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Studies on constituents of rootsanel leaves from Desmodium blandumand their cytotoxic activity against growth of several tumor cells

毛排钱草的化学成分及其对肿瘤细胞的细胞毒活性研究



全 文 :毛排钱草的化学成分及其对肿瘤细胞的
细胞毒活性研究
干 宁1,杨 欣1,李天华1,何 平2
(1.宁波大学 新型功能材料及其制备科学国家重点实验室,浙江 宁波 315211;
2.浙江中医药大学 药学院,浙江 杭州 310000)
[摘 要] 目的:对毛排钱草地上部分的化学成分和所得化合物对肿瘤细胞的细胞毒活性进行研究。方法:将
干燥的毛排钱草地上部分用甲醇在50℃下萃取浓缩,用水溶解后过滤,得水可溶和不可溶2部分,水可溶部分用
正丁醇萃取、柱色谱分离,得化合物。通过波谱解析鉴定化合物结构。并进行了细胞毒活性研究。结果:从正丁醇
萃取物分离纯化得到8个化合物,分别鉴定为N,N二甲基色胺(1),5甲氧基N,N二甲基色胺(2),柠檬酚(3),异
柠檬酚(4),(Z)1(4羟基2,3二甲氧苯基)3(4羟基苯)丙烯(5),(Z)1(3羟基2,4二甲氧苯基)3(4羟基
3甲氧基苯基)丙烯(6),原儿茶酸甲酯(7),(2R,3R)2,3二氢3,5,7三羟基2(4羟基苯基)4H1苯骈吡喃4
酮(8)。结论:化合物6为毛排钱草中发现的新化合物。在肿瘤细胞生长抑制活性试验(MTTtest)中,化合物2,3,
6均具有一定的细胞毒活性。
[关键词] 毛排钱草;化学成分;细胞毒活性
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)18207704
[收稿日期] 20080411
[基金项目] 浙江省自然科学基金(Y106725);浙江省科技攻
关项目(2006C31040);浙江省教育厅基金(20061697);宁波市自然
科学基金(2008A610072&2008A610043)
[通讯作者] 干宁,Tel:13486485114,Email:ganning@nbu.
edu.cn
  毛排钱草DesmodiumblandumVanMeeuwen别名
虎尾金钱、钱串草,为豆科排钱草属植物,以根和叶入
药,有清热利湿,活血祛瘀,软坚散结等功效。国内外
学者对毛排钱草化学成分的研究表明其含有蟾毒色
胺、N,N二甲基色胺、5甲氧基N甲基色胺、5甲氧
基N,N二甲基色胺、5甲氧基N,N二甲基色胺氧化
物、芦竹碱[1]等。为了进一步研究毛排钱草的化学组
成,以辅助药用植物学、生物学等相关研究,本研究对
毛排钱草地上部分的化学成分进行研究,从中得到8
个化合物,其中化合物6为新化合物(图1)。对所有
化合物进行了细胞毒活性试验,化合物2,3,6对肿瘤
细胞具有一定的细胞毒活性。
1 材料
BrukerAC-400MHz核磁共振波谱仪(德国
Bruker公司);GCQ(EIMS)质谱分析仪(美国 Finni
gan公司);NicoletAVATAR320红外光谱仪(美国
  
图1 化合物6的化学结构式
Nicolet公司);HitachiU-3200紫外光谱仪(日本日
立公司);XT4型显微熔点测定仪(北京泰克仪器有
限公司),温度计未校正。
毛排钱草于2006年8月采自广西南宁市郊武
胜乡。由浙江中医药大学药学院何平教授鉴定为毛
排钱草D.blandum,标本保存于浙江中医药大学中
药标本室。
薄层色谱硅胶GF254和柱色谱硅胶(100~200
目,200~300目,青岛海洋化工厂生产),聚酰胺薄
膜(台州市路桥生化塑料厂),SephedaxLH-20
(AmershambiosciesCo.,Ltd.),反相硅胶 RP-18
(FujiSilysiaChemicalCo.,Ltd.),大孔吸附树脂AB
-8(南开大学化工厂)。所用试剂均为分析纯。
2 提取分离
将18kg干燥毛排钱草地上部分经剪碎后,以
甲醇于50℃下提取浓缩后得甲醇提取物;将其用水
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溶解,过滤,得水可溶及不可溶2部分;水可溶部分
用正丁醇萃取,得正丁醇萃取物;经 SephadexLH-
20柱色谱分离,以甲醇为洗脱液,共得 4个组分。
组分1以硅胶柱色谱分离,依次以正己烷醋酸乙酯
(2∶1)、氯仿甲醇(20∶1~5∶1)洗脱,再以制备型薄
层色谱纯化,依次得到化合物3(267mg),4(258
mg),5(186mg),6(177mg),7(254mg),8
(234mg)。组分3和4经反相高效液相色谱纯化,
分别得到化合物1(tR=171min,200mg),2(tR=
124min,323mg)。
3 细胞毒活性试验
3.1 试药配制和细胞培养 500mg3(4,5二甲基噻
唑2甲氧基)2,5二苯四唑溴(MTT)溶于100mL磷酸
缓冲液(PBS)中,以微滤膜过滤后,4℃遮光储存。
完全培养基(CDMEM)的配制:于每毫升含
