全 文 :我国青蒿初选核心种质的构建
彭锐,钟国跃,李隆云,陈大霞,吴叶宽,崔广林
(重庆市中药研究院 重庆市中药良种选育与评价工程技术研究中心,重庆 400065)
[摘要] 目的:构建青蒿初选核心种质。方法:比较青蒿形态性状描述和 SRAP分子标记相结合。结果:青蒿素含量、株
高等8个形态标记性状的平均数、标准差、方差、变异系数等参数,与青蒿初始种质基本一致;观测等位基因数、有效等位基因
数、Nei’s遗传多样性指数和Shannon’s信息指数等SRAP分子标记参数在001水平上与初始种质差异不显著。结论:本研
究的青蒿初选核心种质能够代表初始种质的遗传多样性。
[关键词] 青蒿;初选核心种质;初始种质;遗传多样性
[收稿日期] 20090402
[基金 项 目] 国 家 科 技 支 撑 计 划 项 目 (2006BAI09B024,
2006BAI09B014)
[通信作者] 彭锐,博士,副研究员,主要从事中药材安全、栽培与
生物 技 术 研 究,Tel:(023)89029186,Email:rpeng5572@ ya
hoocomcn
中药青蒿味苦、辛,性寒,具有清热解暑、除
蒸、凉血、截疟等功效,为菊科植物黄花蒿 Artemi
siaannuaL.的干燥地上部分。从青蒿中分离出
的青蒿素在临床上治疗疟疾具有速效、毒副作用
低而成为我国首创的抗疟新药[1]。近年来,由于
化学合成药的抗药性,以青蒿素为原料的复方制
剂被世界卫生组织(WHO)推荐作为一线抗疟
药。我国青蒿从海拔 50m的沿海地带至海拔 3
650m的青藏高原均有分布,生态型种多样,野生
青蒿资源分布零散,产量不稳定,青蒿素含量随
产地不同差异极大[24]。以前,我国青蒿素的生
产主要靠野生资源,随着青蒿素需求量不断增
加,仅靠野生青蒿已不能满足市场需要,因此,从
青蒿资源中选择优良性状,构建青蒿核心种质的
工作具有十分重要的现实意义。
核心种质(corecolection)是用一定的方法选择
整个种质材料的一部分,以最小的材料数量和遗传
重复来最大程度地代表整个种质材料的多样性[5]。
药用植物种质资源是中药生产的源头,种质资源是
进行中药材品种改良和新品种培育的物质基础。建
立核心种质,不仅可以提高种质库中种质的利用效
率,而且有利于种质管理、新种质收集、种质创新及
种质资源的深层研究。本研究利用 UPGMA法(un
weightedpairgroupwithmathematicaverage),对收集
的63份青蒿资源进行逐步聚类分析,构建了我国青
蒿资源初选核心种质,结合SRAP分子标记技术,并
对初选核心种质的代表性进行了检验,以期为青蒿
资源保存、有效利用和新品种选育提供参考。
1 材料
2007年8月实地调查并收集全国青蒿产地的
野生青蒿资源63份,见表1。
表1 供试青蒿资源材料
No 来源 No 来源 No 来源
1 重庆巴南 22 广西蒙山 43 四川岳池
2 重庆万盛 23 广西荔蒲 44 四川南充
3 重庆綦江 24 广西阳朔 45 四川盐亭
4 贵州桐梓 25 广西龙胜 46 四川梓潼
5 贵州遵义 26 湖南靖州 47 四川三台
6 贵州息烽 27 湖南洪江 48 四川中江
7 贵州平坝 28 湖南麻阳 49 四川都江堰
8 贵州关岭 29 湖南凤凰 50 四川眉山
9 贵州晴隆 30 贵州铜仁 51 四川乐山
10 云南昆明 31 贵州松桃 52 四川荣县
11 广西新于 32 重庆秀山 53 四川隆昌
12 广西靖西 33 重庆酉阳 54 重庆荣昌
13 广西大新 34 重庆黔江 55 重庆永川
14 广西崇左 35 湖北咸丰 56 重庆渝北
15 广西合浦 36 湖北建始 57 河南郑州
16 海南海口 37 重庆奉节 58 河南鹤壁
17 海南定安 38 重庆武隆 59 北京北望山
18 海南琼中 39 重庆彭水 60 河北安国
19 海南兴隆 40 重庆丰都 61 山东宁阳
20 广东雷州 41 重庆丰都 62 山东青岛
21 广西芩溪 42 重庆长寿 63 天津
2 方法
21 初选核心种质的构建
以8个标记性状建立63份资源的数据矩阵,
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标记性状包括青蒿素含量、株高、冠幅、分枝数、
地上部鲜重、叶鲜重、叶鲜重占地上部鲜重比率、
节间距,形态性状数据从产地测定,青蒿素含量
室内测定(HPLC),计算上述变异性状的总体平
均数(珚X)和标准差(σ)。将材料分为10组,从第
