全 文 ：［科研报道］
泰山白花丹参提取物体外对氧化应激损伤内皮祖细胞作用的研究
焦 鹏， 杨娜娜， 崔英杰， 秦树存*
(泰山医学院 动脉粥样硬化研究所，山东 泰安 271000)
收稿日期:2013-02-15
基金项目:山东省中医药科技发展计划项目 (2011—228) ;山东省泰山学者岗专项基金资助项目 (鲁政办发 ［2008］ 67 号) ;山东省
自然科学基金 (ZＲ2012HL18)
作者简介:焦 鹏 (1979—) ，女，讲师，硕士，研究方向:细胞生物学。Tel:13854826934，E-mail:jiaopeng196@ 163． com
* 通信作者:秦树存，教授，研究方向:脂质代谢与动脉粥样硬化。
网络出版日期:2013-10-23
网络出版地址:http: / /www. cnkinet /kcms /detail /31. 1368. Ｒ. 201
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摘要:目的 观察白花丹参提取物对氧化应激损伤的内皮祖细胞 (EPCs)的影响。方法 以 0. 001% H2O2诱导 EPCs
氧化应激损伤，以泰山白花丹参提取物干预，取各组细胞上清液行白细胞介素-6 (IL-6)和肿瘤坏死因子 α (TNF-α)
的含有量检测和总超氧化物歧化酶 (SOD)活力检测;以二氯荧光素二乙酯染色细胞，用流式细胞术检测细胞内平均
荧光强度以反映细胞活性氧水平。结果 H2O2损伤后，IL-6 和 TNF-α水平显著增高，SOD活性下降，细胞内 MFI升高
(P ＜ 0. 05)。白花丹参干预 24 h后，明显抑制内皮祖细胞的氧化应激反应 (与 H2O2组比较，P ＜ 0. 05) ，增加 SOD活
性，降低 IL-6 及 TNF-α水平，细胞内平均荧光强度降低。结论 白花丹参对 H2O2诱导的内皮祖细胞氧化应激损伤有
保护作用，其机理可能与其抗炎和抗脂质过氧化有关。
关键词:泰山白花丹参;内皮祖细胞;氧化应激;白细胞介素-6;肿瘤坏死因子 α;SOD;活性氧
中图分类号:Ｒ285. 5 文献标志码:B 文章编号:1001-1528(2013)12-2730-03
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2013. 12. 039
内皮祖细胞参与的内皮系统损伤的修复是动脉粥样
硬化的始动因素和重要环节［1-2］。氧化应激和炎症是动
脉粥样硬化发展的两个关键成分，同时活性氧是动脉粥
样硬化炎症发生的始动因素［3］。前期实验证实，泰山白
花丹参提取物对 H2 O2损伤后内皮祖细胞有显著保护作
用，但其具体机制尚不是很明确。本实验拟从氧化应激
和炎症方面探讨泰山白花丹参提取物对内皮祖细胞的保
护作用。
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1 材料
1. 1 细胞 内皮祖细胞的培养和鉴定本课题组已成功完
成［4-5］，在本院生命科学研究中心细胞培养间常规传代
培养。
1． 2 试剂与药品 白花丹参 (产自泰山)由山东大学博
士生导师夏作理教授鉴定，白花丹参提取物的制备参见参
考文献［4-5］;EBM—2 培养基购自 Lonza 公司;人淋巴细
胞分离液购自天津 TBD 公司;DiI-Ac-LDL，FITC-UEA-I 购
自 BTI 公司;人纤维连接蛋白，PE-VEGFＲ-2，PE-CyTM 5-
CD34 购自美国 BD公司;超氧化物歧化酶 (SOD)检测试
剂盒购自南京建成生物工程研究所;人用 IL-6 ELISA 试剂
盒和人用 TNF-α ELISA 试剂盒均购自深圳市达科为生物技
术有限公司;二氯荧光素二乙酯 (DCFH-DA)购自 Sigma。
1. 3 仪 器 BD FACScalibur 流式细胞仪，美国 BD 公司;
LG 16—W 高速微量离心机，北京医用离心机厂;BIO—
ＲAD Model 550 酶标仪，日本;MCO—15AC CO2 培养箱，
日本三洋株式会社。
2 方法
2. 1 实验分组 内皮祖细胞原代培养 7 d 后，以 0. 25%胰
酶将各孔细胞消化制成细胞悬液，以同等数量细胞接种随机
分为正常对照组、H2O2损伤组 (0. 001% H2O2)、白花丹参
+ H2O2组 (白花丹参质量浓度分别为 0. 2、0. 4、0. 8 g /L，
每组同时加 0. 001% H2 O2) ，培养 24 h 后，进行各项指标
检测。
2. 2 ELISA方法检测培养液中白细胞介素-6 ( IL-6) 和肿
瘤坏死因子 α ( TNF-α) 的水平 分组处理细胞后收集培
养液上清，离心 15 min，取上清，按照试剂盒说明书中实
验步骤操作，吸光度值于酶标仪 450 nm 波长处测定，根据
预实验所作的标准曲线计算样本的浓度。
2. 3 黄嘌呤氧化酶法测定总超氧化物歧化酶 ( SOD) 活力
收集各组细胞培养液上清，按试剂盒说明书加好各试剂
后，混匀，室温放置 10 min，于波长 550 nm处，1 cm光径
比色杯，蒸馏水调零，测各组吸光度值，实验每组重复测
一次。根据吸光度值计算总 SOD活力。
2. 4 细胞活性氧水平检测 将细胞以相同密度接种于 6 孔
培养板，过夜，按不同分组处理完后，吸弃培养液加入 1