10%胎牛血清(FCS)的培养基(DMEM)中添加100
U青霉素(penicilin)、100μg链霉素(streptomy
cin)、25μg两性霉素B(fungizone)、2mmol谷胱酰
胺(Lglutamine)及100μmol非必需氨基酸(nones
sentialaminoacid)配置成完全培养基。
细胞培养:肝癌细胞株(HepG2)和鼻咽癌细胞
株(KB)由浙江中医药大学中药研究所黄瑞龄教授
实验室提供。置于 CDMEM中,于含 5%CO2的 37
℃培养箱中培养。
3.2 细胞毒活性试验(MTT法) 在96孔细胞培
养板孔中,种入细胞,细胞密度为12~15×104个/
孔。隔夜,细胞充分贴壁后,吸取 DMEM,加入含不
同剂量药物的200μL培养基,并放回培养箱中。每
个剂量重复 3次,对照组为 DMEM及含 025%
DMSO的DMEM培养基。给药2d后,吸走90μL培
养基,并加入25μLMTT试剂,放回37℃培养箱中
反应4h。倒掉上层清液,加入100μLDMSO将蓝
紫色结晶溶出,以150r·min-1振荡反应5min。读
取570nm吸光值以反映存活细胞的多寡,并计算化
合物对细胞生长50%抑制浓度(IC50)。
4 结构鉴定
化合物 1 黄色油状物,EIMSm/z(%):188
[M]+(1),160(15),145(15),117(20),58(100);
1HNMR(CD3OD,400MHz)δ:291(6H,s,H10,H
11),321(2H,t,J=64Hz,H8),343(2H,t,J=
64Hz,H9),703(1H,m,H6),712(1H,m,H
5),721(1H,s,H2),737(1H,d,J=80Hz,H
4),760(1H,d,J=76Hz,H7);13CNMR(CD3OD,
100MHz)δ:1383(C4a),1280(C7a),1244(C
2),1228(C5),1201(C6),1190(C7),1126
(C4),1096(C3),592(C9),436(C10,C11),
219(C8)。上述理化性质和波谱数据与文献[2]
报道一致,故鉴定为N,N二甲基色胺。
化合物 2 无色粉末,EIMSm/z(%):218
[M]+(3),188(21),144(4),130(7),58(100);1H
NMR(CD3OD,400MHz)δ:251(6H,s,H10,11),
286(2H,t,J=76Hz,H8),297(2H,t,J=
76Hz,H9),382(3H,s,5OCH3),676(1H,dd,
J=88,24Hz,H6),702(1H,d,J=24Hz,H
4),705(1H,s,H2),760(1H,d,J=88Hz,H
7);13CNMR(CD3OD,100MHz)δ:1550(C5),
1335(C7a),1288(C4a),1242(C2),1226(C
6),1222(C3),1130(C7),1013(C4),606(C
9),564(5OCH3),448(C10,C11),126(C8)。
上述理化性质和波谱数据与文献[3]报道一致,故
鉴定为5甲氧基N,N二甲基色胺。
化合物 3 无色粉末,EIMSm/z(%):352
[M]+(30),337(100),228(35),203(12),58(13);
IR(KBr)cm-1:3348,1646,1609,1546,1504,
1483,1420,1351,1278,1173,1146;1HNMR
(CD3OD,400MHz)δ:136(6H,s,H14,15),560
(1H,d,J=100Hz,H12),604(1H,s,H6),670
(1H,d,J=100Hz,H11),681(2H,d,J=85Hz,
H3,5′),798(2H,d,J=85Hz,H2′,6′);13C
NMR(CD3OD,125MHz)δ:1764(C4),1608(C
5),1595(C7),1593(C2),1509(C9),1470
(C4′),1363(C3),1295(C2′,6′),1275(C
12),1226(C1′),1153(C3′,5′),1144(C11),
1040(C10),1013(C8),988(C6),781(C
13),272(C14,15)。上述理化性质和波谱数据与
文献[4]报道一致,故鉴定为柠檬酚。
化合物 4 无色粉末,EIMSm/z(%):354
[M]+(79),339(100),219(63),203(81),177
(18);IR(KBr)cm-1:3406,1630,1577,1519,
1446,1362,1278,1236,1162,1136,1088;1H
NMR(acetoned6,400MHz)δ:140(6H,s,H14,
15),468(1H,d,J=116Hz,H3),515(1H,d,
J=116Hz,H2),559(1H,d,J=100Hz,H12),
591(1H,s,H6),642(1H,d,J=100Hz,H11),
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689(2H,d,J=88Hz,H3′,5′),743(2H,d,J=
