全 文 ：Ｅｆｅｃｔａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｎｄｏｐａｍｉｎｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｓｔｒｉａｔｕｍｉｎｒａｔｍｏｄｅｌｏｆ
Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ＇ｓｄｉｓｅａｓｅｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅＲｇ１
ＸＵＬｉ，ＬＩＵＬｉｘｉｎｇ，ＣＨＥＮＷｅｎｆａｎｇ
（ＤｅｐａｒｍｅｎｔｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｅｇｅｏｆＱｉｎｇｄａｏＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｑｉｎｇｄａｏ２６６０７１，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｅｆｅｃｔａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｎｄｏｐａｍｉｎｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｓｔｒｉａｔｕｍ（Ｓｔｒ）ｉｎｔｈｅ６ＯＨＤＡｉｎｄｕｃｅｄ
ｒａｔｍｏｄｅｌｏｆＰａｒｋｉｎｓｏｎ′ｓｄｉｓｅａｓｅ（ＰＤ）ｂｙｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅＲｇ１．Ｍｅｔｈｏｄ：ＯｖａｒｉｅｃｔｏｍｉｚｅｄＰＤｒａｔｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｖｅｈｉｃｌｅ，ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ
Ｒｇ１（１０ｍｇ·ｋｇ
－１）ｏｒｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＲ）ａｎｔａｇｏｎｉｓｔＩＣＩ１８２，７８０ｆｏｒ１４ｄ．Ｔｈｅｃｈａｎｇｅｏｆａｐｏｍｏｒｐｈｉｎｅｌｉｎｄｕｃｅｄｒｏｔａｔｉｏｎａｌｂｅｈａｖ
ｉｏｒｉｎＰＤｒａｔｓｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ｔｈｅｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｐｉｄｃｈｒｏｍｏｔｏｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＬＣ）ｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆＤＡ，ｄｉ
ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｉｃａｃｉｄ（ＤＯＰＡＣ）ａｎｄｈｏｍｏｖａｎｉｌｉｃａｃｉｄ（ＨＶＡ）ｉｎｓｔｒｉａｔｕｍ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｒｇ１ｔｒｅａｔｍｅｎｔｃｏｕｌｄａｍｅｌｉｏｒａｔｅｔｈｅＰＤｒａｔ′ｓ
ｒｏｔａｔｉｏｎａｌｂｅｈａｖｉｏｒｉｎｄｕｃｅｄｂｙａｐｏｍｏｒｐｈｉｎｅ（Ｐ＜０．０１）．ＴｈｉｓｅｆｅｃｔｃｏｕｌｄｂｅｂｌｏｃｋｅｄｂｙＥＲａｎｔａｇｏｎｉｓｔＩＣＩ１８２，７８０．ＴｈｅＤＡ，
ＤＯＰＡＣａｎｄＨＶＡｌｅｖｅｌｓｉｎｔｈｅｉｎｊｕｒｅｄｓｉｄｅｏｆＳｔｒｆｏｒＰＤｒａｔｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｉｎｔａｃｔｓｉｄｅ（Ｐ＜０．０１）．
Ｒｇ１ｔｒｅａｔｍｅｎｔｃｏｕｌｄｉｎｃｒｅａｓｅＤＡｃｏｎｔｅｎｔｓｉｎｔｈｅｉｎｊｕｒｅｄｓｉｄｅｏｆＳｔｒ（Ｐ＜０．０１）．ＩＣＩ１８２，７８０ｃｏｕｌｄｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｂｌｏｃｋｔｈｅｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃ
ｔｉｖｅｅｆｅｃｔｓｏｆＲｇ１．ＴｈｅＤＡｃｏｎｔｅｎｔｓａｎｄｉｔｓｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｉｎｔｈｅｉｎｊｕｒｅｄｓｉｄｅｏｆｔｈｅＩＣＩｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄｃｏｍ
ｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅＲｇ１ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＧｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅＲｇ１ｍａｙｈａｖｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｅｃｔｓｏｎｔｈｅｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃｎｅｕｒｏｎｓｆｏｒｔｈｅ
６ＯＨＤＡｉｎｄｕｃｅｄＯＶＸｒａｔｍｏｄｅｌｏｆＰＤ，ＥＲ．Ｍａｙｂｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｃｔｉｏｎ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅＲｇ１；Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ＇ｓｄｉｓｅａｓｅ；ｄｏｐａｍｉｎｅ；ｓｔｒｉａｔｕｍ；ｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ；ｒａｔ
［责任编辑 古云侠］
［收稿日期］ ２００７０８１０
［基金项目］ 重庆市卫生局科学基金（０４２１４３）；重庆市自然科学基金（ＣＳＴＣ，２００５ＢＢ５３１５）
［通讯作者］ 谢鹏，Ｔｅｌ：（０２３）６８４８５４９０，Ｅｍａｉｌ：ｘｉｅｐｅｎｇ５８＠２１ｃｎ．ｃｏｍ
刺五加注射液体外诱导骨髓基质细胞分化为
神经元样细胞的机制研究
杨 琴１，谢 鹏１，曾志磊１，李 傲２，杨 军１，李咏梅３
（１．重庆医科大学 附属第一医院 神经内科 重庆市神经病学重点实验室，重庆 ４０００１６；
２．重庆医科大学 药学院，重庆 ４０００１６；
３．重庆医科大学 附属第一医院影像科，重庆 ４０００１６）
［摘要］ 目的：研究核因子κＢ（ＮＦκＢ）在刺五加诱导骨髓基质细胞（ＭＳＣｓ）分化为神经元样细胞中的作用。
方法：试验分对照组和刺五加诱导组。采用倒置显微镜观察细胞形态；免疫荧光检测 ＭＳＣｓ表型、诱导后神经细胞
标记蛋白表达和ＮＦκＢ亚基ｐ６５核移位情况；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测诱导组、对照组 ＩκＢα的表达。结果：刺五加诱导
１ｈ，可见部分细胞体积缩小，立体感增强，胞体收缩成锥形或球形；诱导５ｈ，较多细胞成三角形或球形，细胞微丝收
缩，伪足形成细长突起，局部交织成网，部分细胞脱落、死亡。诱导７ｄ，多数细胞成锥形、三角形、球形，交织成网，
形成较典型的神经元样细胞。对照组５ｈ时细胞无明显形态变化，７ｄ时偶见锥形细胞。免疫荧光检测到诱导组诱
导１ｈ时ｎｅｓｔｉｎ表达即为强阳性，到第７天仍为阳性，而βⅢ Ｔｕｂｕｌｉｎ在第１小时为弱阳性，３，５ｈ则为强阳性，并持
续到７ｄ仍为阳性。神经细胞特异性烯醇化酶（ＮＳＥ）在第３小时为弱阳性，第５，７天则为强阳性，未见胶质细胞标
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第３３卷第１５期
２００８年８月
中 国 中 药 杂 志
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记蛋白ＧＡＦＰ的表达；对照组各标记蛋白表达均为阴性或可疑或弱阳性。对照组出现ｐ６５由胞浆向胞核移位，而诱
导组ｐ６５信号主要仍在胞浆中表达。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ发现诱导前ＩκＢα蛋白相对ＩＡ为１０，诱导后刺五加组ＩκＢα蛋白
相对ＩＡ为０４５５６±０１００８，较诱导前明显下降（Ｐ＜００１）。诱导后对照组ＩκＢα蛋白相对ＩＡ为００２９６±０００９９，较
诱导前及诱导组明显下降（Ｐ＜００１）。结论：刺五加可诱导ＭＳＣｓ分化为神经元样细胞。在此过程中，刺五加可以抑
制ＮＦκＢ的活化。
［关键词］ 骨髓基质细胞；刺五加注射液；核因子κＢ；分化；神经元
［中图分类号］Ｒ２８５．５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）１５１８５９０６
骨髓基质细胞（ｍａｒｏｗｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｓ，ＭＳＣｓ）是具
有多项分化潜能的成体干细胞之一，在一定的诱导条