1组(Xi<珚X-2σ)到第 10组(Xi>珚X+2σ),每
05标准差为一组,每一组的相对频率用于计算
多样性指数(表2,3)。
表2 青蒿形态性状等级划分标准
组别
株高
/cm
冠幅
/cm2
分枝数
地上部鲜重
/g
叶鲜重
/g
节间距
叶占鲜重比
率/%
青蒿素质量
分数/%
1 X<43.20 X<-2823.1 X<20.5 X<-81.5 X<-16.6 X<1.50 X<0.15 X<0.71
2 43.20≤X<66.39 -2823.1≤X<-985.0 20.5≤X<27.6-81.5≤X<-32.2 -16.6≤X<-2.9 1.50≤X<1.83 0.15≤X<0.21 0.71≤X<2.24
3 66.39≤X<89.57 -985.0≤X<853.1 27.6≤X<34.6 -32.2≤X<17.0 -2.9≤X<10.7 1.83≤X<2.15 0.21≤X<0.27 2.24≤X<3.76
4 89.57≤X<112.76 853.1≤X<2691.2 34.6≤X<41.7 17.0≤X<66.2 10.7≤X<24.4 2.15≤X<2.47 0.27≤X<0.32 3.76≤X<5.29
5 112.76≤X<135.94 2691.2≤X<4529.3 41.7≤X<48.7 66.2≤X<115.4 24.4≤X<38.1 2.47≤X<2.79 0.32≤X<0.38 5.29≤X<6.82
6 135.94≤X<159.13 4529.3≤X<6367.4 48.7≤X<55.8 115.4≤X<164.6 38.1≤X<51.8 2.79≤X<3.11 0.38≤X<0.44 6.82≤X<8.35
7 159.13≤X<182.31 6367.4≤X<8205.5 55.8≤X<62.8 164.6≤X<213.8 51.8≤X<65.4 3.11≤X<3.43 0.44≤X<0.49 8.35≤X<9.88
8 182.31≤X<205.50 8205.5≤X<10043.6 62.8≤X<69.9 213.8≤X<263.0 65.4≤X<79.1 3.43≤X<3.75 0.49≤X<0.55 9.88≤X<11.40
9 205.50≤X<228.68 10043.6≤X<11881.7 69.9≤X<76.9 263.0≤X<312.2 79.1≤X<92.8 3.75≤X<4.07 0.55≤X<0.6111.40≤X<12.93
10 X≥228.68 X≥11881.7 X≥76.9 X≥312.2 X≥92.8 X≥4.07 X≥0.61 X≥12.93
表3 青蒿核心种质和初始种质各等级的分布频率
组别
株高 冠幅 分枝数 地上部鲜重 叶鲜重 节间距 叶占鲜重比率 青蒿素含量
初始 初选 初始 初选 初始 初选 初始 初选 初始 初选 初始 初选 初始 初选 初始 初选
1 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 002 000 000 000
2 007 000 000 000 010 000 000 000 000 000 005 005 005 005 003 005
3 013 015 011 005 003 005 007 000 010 005 008 010 007 010 018 015
4 008 010 028 035 021 025 028 035 023 025 025 015 008 005 011 010
5 018 015 016 020 018 015 026 025 026 035 016 015 030 035 018 000
6 031 020 022 010 016 010 023 020 023 015 018 025 025 015 016 000
7 010 010 008 010 018 020 007 005 005 005 015 015 011 010 020 030
8 005 010 005 005 007 005 003 005 007 010 005 005 007 015 010 030
9 005 005 002 000 002 005 000 000 003 000 005 010 002 000 000 000
10 003 005 008 010 005 010 007 005 003 005 003 000 005 005 003 010
在核心种质构建过程中,采用 DPS(version