84Hz,H2′,6′);13CNMR(acetoned6,100MHz)δ:
1987(C4),1643(C5),1631(C7),1589(C
4′),1578(C9),1302(C2′,6′),1297(C1′),
1276(C12),1159(C3′,5′),1158(C11),1026
(C8),1019(C10),978(C6),844(C2),789
(C13),730(C3),283(C14,15)。上述理化性质
和波谱数据与文献[5]报道一致,故鉴定为异柠檬酚。
化合物 5 褐色粉末,EIMSm/z(%):286
[M]+(100),271(17),255(36),239(12),131
(13);IR(KBr)cm-1:3427,1604,1514,1488,
1456,1414,1272,1230,1062;UV(MeOH)nm:
204(469),230(sh),277(403);1HNMR
(acetoned6,400MHz)δ:352(1H,d,J=115Hz,
H9),381(3H,s,12OCH3),386(3H,s,11
OCH3),577(1H,m,H8),655(2H,d,J=70,Hz,
H7),665(1H,d,J=80Hz,H14),678(2H,d,
J=85Hz,H5),695(1H,d,J=80Hz,H15),
705(2H,d,J=90Hz,H2);13CNMR(acetoned6,
125MHz)δ:1559(C4),1520(C11),1506(C
13),1411(C12),1319(C1),1305(C8),1293
(C2,6),1247(C9),1247(C15),1228(C10),
1155(C3,5),1110(C14),602(11,12OCH3),
339(C7)。上述理化性质和波谱数据与文献[6]
报道一致,故鉴定为(Z)1(4羟基2,3二甲氧苯
基)3(4羟基苯)丙烯。
化合物 6 褐色粉末,EIMSm/z(%):316
[M]+(100),301(18),285(46),253(13),111
(22);HREIMSm/z3161305,(calC18H2O5,
3161305);IR(KBr)cm-1:3396,1598,1514,
1488,1462,1414,1357;UV(MeOH)nm:203,
255;1HNMR(acetoned6,400MHz)δ:350(1H,dd,
J=112,16Hz,H9),383(3H,s,3OCH3),379
(6H,s,11OCH3,13OCH3),576(1H,m,H8),
653(2H,dd,J=72,16Hz,H7),663(1H,d,J=
84Hz,H14),665(1H,dd,J=80,20Hz,H6),
673(1H,d,J=80Hz,H5),679(1H,d,J=20
Hz,H1),692(1H,d,J=84Hz,H15);13CNMR
(acetoned6,100MHz)δ:1526(C13),1512(C
12),1483(C3),1456(C4),1417(C11),1331
(C1),1310(C8),1254(C9),1253(C15),
1234(C10),1214(C6),1157(C5),1127(C
2),1116(C14),609(3OCH3,13OCH3),562
(11OCH3),349(C7)。上述理化性质和波谱数据
与文献[6]报道对照,其偶合常数 J7,8=112Hz,故
鉴定为(Z)1(3羟基2,4二甲氧苯基)3(4羟
基3甲氧基苯)丙烯。
化合物 7 无色粉末,EIMSm/z(%):168
[M]+(70),137(100),109(18),81(9),55(5);IR
(KBr)cm-1:3401,3280,1688,1604,1530,1441,
1309,1236;1HNMR(acetoned6,400MHz)δ:379
(3H,s,H8),688(1H,d,J=84Hz,H5),742
(1H,dd,J=84,20Hz,H6),748(1H,d,J=20
Hz,H2);13CNMR(acetoned6,100MHz)δ:1671
(C7),1508(C4),1456(C3),1232(C6),
1227(C1),1171(C2),1157(C5),518(C8)。
上述理化性质和波谱数据与文献[7]报道一致,故
鉴定为原儿茶酸甲酯。
化合物 8 无色粉末,EIMSm/z(%):288
[M]+(45),259(100),153(47),134(41),107
(62);IR(KBr)cm-1:3448,1635,1383,1083;1H
NMR(acetoned6,400MHz)δ:456(1H,d,J=116
Hz,H3),500(1H,d,J=116Hz,H2),587(1H,
d,J=24Hz,H8),591(1H,d,J=20Hz,H6),
689(2H,dd,J=68,20Hz,H3′,5′),743(2H,
dd,J=68,20Hz,H2′,6′);13CNMR(acetoned6,
100MHz)δ:841(C2),729(C3),1968(C4),
1641(C5),968(C6),1714(C7),978(C8),
