全 文 :[Abstract] Objective:Todetermineandevaluatetheresidualsoforganochlorinepesticidesandheavymetalsinsoilandin
PogostemoncablininordertoprovideforGAPplanting.Method:GCmethodwasappliedtodetermineresidualsoforganochlorinepes
ticides,thecontentsofPb,Cd,Cu,Cr,HgandAsweredeterminedbyIPC.Result:Thecontentsofresidualsoforganochlorine
pesticidesandheavymetalswerediferentamongthreecultivarsandplantingbasesclearly,butaloftheresidualsinsoilfromthree
plantingbaseswerebelowthesecondstandardofEnvironmentalqualitystandardforsoils(GB15618),andtheresidualsinP.cablin
alsomeetthe"Greenstandardsofmedicinalplantsandpreparationsforforeigntradeandeconomy".Conclusion:Residualsoforgano
chlorinepesticidesandheavymetalsinsoilandP.cablinfromthreeplantingbasesinHainanprovincewereconformedtoGAP.
[Keywords] Pogostemoncablin;organochlorinepesticides;heavymetals
[责任编辑 吕冬梅]
[收稿日期] 20070727
[基金项目] 国家“十五”科技攻关项目(2004BA721A34);云
南省“十一五”社会发展攻关项目(2006SG016)
[通讯作者] 萧凤回,Tel&Fax:(0871)5227861,Email:fen
ghuixiao@ 163.com
灯盏花种质资源遗传关系的 RAPD分析
杨生超1,李永芳1,赵 峥1,文国松1,李 云2,刘有贵2,
杨永建1,萧凤回1
(1.云南农业大学 中药材研究所 云南省中药材规范化种植技术指导中心,云南 昆明650201;
2.云南生物谷灯盏花药业有限公司,云南 昆明 650224)
[摘要]目的:研究灯盏花种质资源间的遗传关系。方法:对采自云南、贵州和四川等地的37份灯盏花种质资
源进行RAPD遗传多样性分析和NTSYS2聚类分析。结果:筛选出的10个引物在37份种质资源中共产生107条
DNA片段,其中94条带具有遗传多态性,约占8785%。遗传距离为036时,可以把灯盏花分为三大类,第一大类
包括采自滇东南的弥勒、丘北、泸西、个旧、砚山等地的9份种质资源;第二大类包括采自滇西北的古城、香格里拉
的6份,以及滇东南丘北和弥勒各1份,共8份种质资源;第三大类包括采自滇中、滇东、滇东北、四川和贵州等地的
20份种质资源。结论:灯盏花种质资源遗传多样性丰富,遗传关系与其采集地的地理分布距离密切相关。
[关键词] 灯盏花;种质资源;遗传关系;RAPD
[中图分类号]R282.5 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)13153204
灯盏花 Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand.
Mazz.又名灯盏细辛或短葶飞蓬,为菊科飞蓬属多
年生草本植物[1],主要分布于我国西部和西南部
的云南、四川、贵州、广西、西藏、湖南等省(区)。
灯盏花药性味甘温,具有散寒解表、祛风除湿、舒
筋活血、消积止痛等功效,对心脑血管类疾病所致
的后遗症等具有明显的疗效[2]。云南省灯盏花常
年采集量在1000吨以上,被列为云南省重点开发
的“五大天然系列”药物加以开发。近年对云南省
灯盏花原分布区进行资源调查时,已难见到有成
片的灯盏花,植株分布频度已接近稀少或枯竭[3]。
灯盏花种质资源是灯盏花育种的基础,其合理利
用和可持续发展已成为社会普遍关注的问题。经
多年的引种驯化研究与实践,云南省泸西县实现
了灯盏花的规模化种植,并建立了 GAP基地[4]。
对云南省3个州(市)的3个灯盏花居群的等位酶
分析[5],5个州(市)的6个灯盏花居群的 RAPD分
析[6],5个州(市)的 13个灯盏花居群的 DALP分