85)分析软件进行排序和聚类分析。青蒿不同形
态性状的量纲是不同的,为排除不同性状的量纲影
响,本研究采用马氏距离(Mahalanobisdistances)计
算方法计算品种间的距离,采用系统聚类法中的不
加权类平均法(UPGMA)聚类,根据树型图,将相似
性系数最大的2个种质删除1份,剩余种质再聚类,
再从遗传相似性系数最大的成对种质中删除1份。
以此类推,直到代表性或核心种质量达到要求,组成
核心群体,选取初始种质量的30%左右构成初选核
心种质。
22 核心种质的检测
利用基初始种质和初选核心种质的性状的各自
平均值、最大值、最小值、标准差、变异系数和多样性
指数[6]检测核心种质的遗传变异与基础收集品的
符合率以及核心种质的代表性(表4)。
SRAP分子标记中 DNA提取、SRAP引物、PCR
反应与电泳检测和数据分析等参照陈大霞等[7]的
方法。根据 SRAP谱带标记每个位点,以1和0记
录等位基因的有和无,获得矩阵。用PopGen32软件
分别计算初始种质和初选核心种质的多态性位点
数、多态性位点百分率、观测等位基因数、有效等位
基因数、Nei′s遗传多样性指数和 Shannon′s信息指
数,并对所得到的数据分别进行t测验。
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表4 青蒿初选核心种质和初始种质植株形态及青蒿素含量的差异分析
青蒿性状
平均值 最大值 最小值 变幅 标准差
初始 初选 初始 初选 初始 初选 初始 初选 初始 初选
株高/cm 135.9 142.9 268.3 251.0 47.8 72.3 220.5 178.7 46.37 47.78
冠幅/cm2 4529.3 4457.7 14650.0 14650.0 109.0 780.0 14541.0 13870.0 3676.2 3879.2
分枝数 48.7 52.2 85.1 85.1 20.6 33.6 64.5 51.5 14.1 14.8
地上部鲜重/g 115.4 115.9 50 6.9 454.8 5.1 34.1 501.8 420.6 98.4
叶鲜重/g 38.1 40.1 160.2 160.2 2.0 7.4 158.3 152.9 27.4 33.1
节间距/cm 3.46 2.12 5.15 3.8 1.69 1.72 3.46 2.12 0.64 0.60
叶占鲜重比率/% 0.38 0.39 0.69 0.66 0.01 0.20 0.68 0.46 0.11 0.11
青蒿素含量/% 0682 0881 1562 1562 0170 0170 1392 1392 0306 0382
3 结果与分析
31 初选核心种质的构建
对收集的63份青蒿资源运用不加权类平均法
(UPGMA)进行聚类,样品之间的距离为马氏距离,
根据树型图采用逐步聚类随机取样法取样,得到20
份资源构成核心种质,约占原种质的3175%,20份
资源的编号分别为 1,5,13,15,16,17,24,25,28,
29,30,32,33,38,47,49,52,57,60,62。
32 核心种质的检验
321 青蒿性状的差异性分析 植株形态和有效
成分含量是描述中药材种质的基本特征性状,对全
国青蒿种质资源的各性状指标差异分析结果表明,
各性状指标在产地间均有显著差异,各性状在不同
产地的变化幅度均较大。青蒿株高的变化从
478~2683cm,极差达2205cm,平均1359cm;
叶鲜重的变化从20~1602g,极差达1583g,平
均381g;青蒿素变化在0170%~1562%,差异达
1392%,平均0682%。
方差分析表明,初选核心种质与初始种质类群
之间的平均值、方差均未有显著差异,而极差符合率
CR=917% >80%,符合所述2个条件,从而说明
核心种质保持了初始种质性状的遗传变异。
322 遗传多样性分析 利用 Shannonweaver
遗传多样性指数和 Simpson遗传多样性指数对构
建的青蒿初选核心种质与初始种质的遗传变异
分布情况进行比较,通过 t检验均未达到显著水
平(表5),表明核心种质能较好的代表青蒿初始
种质的多样性。
表5 青蒿核心种质与初始种质Simpson和Shannonweaver遗传多样性指数的分布情况
性状 H′T H′S Dt Ds
株高 19602 19434 08274 08400
冠幅 18577 16788 08198 07650
分枝数 19879 18775 08468 08200
