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Effects of Compound Salvia injection on number and activity of endothelial progenitor cells

复方丹参注射液对内皮祖细胞数量和功能的影响



全 文 :EfectsofdiferentconcentrationextractfromShenghuadecoction
oncontractileactivityoftheuterinesmoothmuscleisolatedfromnormal,
estrogentreatedandpostpartummice
ZHAODing,ZHANWenhong,LILianhuai,NIEFengzhi,JIAOJunjie,LIYang
(SchoolofPharmacy,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)
[Abstract] Objective:ToinvestigatetheefectsofdiferentconcentrationextractfromShenghuadecoctiononcontractileactivityofthe
uterinesmoothmuscleisolatedfromnormal,estrogentreatedandpostpartummice.Method:Medlab/4svitalsignalrecorderwasusedto
measuretheefectsofextractfromShenghuadecoction(312mg·mL-1)oncontractileamplitudeandfrequencyoftheisolateduterusfromnor
mal,estrogentreatedandpostpartummice.Result:Shenghuadecoctionextract(312mg·mL-1)significantlydecreasedthecontractileactiv
ityofthemouseisolateduterusinnormalnonpregnancyandpostpartum,butsignificantlyincreasedthatofthemouseisolateduterustreated
withestrogen,anddidn’tshowsignificantconcentrationresponserelationship.Conclusion:TheefectsofShenghuadecoctionextractoncon
tractileactivityofmouseisolateduterustreatedwithestrogencannotrepresentthepharmacologicalefectsonthatofinnormalnonpregnancy
andpostpartumuterus.
[Keywords] Shenghuadecoction;mouse;isolateduterus;contractileactivity
[责任编辑 古云侠]
[收稿日期] 20050710
[基金项目] 浙江省自然科学基金项目(M303648)
[通讯作者] 张怀勤,Tel:13676403180,Email:jktdtl@sohucom
复方丹参注射液对内皮祖细胞数量和功能的影响
季亢挺1,张怀勤2,杨鹏麟1,李海鹰2,杨德业2,黄晓燕2
(1温州医学院 附属第二医院,浙江 温州 325000;
2温州医学院 附属第一医院,浙江 温州 325000)
[摘要] 目的:观察复方丹参注射液对内皮祖细胞(endothelialprogenitorcels,EPCs)数量和功能的影响。方法:
采用密度梯度离心法分离人脐血单个核细胞,接种到包被有人纤维连接蛋白的培养皿,分为对照组(未加细胞因
子)、VEGF组(加血管内皮生长因子10ng·mL-1)、复方丹参50组、复方丹参10组及复方丹参2组(分别加入复方丹
参注射液50,10,2μg·mL
-1),培养3d后,倒置显微镜下观察集落形成,采用流式细胞术测定各组 EPCs数,采用黏
附能力测定试验测定黏附能力。结果:VEGF组、复方丹参10组及复方丹参2组的EPCs数显著高于对照组(分别 P
<001,P<005,P<001),且复方丹参2组显著高于复方丹参10组及 VEGF组(均 P<001);复方丹参50组的
EPCs数显著低于对照组(P<001)。复方丹参10组及复方丹参2组的集落数及黏附细胞数显著高于对照组,而复
方丹参50组则显著低于对照组。结论:低剂量复方丹参显著提高培养EPCs数量和功能,高剂量复方丹参则反之。
[关键词] 复方丹参注射液;内皮祖细胞;细胞培养
[中图分类号]R2855 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2006)03024604
内皮细胞损伤和功能失调是动脉粥样硬化和血 管成形术后再狭窄的始动因素。研究发现,丹参具
有保护内皮细胞,改善内皮功能的作用[1,2]。内皮
祖细胞(endothelialprogenitorcels,EPCs)是出生后机
体中存在的能进一步分化为血管内皮细胞的一群前
体细胞[3]。最近的研究显示,内皮祖细胞参与内膜
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损伤的修复[4,5]。为了解丹参是否通过影响内皮祖
细胞而促进内皮修复改善内皮功能,本试验观察复
方丹参注射液对内皮祖细胞培养中数量、集落形成
及黏附能力的影响,以进一步明确丹参的作用机制。
1 材料
脐血来自温州医学院第一附属医院妇产科健康
产妇并经产妇授权同意。6%羟乙基淀粉购自 Sigma
公司。纤维连接蛋白购自 Roche公司。VEGF购自
PeproTechEC公司。Ⅷ因子相关抗原免疫组化试剂