析[7],表明灯盏花种质资源遗传丰富,变异主要存
在于居群内。但上述研究采样范围仅限于云南省
的红河、文山、昆明、玉溪、丽江、保山等6州(市),
居群数少。本研究采用 RAPD技术对2005年采自
云南灯盏花主要分布区和四川、贵州两省并保育
于昆明的37份灯盏花种质资源进行遗传关系分
析,以期更为全面的了解我国灯盏花种质资源的
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遗传多样性特征,为灯盏花种质资源的保护、评价
和利用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 实验材料选自2005年采自云南灯盏花
主要分布区的昭通、曲靖、红河、文山、昆明、楚雄、大
理、丽江、迪庆等9个州(市)的18个县,四川的2个
县和贵州的2个县,并保育于云南生物谷灯盏花药
业有限公司的37份灯盏花种质资源(表1)。
表1 灯盏花种质资源及其来源
采集号 地点 采集号 地点 采集号 地点
D19 云南个旧老厂 D44 云南嵩明军马厂 D74 云南古城
D21 云南泸西 D46 贵州印江梵静山山口 D75 云南古城
D23 云南弥勒虹溪 D47 贵州印江梵静山护国寺 D76 云南香格里拉
D32 云南双柏 D48 贵州雷山西江雷公山 D77 云南香格里拉
D33 云南武定岩子头 D59 四川西昌 D78 云南香格里拉
D34 云南会泽待补 D60 四川德昌马鞍山 D79 云南弥勒
D35 云南昭阳靖安松杉 D61 云南武定云白药基地 D80 云南弥勒东山
D36 云南昭阳靖安西魁 D62 云南永仁高山 D81 云南砚山阿猛
D37 云南宣威得禄 D63 云南古城雪山村 D82 云南弥勒
D38 云南鲁甸岔口 D65 云南香格里拉帕纳海 D83 云南个旧卡房
D40 云南沾益石合 D66 云南大理苍山 D84 云南丘北
D42 云南沾益 D72 云南弥勒大麦地
D43 云南马龙 D73 云南丘北
1.2 总 DNA的提取及浓度检测 用优化后的
CTAB法提取总 DNA。每份资源取1~12个单株,
每株取1~2片新鲜叶片,放入预先灭菌、预冷
处理过的研钵中,加入液氮研磨成粉状;将细粉
末迅速转移到离心管中,加入 1mLCTAB提取
液,充分混匀,置于 62℃水浴中保温 1h;从水
浴中取出离心管,12000r·min-1离心 10min,将
上清液转移到另一新离心管中;每管中加入 1/2
体积的氯仿/异戊醇(24∶1),轻缓地颠倒混匀,12
000r·min-1离心 5min,上清液转至另一新离心
管中;每管中加入1/10体积的 75mol·L-1醋酸
胺和等体积的冰乙醇(100%),混匀,放置在 -20
℃的冰箱中 30min或在室温下过夜;12000r·
min-1离心15min获得 DNA沉淀,70%的乙醇洗2
次,风干沉淀;加入60μLTE缓冲液溶解 DNA,并
储存在4℃冰箱中[8]。将总 DNA用08%的琼脂
糖凝胶电泳检测,用25,50,75,100ng的 λDNA作
为半定量标准。模板 DNA的工作质量浓度为
10mg·L-1。
1.3 RAPDPCR反应参数优化 PCR反应在 T-
GradiantPCR仪(Biometra,德国)上进行,反应总体
积为25μL。RAPD影响因素都有适应范围,对影响
RAPD反应的因素设立反应梯度,每次仅改变1个
PCR参数,并保持其他条件不变,逐个研究每个参
数对RAPD结果的影响。
1.4 RAPD扩增反应及检测 RAPD扩增反应体
系:反应总体积为 25μL,10×Bufer25μL,25
mmol·L-1MgCl225μL,25mmol·L
-1dNTPs(上
海生工公司)2μL,随机引物(10mg·L-1北京赛百
盛)3μL,模板DNA(约10mg·L-1)2μL,TaqDNA
聚合酶 (5U· μL-1 Promega公 司)03μL,
ddH2O127μL。进行PCR扩增前覆盖1滴石蜡油。
RAPD扩增程序。预变性94℃,5min。变性94℃,
40s;复性36℃,30s;延伸72℃,1min。回复第2
步循环40次。终延伸72℃,5min。4℃保存。
PCR扩增产物的检测:加2μL上样液缓冲液于
扩增产物中,取10μL扩增产物于12%琼脂糖凝
胶上样孔内电泳检测,所用电泳缓冲液为 05×
TBE,电泳在120V电压下进行150~180min,将凝
胶浸在含05g·mL-1溴化乙锭中染色约30min,
并于紫外成像系统UVP-8000G上观察摄影。利用
随机引物对灯盏花 37份种质资源的材料进行
RAPD扩增。
1.5 RAPD引物的筛选 从37份种质资源中随机
选取4个个体的DNA样品进行预备实验,选出有条
带的引物,再从每份种质资源中各选择2个个体进