地上部鲜重 16910 15099 07868 07450
叶鲜重 18029 16782 08074 07750
节间距 19896 19604 08422 08450
叶占鲜重比率 19610 18465 08198 08050
青蒿素含量 19284 16173 08436 07750
注:H′T为初始种质的Shannonweaver指数;H′S为初选核心种质的 Shannonweaver指数;Dt为初始种质的 Simpson指数;Ds为初选核心种
质的Simpson指数;初始种质数均为63,核心种质数均为20。
323 频率分布分析 对构建的青蒿核心种质与
初始种质的株高、冠幅、分枝数、地上部鲜重、叶鲜
重、叶鲜重占地上部鲜重比率、节间距、青蒿素含量
的表现型频率分布进行 χ2测验,结果表明它们之间
差异均未达到显著水平,说明两者的表现型分布基
本一致。
324 表型相关分析 构建的青蒿初选核心种
质性状间表型相关与初始种质的性状表型相关
相一致(表6),表型相关得到了保持,由此说明
构建的青蒿核心种质的选择是恰当的,控制这些
相关的相互适应的遗传复杂性得到了适当并且
充分的保持。
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表6 青蒿初选核心种质(上三角)与初始种质(下三角)性状间的表型相关系数
性状 株高 冠幅 分枝数 地上部鲜重 叶鲜重 节间距 叶占鲜重比率 青蒿素含量
株高 071591) 088181) 070481) 055782) 070401) -066021) -016250
冠幅 077401) 063611) 082151) 078831) 058191) -03701 -061721)
分枝数 085771) 066031) 062091) 048352) 03468 -070451) -01354
地上部鲜重 079981) 083671) 067741) 097211) 050132) -03026 -03798
叶鲜重 069471) 075981) 059731) 092981) 04113 -01303 -04212
节间距 072101) 059321) 037531) 062211) 049071) -03292 -01720
叶占鲜重比率 -059981)-052191) -057761) -045071) -02301 -045691) 00038
青蒿素含量 -00705 -040291) -00249 -01442 -01772 -00968 01009
注:1)表型相关P<001,2)P<005。
325 SRAP标记代表性检验 青蒿初选核心
种质 SRAP多态性位点和多态性位点百分率保
留率达到了 8663%,观测等位基因数、有效等
位基因数、Nei′s遗传多样性指数、Shannon′s信
息指数的保留率分别为 9404%,9934%,
9670%,9594%。t检验的结果表明,初始种
质 与 核 心 种 质 的 观 测 等 位 基 因 数 t值 为
10157、有效等位基因数 t值为 00986、Nei′s
遗传多样性指数 t值为01355,Shannon′s信息
指数 t值为 01880,在概率 001水平上与初
始种质差异不显著,可见核心种质能很好的代
表初始种质(表 7)。
表7 初选核心种质与初始种质分子标记遗传多样性比较
群体 种质数量 多态性位点数
多态性位点
百分率
观测等位
基因数
有效等位
基因数
Nei′s遗传多样性
指数
Shannon′s
信息指数
初始种质 63 187 8060 18060 13099 01908 03003
核心种质 20 162 6983 16983 13013 01845 02881
保留率 3175 8663 8663 9404 9934 9670 9594
4 讨论
Plucknelt等认为,全世界的种质中有65%的缺
乏基本数据,80% ~95%的缺乏特征及鉴定数据。
有关种质的完整记录与评价是构建完整核心种质的
理想基础,但没有必要因缺乏完整的数据而拖延构
建核心种质[8]。李自超认为由于某些条件限制,核
心种质的构建在这些并不完善的数据基础上提取尽
可能有代表性的样本,然后对初选样本再经过种植
和详细的考察、鉴定可弥补一些数据,进一步聚类压
缩,也可构建比较理想的核心种质[9]。
核心种质要求以最少的资源样本和最低的重
复,最大可能地代表该物种,因此核心种质对原有整
个种质资源遗传多样性的代表性检验非常关键。所
谓遗传多样性,是指种内不同的个体间或一个群体
