液（pH 7.0）；流速 0.5 mL·min-1；荧光检测波
长激发波长 495 nm，发射波长 515 nm；柱温 25 ℃；
进样量 20 µL。
2.2.2 组织样品的预处理[4] 取心脏组织样品约 0.5
g，精密称定，加入 3 倍体积的 0.1 mol·L-1 pH 7.0 磷
酸盐缓冲液，制备匀浆。将 80 µL 30％三氯乙酸加于
200 µL 25％组织匀浆液中，混合物涡旋，并以 10 000
r·min-1离心 10 min，取上清液 100 µL，加入 15 µL 11
％NaOH 和 85 µL 流动相，再以 10 000 r·min-1转速离
心 10 min 后，取上清液 HPGPC-RF 测定。
2.2.3 专属性考察 取大鼠心脏空白组织匀浆液
200 µL，配制成含有一定量 FITC-OJP 的空白组织
匀浆液，将其与等量空白组织匀浆液分别按 “组织
样品预处理”方法操作后，于上述色谱条件下，测
定各样品的 HPGPC 色谱图。
2.2.4 组织样品标准曲线 取 FITC-OJP 适量，精
密称定，以 pH 7.0 磷酸盐缓冲液为介质，配成 0.55
g·L-1 的母液。取母液逐步稀释，得到 2.75，5.50，
11.0，27.5，55.0，110，220 mg·L-1 的 FITC-OJP 对
照品溶液。分别取上述系列对照品溶液 20 µL，加
入到 200 µL 心脏组织空白匀浆液中，配成相应线性
范围内的一系列浓度溶液，按 “组织样品预处理”
方法进行处理后测定。按加权（1/C2）最小二乘法，
以所得的峰高 H 对质量浓度 C 进行线性回归运算，
得到组织中 FITC-OJP 含量测定标准曲线。
2.2.5 回收率测定 取大鼠空白组织匀浆液 200
µL，分别加入适量高、中、低浓度的对照品溶液，
每种浓度 5 份样品，按 “组织样品预处理”方法进行
处理后测定，代入标准曲线求得实测浓度，与理论
浓度相比得到方法回收率。
2.2.6 精密度测定 取大鼠空白组织匀浆液 200
µL，分别加入适量高、中、低浓度的对照品溶液，
各 5 份。按 “组织样品预处理”方法操作后，在上述
色谱条件下，于 1 d 内进行含量测定，根据标准曲
线计算样品中 FITC-OJP 浓度并计算得日内差；连
续 5 d 进行测定，得到日间差。
2.3 心肌缺血模型的制备
取健康雄性 SD 大鼠 20 只，造模前用乙醚麻醉
后，用心电图机观察其心电图，均正常。每天皮下
注射 8 mg·L-1 盐酸异丙肾上腺素（1 μL·g-1），连续 2
d，至第 3 天再用乙醚麻醉后，心电图机检测，ST
段明显抬高或降低，提示造模成功。
2.4 组织分布研究
取正常组和心肌缺血模型组的 SD 大鼠各 20
只，分别随机分成 4 组，自由进食和饮水，以 50
mg·kg-1 的剂量经大鼠股静脉注射给药，分别于给药
后 5，10，30，60 min 用腹主动脉放血的方法处死
大鼠（5 只/时间点），迅速取出心脏并用生理盐水
冲净表面血液，分别称量脏器湿重，装入自封袋，
置于–20 ℃冰箱中保存直至分析测定。
3 结果
3.1 麦冬多糖 OJP 的 FITC 标记
通过用荧光分光光度法测定乙醇洗液的荧光
强度发现反应产物经过 9 次醇洗后可将其中游离的
FITC 完全洗除（图 1）。3 批标记物测得的荧光取代
度为 0.003 5±0.000 9。采用“2.2.1”项所述的高效凝
胶过滤色谱条件对自制的 FITC-OJP 的纯度进行了
测定（图 2）。结果表明，FITC-OJP 仍为对称的单
一锐峰，保留时间和峰形与OJP相比基本没有差异，
表明反应没有引起 OJP 糖链的断裂。而且在所用的
色谱分析方法下，游离的 FITC 不会对标记物的测
定产生干扰。从对部分酸水解的标记物的测定结果
来看，所用色谱分析方法还可以区分原型标记物和
其降解产物。标记物在血浆中的稳定性研究结果表
明其在实验时间内是稳定的。


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图 1 FITC 与 OJP 反应所得产物的醇洗次数与
醇洗液荧光强度的关系


A.40 mg·L-1 FITC；B. 1.9 40 mg·L-1 FITC-OJP；C. FITC-OJP
酸水解产物。
图 2 FITC，FITC-OJP 及其水解产物的高效
凝胶过滤色谱图