行进一步的筛选,共筛选出 10个能够获得清晰条
带、重复性好、反应稳定的随机引物(表2)。扩增反
应在T-GradientPCR仪(Biometra,德国)上进行。
1.6 数据分析 根据电泳图谱,产物中电泳迁移率
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表2 RAPD引物序号与序列
引物 序列(5′3′) 引物 序列(5′3′)
S121 ACGGATCCTG S47 TTGGCACGGG
S48 GTGTGCCCCA S55 CATCCGTGCT
S134 TGCTGCAGGT S93 CTCTCCGCCA
S372 TGGCCCTCAC S159 ACGGCGTATG
S464 GTGTCTCAGG S235 CAGTGCCGGT
相同的1条带被认为具有同源性,同一 RAPD位点
上按DNA条带的有无分别赋值,有带的记为“1”,
无带的记为“0”,形成0/1矩阵图输入计算机。用
PopGen32进行统计分析,计算出灯盏花37份种质
资源的遗传距离,用NTSYS2进行聚类分析,建立亲
缘关系树状图。
2 结果与分析
2.1 PCR扩增体系的优化 灯盏花PCR最优的扩
增体系为:25mmol·L-1MgCl2,50mmol·L
-1
dNTPs,04μmol·L-1引物,20mg·L-1模板 DNA,
15UTaqDNA聚合酶。
2.2 灯盏花RAPD多态性 10个引物在灯盏花的
37份种质资源中共扩增出107条带,其中94条具
有多态性,总的多态条带比率(PPB)为8785%,平
均每个引物扩增出107条带。进一步比较各个引
物的 PPB值,引物 S47和 S55的多态位最高,为
9167%,引物S159的最低,为75%,引物的平均多
态位点比率为88%。灯盏花的遗传多样性丰富(表
3)。引物S93扩增结果(图1)。
表3 37份灯盏花种质资源的遗传多样性
引物 总带数 PB PPB/% 引物 总带数 PB PPB/%
S47 12 11 9167 S134 11 10 9091
S48 11 10 9091 S159 12 9 7500
S55 12 11 9167 S235 10 9 9000
S93 10 8 8000 S372 10 9 9000
S121 10 9 9000 S464 9 8 8889
注:PB.多态条带;PPB.多态位点比率
图1 引物S93对灯盏花种质资源扩增的DNA指纹图谱
从左至右分别为M和种质资源D72,D73,D74,D75,
D76,D77,D78,D79,D81,D82
2.3 遗传相似系数 灯盏花37份种质资源的遗传
一致度低,分布在04805~09761,平均07086。
遗传距离大,在00242~08118,平均遗传距离为
03647。其中D32与 D33之间的遗传一致度最高
为09761,遗传距离最小为00242,表明二者之间
亲缘关系最近。其次是 D36与 D38之间的一致度
为09536,遗传距离为00482。而D23与D60之
间的遗传一致度最低,为04441,遗传距离最大为
08118;此二者之间亲缘关系最远。其他的相似性
居中,亲缘关系也位于中间。
2.4 聚类分析 对灯盏花37份种质资源进行聚类
(图2)。当距离是036时可以分为3大类和6个
亚类。第一大类包括采自滇东南的弥勒、丘北、泸
西、个旧、砚山等地的9份种质资源,其中又可以分
为2个亚类,第一个亚类包括弥勒的1份种质资源,
第二个亚类包括了其余8份种质资源;第二大类包
括采自滇西北的古城、香格里拉的6份种质资源,以
及滇东南丘北和弥勒各1份种质资源,其中又可以
分为2个亚类,第一个亚类包采自香格里拉的3份
种质资源,第二个亚类包括其余的5份种质资源;第
三大类包括采自滇中、滇东北、四川和贵州等地的
20份种质资源,其中又可以分为2个亚类,第一个
亚类采自贵州的印江和四川的德昌的2份种质资
源,第二个亚类包括其余18份种质资源。
图2 灯盏花37份种质资源的DNA多态性聚类
分析树型图(NTSYS2)
3 讨论
本研究首次报道了全国的灯盏花遗传关系,通
过对采集自灯盏花分布核心区的云南大部、贵州和
川西南的3省22县37份灯盏花种质资源RAPD分
子标记的遗传关系分析,表明所采集的37份灯盏花
种质资源具有丰富的遗传变异。支持对采自云南的
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13个灯盏花居群的 DALP分析和对采自云南的 6
个灯盏花居群 RAPD分析,而认为灯盏花遗传变异
丰富,遗传分化剧烈,种内分化突出的观点[6,7],而
与对云南3个灯盏花居群的核型和等位酶分析认为
灯盏花遗传一致度高的观点不同[5]。