内不同个体间的遗传变异的总和,它主要表现在多
个方面(如系谱关系、基因多样性和杂合度等),并
由多个水平(如形态多样性、地理生态多样性、系统
分化与发育及酶与分子水平的多样性等)反映出
来,其量度的指标包括变异的丰度(richness)和变异
的均度(evenness)[10]。由于在药用植物资源构建核
心种质的研究报道很少[11],缺乏成熟的理论和方
法,更缺乏统一判断标准,本研究首次应用形态特征
和分子标记方法构建青蒿初选核心种质尚属尝试。
在构建核心种质中,对资源的形态、农艺、生物
化学、分子标记等不同类型性状综合评价,才能较为
全面地反映资源的遗传多样性分布情况。形态标记
简单直观,分子标记数量多,遍布整个基因组,取材
不受季节和环境限制,多态性明显,能直接反映
DNA序列水平的变化。自分子标记应用于植物遗
传资源研究,已经逐渐成为评价植物资源多样性、构
建核心种质的好方法。但是由于操作费用高、技术
难度及稳定性、不同分子标记可能产生不同的分类
结果等诸多问题,因而限制了其应用基因型规模及
可靠性。无论以农艺性状还是以分子标记数据建立
核心种质都难以避免这些特异表型的丢失。因此,
构建核心种质时,综合农艺性状和分子标记数据对
整体资源进行分析,能较全面地反映基因组信息,并
有效提高核心种质的代表性和实用性[1213]。笔者
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通过收集我国青蒿主产地63份青蒿资源,根据8个
性状指标进行聚类分析,并结合 SRAP分子标记数
据筛选出了20份初选核心种质,约占收集资源量的
3175%。
在评价核心种质代表性指标中,方差、极差符合
率、变异系数变异率、遗传多样性指数、均值、表型频
率分布、表型相关指标等指标反映了核心种质的遗
传变异和结构。本研究中采用了方差 F测验、均值
t测验、极差符合率、表型频率分布、遗传多样性指
数、表型相关分析和 SRAP分子标记的观测等位基
因数、有效等位基因数、Nei’s遗传多样性指数、
Shannon′s信息指数等多个指标,对青蒿初选核心种
质进行了数量性状遗传多样性的代表性的检验。从
各种特征值看,初选核心种质8个性状的变异范围、
平均值、标准差、变异系数和多样性指数与初始种质
一致;从符合率看,8个形态性状的符合率均在90%
以上,分子标记性状在概率001水平上与初始种质
差异不显著。可见本研究构建的20份资源所组成
的初选核心种质能代表初始种质的遗传多样性。
本研究所获得的初选青蒿核心种质为青蒿的种
质资源保存和优良品种选育提供了依据,但核心种
质的合理性还需进一步验证。
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EstablishmentofcanditatecorecolectionofArtemisiaannuafromChina
PENGRui,ZHONGGuoyue,LILongyun,CHENDaxia,WUYekuan,CUIGuanglin
(ChongqingAcademyofChineseMateriaMedia,Chongqing,400065,China)
[Abstract] Objective:ToestablishthecandidatecorecolectionofArtemisiaannua.Method:Themorphologictraitsandthe
resultsofSRAPmarkerwerecomparedrespectively.Result:Theχ2testandthettestofbothindexesfor8morphologicalcharactersand
SRAPmarkerparametersdidnotreachsignificantlevelbetweenthecandidatecorecolectionandtheprimarysample.Conclusions:In
thisstudy,thecandidatecorecolectioncanstandfororiginalcolectionexcelently.
[Keywords] Artemisiaannua;canditatecorecolection;originalcolection;geneticdiversity
[责任编辑 吕冬梅]
·2103·
第34卷第23期
2009年12月
Vol.34,Issue 23
December,2009