∶ 1000 用无血清培养液稀释的 DCFH-DA (终浓度为 10
μmol /L) ，37 ℃培养箱内孵育 30 min。PBS 洗涤 3 次后，
胰酶消化，收集细胞，流式细胞仪 488 nm激发下检测 FL1
通道荧光。
3 结果
3. 1 培养液中白细胞介素-6 ( IL-6 ) 和肿瘤坏死因子 α
( TNF-α) 的检测 与正常对照组相比，过氧化氢损伤后显
著升高了内皮祖细胞上清液的 IL-6 和 TNF-α 质量浓度
(P ＜ 0. 01) ，白花丹参提取物干预后，与单纯损伤组相比
降低了 IL-6 和 TNF-α，各质量浓度白花丹参组与单纯损伤
组相比有显著性差异 (表 1)。
表 1 培养上清中 IL-6 和 TNF-α的质量浓度变化 (x ± s)
组 别 IL-6 /(ng·L －1) TNF-α /(ng·L －1)
正常对照组 60. 43 ± 12. 89 49. 18 ± 14. 14
H2O2损伤组 189. 56 ± 13. 59* 232. 34 ± 25. 89*
0. 2g /L白花丹参 + H2O2 70. 65 ± 9. 18# 49. 45 ± 10. 09#
0. 4 g /L白花丹参 + H2O2 51. 19 ± 10. 24# 33. 2 ± 8. 48#
0. 8 g /L白花丹参 + H2O2 40. 14 ± 10. 67# 38. 8 ± 6. 98#
注:与正常对照组比较，* P ＜ 0. 01;与 H2 O2损伤组比较 ，
#P ＜ 0. 01 (图 1 同)
3. 2 白花丹参对氧化损伤后细胞总超氧化物歧化酶
( SOD) 活力的影响 0. 001% H2O2作用内皮祖细胞后，总
超氧化物歧化酶 (SOD)活力明显下降，而在 0. 2、0. 4 和
0. 8 g /L白花丹参共同作用下，SOD活性比损伤组有了显著
的改善 (图 1)。
1. 正常对照组 2. H2 O2损伤组 3. 0. 2 g /L 白花丹参 + H2 O2
4. 0. 4 g /L白花丹参 + H2O2 5. 0. 8 g /L白花丹参 + H2O2
图 1 各组别 SOD活力测定
3. 3 各组细胞内活性氧水平变化 流式检测结果表明损伤
组细胞内 FL1 平均荧光强度明显高于对照组，说明过氧化
氢损伤后细胞内活性氧的产生明显升高，0. 2 g /L白花丹参
组与过氧化氢损伤组比较差别不大，而 0. 4 g /L 和 0. 8 g /L
白花丹参质量浓度组活性氧水平与过氧化氢损伤组比较明
显降低 (P ＜ 0. 05) ，见图 2。
图 2 各组别活性氧水平测定
4 讨论
目前，世界范围内心血管疾病的发病率和死亡率都在
逐年上升，动脉粥样硬化 (Atherosclerosis，AS)是主要的
病理基础［6-7］。AS是多因素所致病变，主要有血管内皮功
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能障碍、炎症、氧化应激等［8］。众所周知，AS 属慢性炎症
增殖性疾病，炎症反应贯穿于动脉粥样硬化的全过程，细
胞因子及氧化应激产物在炎症反应中起重要作用，内皮细
胞的损伤及功能紊乱是 AS 发生的始动环节，并贯穿于 AS
进展的全过程，因此靶向修复血管内皮，纠正内皮细胞功
能紊乱，可有效抑制 AS的形成和发展［9-12］。由于成熟内皮
细胞是终末分化细胞，修复受损内皮的能力有限。近年来
诸多研究表明血管内皮细胞外的干细胞可修复血管大面积
创伤，因而提出了内皮祖细胞 (endothelial progenitor cells，
EPCs)修复假说
［13-14］。由于在一些疾病状态下，EPC 的数
量和功能都有所降低，那么是否可以人为地恢复和增强病
理状态下内皮祖细胞的生物学活性和功能就成为目前研究
的热点。
超氧化物歧化酶 (SOD)是需氧生物体内的一种内生
性氧自由基清除剂，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关
重要的作用。SOD活力水平是公认的可间接反映机体内自
由基水平的重要指标之一，它与自由基水平呈负相关。而
MDA的量常常可反映脂质过氧化的程度，间接的反映出细
胞损伤的程度。活性氧具有较强的氧化作用，在有机体中
少量活性氧的存在并不会造成明显的氧化损伤，目前研究
表明细胞内的活性氧参与了凋亡的过程。当细胞受到一些
因素刺激时，通过细胞膜上 NADPH 氧化酶系统作用产生大
量活性氧。过多的活性氧会引起 DNA损伤、脂质过氧化而
触发细胞发生凋亡［15］。目前普遍认为动脉粥样硬化是一种
慢性炎症性疾病，IL-6、TNF-α两者在炎症反应急性相中联
系紧密，IL-6 是预测心血管事件的独立危险因子［16］。
本课题组前期实验证实，白花丹参能改善 H2O2引起的
内皮祖细胞增殖抑制和凋亡增加的现象。本实验主要对这
一现象的机理进行了研究，发现过氧化氢刺激内皮祖细胞
后，炎症因子 IL-6 和 TNF-α的分泌有显著性升高，SOD 活
力明显下降而且细胞内活性氧明显增加，而白花丹参干预
后，这些症状都有明显改善，说明白花丹参提取物对内皮
祖细胞氧化损伤影响的机制可能是提高了该细胞的抗氧化
酶活性、降低了炎症因子的释放并且清除了细胞内过多的
活性氧。
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