盒购自武汉博士德生物工程公司。PECD34购自
CaltagLaboratories。FITCVECadherin购自 Bender
systemTM公司。PEVEGFR2及 FITCAC133购自
R&DSystems。胎牛血清,胰酶,M199,ECGS,Hank‘s
液,PBS均购自Gibco公司。DiIacLDL购自 Molecu
larprobe公司。复方丹参注射液为贵州神奇制药生
产,批号0311006。其余为市售试剂。
2 方法
21 人脐血 EPCs培养 参照文献[6],取脐血 50
mL,以密度梯度离心法分离脐血单个核细胞,以5×
106·cm-2密度接种于包被有纤维连接蛋白的 24孔
培养皿中,每皿加入1mL包含有20%胎牛血清、青
霉素(100U·mL-1)及链霉素(100U·mL-1)的M199,
置37℃,5%CO2饱和湿度培养箱中培养。3d后,
洗去未贴壁细胞,添加培养液继续培养待用。
22 EPCs鉴定[4,6] 细胞以 025%胰酶消化后,
制成1×106·mL-1的单个细胞悬液,加入荧光标记
的 CD34,VECadherin,VEGFR2或 AC13310μL(1
mg·mL-1),流式细胞仪分析细胞 CD34,VECad
herin,VEGFR2及 AC133的表达。为验证培养细胞
吞噬DiIacLDL,将 DiIacLDL以 24μg·mL
-1的终
剂量加入培养液,与细胞避光共孵育 4h,洗去培养
液后荧光显微镜下观察细胞荧光。以不加 DiIac
LDL的同批培养细胞作空白对照。阴性对照采用
GSC7901(胃癌细胞株)。培养细胞Ⅷ因子相关抗原
的检测采用免疫组化法,操作按公司说明。空白对
照不加一抗,阴性对照采用GSC7901。
23 分组 将各孔细胞随机分为对照组(未加细
胞因子)、VEGF组(加 VEGF10ng·mL-1)、复方丹参
50,10,2μg·mL
-13个剂量组,每组 6孔,分别进行
EPCs计数,集落形成、黏附能力测定。
24 细胞集落计数[3] 培养第 4天,倒置显微镜
下可观察到典型细胞团,以大于50个细胞的细胞团
为1个集落,在培养皿上下左右中5个方位各随机
取1个视野(×40)计数集落数,取均值。
25 黏附能力测定[5] 各组细胞培养6d后消化,
行细胞计数后以相同细胞数接种,置37℃培养箱中
培养30min,洗去未贴壁细胞,随机选取 10个视野
(×200),倒置显微镜下计数黏附细胞数。
26 EPCs数量测定 培养6d的细胞消化后制成
1×106·mL-1的单个细胞悬液,以 PECD34及 FITC
VECadherin双标细胞行流式细胞术分析细胞 CD34
及VECadherin的表达,以双阳性细胞为正在分化的
EPCs,计数。
27 统计学方法 采用单因素方差分析比较各组
均数。
3 结果
31 EPCs鉴定 培养3d洗去不贴壁细胞及碎片
后,可见典型细胞集落:呈白色半透明,略高于培养
平面,中间为大量的圆形细胞,层层叠叠,外周为纺
锤形细胞,向外扩散(图1)。6d后流式细胞仪分析
示细胞表达 CD34,VECadherin,VEGFR2及 AC133,
其中CD34VECadherin双阳性细胞比例为(4167±
1018)%,VEGFR2AC133双 阳 性 细 胞 比 例 为
(1510±742)%。荧光显微镜检显示:随培养时间
的延长,越来越多的细胞吞噬 DiIacLDL,显微镜下
激发红色荧光(图 2),空白对照及阴性对照均无荧
光。培养2周后,Ⅷ因子相关抗原免疫组化阳性,胞
浆呈棕色,空白对照及阴性对照不显棕色。
图1 培养3d后典型细胞集落(×200)
32 复方丹参注射液对EPCs集落形成能力的影响
见图3,VEGF组、复方丹参10组及复方丹参2组
的集落数显著高于对照组(P<001),且复方丹参
10组及复方丹参2组显著高于 VEGF组(P<005,
P<001),复方丹参 2组显著高于复方丹参 10组
(P<001);复方丹参50组的集落数显著低于对照
组(P<001)。
33 复方丹参注射液对EPCs黏附能力的影响
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图2 细胞吞噬DiIacLDL(×200)
图3 复方丹参注射液对EPCs集落形成能力的影响(×40)
1对照组;2VEGF组;3复方丹参10组;4复方丹参2组;5复方
丹参50组,各组 n=6(图4,5同)。与对照组相比P<001;与
VEGF组相比P<005;与复方丹参10组相比▲P<001
见图4,VEGF组、复方丹参10组及复方丹参2组的
黏附EPCs数显著高于对照组(P<005,P<001,
P<001),且复方丹参10组及复方丹参2组显著高
于VEGF组(P<001),复方丹参2组显著高于复方
丹参10组(P<005);复方丹参 50组的黏附 EPCs
数显著低于对照组(P<001)。
图4 复方丹参注射液对EPCs黏附能力的影响(×200)
与对照组相比▲P<005,P<001;与VEGF组相比P<001;
与复方丹参10组相比P<005
34 复方丹参对EPCs数量的影响 见图5,VEGF
组、复方丹参10组及复方丹参 2组的 EPCs数显著
高于对照组(P<001,P<005,P<001),且复方
丹参2组显著高于复方丹参 10组及 VEGF组(P<
001);复方丹参 50组的 EPCs数显著低于对照组
(P<001)。
图5 复方丹参注射液对EPCs数量的影响
与对照组相比P<001P<005;与VEGF组相比▲P<001
5 讨论
丹参作为传统的活血化瘀药,有抗动脉粥样硬
化、钙拮抗、抗炎、抗肿瘤、抗氧化损伤以及中枢抑制
等多种药理作用[7],广泛应用于心脑血管疾病的防
治。近几年来,丹参药理研究又有一些新进展。吴
兴军等发现丹参乙酸镁抑制氧化低密度脂蛋白诱导
的内皮细胞凋亡[8]。杨立业等发现丹参可诱导鼠骨
髓间充质细胞向神经元分化[9]。张知新报道丹参作
用具有双向性:高剂量丹参酚酸 B镁对内皮细胞有
明显的细胞毒作用,低剂量对细胞增殖无不良影