对37份灯盏花种质资源进行聚类分析,当遗传
距离是036时可以分为三大类,能很好地解释其地
理分布。灯盏花种质资源的遗传距离与其采集的地
理分布大致成正相关,云南弥勒的灯盏花种质资源
被分在了第一大类和第二大类里,云南古城的灯盏
花种质资源被分在了第二大类和第三大类里。地理
上相近的不同灯盏花种质资源被聚在了不同的大类
或亚类中,可能与这些居群发生了遗传分化有关。
由于灯盏花是广布种,不同分布区生态地理的差异、
地理隔离以及具体生境的差别,经过长期的自然选
择,致使不同分布区或生境的灯盏花在形态、生理、
遗传、生态习性等方面出现较大的分化[6],并已有
研究证实在同一地点空旷草地和疏林地的灯盏花的
光合特征出现了趋异适应,草地生境的光合补偿点
和光合饱和点高,而林下生境的适应于低光照,光合
补偿点和光合饱和点都低[9]。
[参考文献]
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RAPDanalysisongeneticrelationshipsofErigeronbreviscapus
germplasmresources
YANGShengchao1,LIYongfang1,ZHAOZheng1,WENGuosong1,LIYun2,LIUYougui2,
YANGYongjian1,XIAOFenghui1
(1.InstisuteofChineseMedicinalMaterialsofYunnanAgriculturalUniversity/YunnanProvincialCenterof
ChineseMedicinalMaterials'GoodAgriculturePracticeTechnology,Kunming650201,China;
2.YunnanBiovaleyDengzhanhuaPharmaceuticalCo.,Ltd.,Kunming650224,China)
[Abstract] Objective:ToinvestigatethegeneticrelationshipsofErigeronbreviscapusatthemolecularbiologylevel.Method:
ThirtysevengermplasmresourcesofE.breviscapuswhichcolectedfromYunnan,SichuangandGuizhouprovincein2005wereana
lyzedbyRandomamplifiedpolymorphicDNA(RAPD)andclusteranalysisbasedonNTSYS2.Result:Atotalof10primerswere
screened,and107bandswereamplified,amongwhich94(87.85%)bandswerefoundtobepolymorphic.Thirtysevengermplasmre
sourcesofE.breviscapuswereclusteredinto3groupsatgeneticdistance0.36,theⅠ groupincludein9germplasmresourcescolect
edfromMile,Qiubei,Luxi,Gejiu,andYanshanofsoutheastofYunnanprovince;theⅡ groupincluded8germplasmresourcescol
lectedfromGucheng,andshangrilaofnorthwestofYunnanprovince,andMileandQiubeiofsoutheastofYunnanprovince;theⅢ
groupincludedin20germplasmresourcescolectedfromthecenterofYunnanprovince,northeastofYunnanprovince,Sichuanprov
ince,andGuizhouprovince.Conclusion:TherewereabundantgeneticdiversityinthegermplasmresourcesofE.breviscapus,andthe
geneticrelationshipsarecloselyrelatedtogeographicaldistancewheretheywerecolected.
[Keywords] Erigeronbreviscapus;germplasmresources;geneticrelationships;RAPD
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