1650(C9),1004(C10),1294(C1′),1302(C
2′,6′),1559(C3′,5′),1588(C4′)。与(2R,
3R)2,3二氢3,5,7三羟基2(4羟基苯)4H1
苯并吡喃4酮标准品进行TLC对照,多种展开系统
下Rf值均一致;IR光谱数据一致;混合熔点不下
降。故鉴定为(2R,3R)2,3二氢3,5,7三羟基2
(4羟基苯)4H1苯骈吡喃4酮。
5 毛排钱草中化合物对肿瘤细胞的细胞毒活性
进行了8个化合物对KB及HepG2细胞的细胞
毒活性试验,化合物2,3,6显示一定的细胞毒活性
(表1)。
表1 化合物2,3,6对不同肿瘤细胞株的细胞毒活性
细胞株
IC50/mg·L-1
2 3 6
KB >100 149 157
HepG2 805 152 408
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StudiesonconstituentsofrootsanelleavesfromDesmodiumblandum
andtheircytotoxicactivityagainstgrowthofseveraltumorcels
GANNing1,YANGXin1,LITianhua1,HEPing2
(1.StateKeyLaboratoryofNovelFunctionalMaterialsandPreparationScience,NingboUniversity,Ningbo315211,China;
2.FacultyofMedicine,ZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310000,China)
[Abstract] Objective:ToinvestigatethechemicalconstituentsofDesmodiumblandumandtheircytotoxicactivityagainstthe
growthofseveraltumorcels.Method:Variouschromatographictechniquesincludingsilicagel,SephadexLH-20columnchromatog
raphywereemployedfortheisolationandpurificationoftheconstituents.Thestructuresofcompoundswereelucidatedbyspectralana
lyses(IR,UV,NMR,MS).Theircytotoxicactivitywasthenstudied.Result:EightcompoundswereisolatedfromthestemsofD.
blandumandidentifiedasN,Ndimethyltryptamine(1),5methoxyN,Ndimethyltryptamine(2),citrusinol(3),yukovanol(4),
(Z)1(4hydroxy2,3dimethoxyphenyl)3(4hydroxyphenyl)propene(5),(Z)1(3hydroxy2,4dimethoxyphenyl)3(4hy
droxy3methoxyphenyl)propene(6),methylprotocatechuate(7),katuranin(8).Conclusion:Amongthesecompounds,com
pound6wasisolatedfromD.blandumforthefirsttime.IntheMTTtest,compounds2and6exhibitcytotoxicactivitiesagainsttheKB
cel,andcompounds3and6exhibitthesameactivitiesagainsttheHepG2cel.
[Keywords] Desmodiumblandum;chemicalconstituents;cytotoxicactivity
[责任编辑 王亚君]
[收稿日期] 20080123
[基金项目] 国家高技术领域研究“863”计划(2002AA22343C)
[通讯作者] 杨秀伟,Tel:(010)82805106,Email:xwyang@bjmu.edu.cn
黄连解毒汤醋酸乙酯溶性化学成分的研究
马兆堂,杨秀伟
(北京大学 药学院 天然药物及仿生药物国家重点实验室 天然药物学系,北京 100083)
[摘要] 目的:研究黄连解毒汤(由黄连、黄芩、黄柏、栀子等4味中药组成的复方)的化学成分,为其药代动力
学和药效动力学研究提供物质基础。方法:采用各种柱色谱方法进行分离、纯化,NMR和 MS等方法进行结构鉴
定。结果:从黄连解毒汤的醋酸乙酯可溶性部分得到35个化合物,其中的20个化合物分别鉴定为 β谷甾醇(1),
千层纸素A(2),汉黄芩素(3),熊果酸(4),黄芩新素Ⅰ(5),韧黄芩素Ⅰ(6),黄芩新素Ⅱ(7),柠檬苦素(8),5,2′
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