响[2]。一系列研究显示,丹参对各种因素引起的内
皮细胞损伤有保护作用[1,2,8]。
内皮细胞损伤是动脉粥样硬化及 PTCA术后再
狭窄的始动因素。以往研究认为,内皮细胞损伤由
相邻内皮细胞延展修复,现在的认识是EPCs同样参
与再内皮化过程[4,5]。自 1997年 Asahara首次报道
外周血循环中存在能特异性归巢于血管新生组织并
分化成血管内皮细胞的 EPCs后,大量研究证实
EPCs参与生理及病理状态下的血管新生及血管修
复[35]。EPCs与冠心病的发生、发展及预后关系密
切。研究发现冠心病病人循环中 EPCs数量下降了
近50%,迁移能力受损[10]。因此,增加循环EPCs数
量、改善其功能成为冠心病防治的一个新策略。通
过药物促进骨髓干细胞分化为EPCs、动员骨髓EPCs
进入外周循环是其中的一个方法,而通过体外培养
扩增EPCs回输为冠心病防治提供了另一个选择。
本研究发现,低剂量丹参显著扩增培养 EPCs数,提
高其集落形成及黏附能力。鉴于丹参价格低廉,这
个发现有其临床推广应用前景。
丹参扩增EPCs数量,改善其功能的确切机制尚
未明确。由于EPCs与内皮细胞同属内皮细胞谱系,
丹参影响EPCs也许存在与影响内皮细胞相似的机
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制,作者推测低剂量丹参可能通过促进 EPCs分化,
减少 EPCs凋亡,降低 EPCs损伤等机制起效。作者
的研究同样发现高剂量丹参减少EPCs数量,抑制其
功能,推测可能与高剂量丹参的细胞毒性有关。丹
参影响EPCs数量及其功能的机制研究有待进一步
深入。丹参水溶性成分中何种成分有效?剂量如
何?这些问题的解答将有助于传统中药丹参的进一
步开发应用。
[参考文献]
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EfectsofCompoundSalviainjectiononnumberandactivity
ofendothelialprogenitorcels
JIKangting1,ZHANGHuaiqin2,YANGPengLin1,LIHaiying2,YANGDeYe2,HUANGXiaoYan2
(1DepartmentofCardiology,theSecondAfiliatedHospitalofWenzhouMedicalColege,Wenzhou325000,China;
2TheFirstAfiliatedHospitalofWenzhouMedicalColege,Wenzhou325000,China)
[Abstract] Objective:ToinvestigatetheefectsofCompoundSalviainjection(CSI)onthenumberandactivityofendothelialprogeni
torcels(EPCs)Method:Mononuclearfractionofhumanumbilicalcordbloodwasobtainedbydensitygradientcentrifugationandplatedon
fibronectincoatedculturedishesCelsweredividedintofivegroups:groupcontrol,groupVEGF,groupCSI50,groupCSI10andgroupCSI
2(supplementedwithnonecytokine,VEGF10ng·mL-1,CSI50,10,2μg·mL
-1,respectively)Aftersixdaysinculture,celclusters
wereviewedwithaninvertedmicroscope,fluorescenceactivatedcelsorting(FACS)analysisofPECD34andFITCVECadherinwasper
formedtodetectnumberofEPCs,adhesionassaywasperformedbyreplatingcelsonfibronectincoateddishes,andthencountingadherent
celsResult:NumbersofEPCsofgroupVEGF,groupCSI10andgroupCSI2weresignificantlyincreasedascomparedwiththoseofgroup
control(P<001,P<005,P<001,respectively),andnumbersofEPCsofgroupCSI2weremorethanthoseofgroupCSI10andgroup
V(P<001)Comparedwithgroupcontrol,numberofEPCsofgroupCSI50wassignificantlydecreased(P<001)Comparedwithgroup
control,numbersofclustersandadhesiveEPCsofgroupCSI10andgroupCSI2weresignificantlyincreased,whilethoseofgroupCSI50were
significantlydecreasedConclution:LowconcentrationCSIcansignificantlypromoteEPCsaugmentationandenhanceitsfunctionalactivity,
whilehighconcentrationCSIsignificantlyrestrainsit
[Keywords] CompoundSalviainjection;endothelialprogenitorcels;celculture
[责任编辑 古云侠]
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