3.2 FITC-OJP 组织样品分析方法的确证
3.2.1 方法专属性考察 心脏组织样品分析方法专
属性测定结果表明，在上述色谱条件下分析，组织
中内源性物质不会干扰 FITC-OJP 的测定。
3.2.2 标准曲线 以药物质量浓度 C 为横坐标，峰
高 H 为纵坐标，用加权（1/C2）最小二乘法进行回
归 计 算 ， 得 回 归 方 程 为 H=14 071C+708.74
（r=0.998 9），说明 FITC-OJP 在 0.25~20 mg·L-1 线
性良好。
3.2.3 方法的精密度与回收率 方法的精密度与
回收率均能够满足生物样品测定的要求（表 1）。
表 1 精密度回收率测定结果（ ±x s ，n=5）
RSD/% 回收率/% 加入量
/mg·L-1 日内差 日间差 平均值 RSD/%
0.250 6.80 5.14 96.90±3.1 3.21
1.00 4.37 5.12 104.0±6.2 4.04
10.0 3.01 4.44 98.30±5.0 5.13
3.3 组织分布比较
从直观上分析，心肌缺血组各个时间点的心脏
OJP 分布量均比正常组的要多。SPSS 软件统计结果
表明，除 30 min 时间点外，其余各时间点的分布均
比正常组的明显增多且有显著性差异（P<0.05），尤
其是 5 min时间点的差异极其显著（P <0.01）（表2）。
表 2 OJP 在正常组和心肌缺血组大鼠心脏
分布的比较 （ ±x s ，n=5)
取样时间/min 正常组 心肌缺血组
5 7.650±1.066 13.704±2.1692)
10 4.673±0.398 9.844±2.8161)
30 3.316±1.717 5.810±1.635
60 1.111±0.320 2.861±1.1561)
注：与正常组比较 1)P<0.05，2)P <0.01。

4 讨论
生理和病理状态下的药物分布常常具有显著
的差别。此时，研究病理状态时的药物分布对于正
确了解药物的体内行为和实际作用情况显得尤其
重要。从本研究结果来看，缺血所导致的增强的透
过和滞留效应（即 EPR 效应）要强于血流减少对其
分布所带来的负面影响，可促进麦冬多糖靶向心肌
缺血区而发挥其药理活性。
EPR 效应广泛地存在于多种病变部位，如肿
瘤、缺血区和炎症部位，是大分子药物及其胶粒载
药系统被动靶向的病理生理学基础。但各种病变产
生 EPR 效应的原因有所不同，（如血管内皮生长因
子）产生等原因，导致毛细血管内皮细胞通透性增
加；②胞质和线粒体 Ca2＋过载，膜磷脂酶在 Ca2＋
介导下被激活，引起膜磷脂被降解而导致膜功能出
现紊乱；③缺血区血流减少（约为正常心肌的 1/10），
从而使得药物在缺血区的滞留时间延长等原因造
成的[5-7]。缺血区 EPR 效应的大小主要取决于待分
布粒子或分子的荷电情况和流体动力学体积。由于
缺血区细胞表面呈负电性，故粒子或分子大小相等
时，荷正电可促进其 EPR 效应，反之亦然。而尺寸
依赖性是 EPR 效应最显著的特点。荷负电的 7~20
nm 的 PEG-PE 胶束可产生高于 120~150 nm 长循环
脂质体和等同于抗肌球蛋白抗体靶向的长循环脂
质体的心肌缺血区分布的研究结果不仅证实 EPR
效应是这种分布的主要机制，同时也说明粒子或分


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子的流体动力学体积比它们的荷电情况对这种分
布的影响更为显著[7]。
尽管缺血造成的 EPR 效应可以显著增加麦冬
多糖 OJP 在心肌缺血区的分布，但是由于 OJP 亲水
的结构和小于肾小球截留值[对于蛋白、聚乙烯吡咯
烷酮、葡聚糖、聚乙二醇和 N-（2-羟丙基）甲基丙
烯酰胺该值分别为 60~70，25，50，30，45×103]
的相对分子质量，使得其快速以原形经肾排泄，血
浆消除半衰期仅约 18 min[8]。故要想充分利用缺血
区的 EPR 效应来进一步提高它在心肌缺血区的靶
向分布，就必需想办法显著延长其血浆消除半衰
期。制备长循环胶态载药系统和结构修饰（如聚乙
二醇修饰）是目前常采用的解决这一问题的办法。
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japonicus polysaccharide in plasma by HPLC with modified
postcolumn fluorescence derivatization [J]. Anal Biochem，2005，
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Comparison of distribution of Ophiopogon Japonicas polysaccharide in
hearts of normal rats and myocardial ischemic rats

LIN Xiao1，LU Zhi-ling1，2，XU De-sheng3，FENG Yi1*
（1. Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China；2. Hangzhou drug control institute，Hangzhou
310017，China；3. Affiliated Shuguang Hospital of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，
Shanghai 200021，China）

[Abstract] Objective：To investigate the distribution of Ophiopogon Japonicas polysaccharide （OJP) in hearts of normal rats
and myocardial ischemic rats，and obtain the further evidences for determining the mechanism of its anti-myocardial ischemia.
Method：Hearts of normal and myocardial ischemic groups were obtained at 5，10，30 and 60 min after once intravenous
administration of OJP with the dose of 50 mg/kg. The concentration of OJP in samples was subsequently determined by HPGPC with
a fluorescence detector. Result：The distribution of OJP in hearts of myocardial ischemic rats was much more than that in normal
groups at all the sampling times. Moreover，the differences were proved to be significant by SPSS software with the exception of the
situation in the 30 min sampling time. Conclusion：The enhanced permeability and retention effect caused by ischemia can overcome
the negative effect of the reduction of blood flow on the distribution of OJP from blood into myocardial ischemic zones and actually
help OJP target myocardial ischemic zones where it can exert its pharmacological effect directly.
[Key words] Ophiopogon Japonicas；polysaccharide；enhanced permeability and retention effect；myocardial ischemia
[责任编辑 刘 ]