件下可分化为神经元样细胞［１４］。但到目前为止，
ＭＳＣｓ分化为神经元样细胞的具体机制尚不清楚。核
因子κＢ（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｋａｐｐａＢ，ＮＦκＢ）是细胞信号
传导的主要转录因子之一，参与了细胞增殖和分化过
程［５］。已有的研究发现，黄芩苷、β巯基乙醇诱导
ＭＳＣｓ分化为神经元样细胞时，可抑制ＮＦκＢ的过度
活化［６８］。作者的前期工作观察到刺五加能诱导
ＭＳＣｓ分化为神经元样细胞。为了解 ＮＦκＢ是否在
此过程中起作用，作者研究了 ＮＦκＢ在刺五加诱导
ＭＳＣｓ分化过程中的作用，初步探讨其分化的机制，为
中药在细胞移植领域中的应用提供理论依据。
１ 材料
１．１ 动物 健康４周龄 Ｗｉｓｔａｒ大鼠，雌雄不限，由
重庆医科大学实验动物中心提供，合格证号 ＳＣＸＫ
（渝）２００２０００１。
１．２ 药物与主要试剂 刺五加注射液购自黑龙江
完达山制药厂（批号２００５０４０５１）；ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养
基购自Ｈｙｃｌｏｎｅ（ＳＨ３００２３．０１Ｂ）公司；Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ，美
国，００５０１２９ＳＡ）；碱性成纤维细胞生长因子（ｂａｓｉｃ
ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ｂＦＧＦ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ，美
国，１００１８Ｂ）；抗体：兔抗大鼠抗巢蛋白（ｎｅｓｔｉｎ）单
抗（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，美国，ＳＣ３３６７７）、兔抗大鼠抗胶质
纤维酸性蛋白（ｇｌｉａｌｆｉｂｒｉｌａｒｙａｃｉｄｉｃｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＡＰ）
单抗（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，美国，ＳＣ３３６７３）、小鼠抗大鼠抗
βⅢ ｔｕｂｕｌｉｎ单抗（ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ，
１６２３０）；ＮＦκＢｐ６５抗体购自 ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司（ＳＣ
８００８），小鼠抗大鼠ＩκＢα，ＣＹ３标记的羊抗大鼠二抗
（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ，ＡＰ１８１Ｃ），兔抗大
鼠神经细胞特异性烯醇化酶多抗（ＮＳＥ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，
Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ，ＡＢ９５１），ＣＤ５４（ＢＡ２１８９）、
ＣＤ１４（ＢＡ０７１９），ＣＤ４４（ＢＡ０３２１）一抗及羊抗小鼠二
抗ＦＩＴＣ（ＢＡ１１０１）和兔抗鼠碱性磷酸酶（ＢＡ１０１２）
（武汉博士德公司），兔抗人 βａｃｔｉｎ多克隆抗体
（ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司），胎牛血清购自杭州四季青公司，
０２５％胰蛋白酶－００４％ＥＤＴＡ购自Ｈｙｃｌｏｎｅ公司，
其余试剂均为国产分析纯。
２ 方法
２．１ 大鼠ＭＳＣｓ分离培养 将大鼠脱颈处死，浸入
７５％乙醇中５ｍｉｎ，无菌条件下取出双侧股骨、胫
骨、肱骨，剔除肌肉和脂肪组织，露出骨骺端，用 ５
ｍＬＤＭＥＭ／Ｆ１２完全培养液（含１０％胎牛血清，１％
青、链霉素）冲洗骨髓，吸管充分吹打混匀，制成单
细胞悬液，稀释后，调整细胞密度为２×１０６个／ｍＬ，
接种于２５ｃｍ２塑料培养瓶内，置３７℃，５％ＣＯ２饱和
湿度的 ＣＯ２细胞培养箱。２４ｈ后弃去未贴壁细胞，
更换培养液，以后每３ｄ换液１次。贴壁细胞接近
８０％～９０％融合后，用０２５％胰蛋白酶００４％ＥＤ
ＴＡ消化传代接种，每隔７２ｈ换液，传３代后接种于
置有盖玻片的 ６孔培养板培养 ３ｄ，达到 ８０％ ～
９０％融合后，进行诱导实验。原代、第３代的 ＭＳＣｓ
接种于预先置有盖玻片的２４孔板，培养３ｄ，ＰＢＳ缓
冲液冲洗３次，４％多聚甲醛固定３０ｍｉｎ，行细胞表
型鉴定。
２．２ ＭＳＣｓ诱导分化实验 参考文献［４，６］方法，
ＭＳＣｓ达到８０％ ～９０％融合后，除去 ＤＭＥＭ／Ｆ１２完
全培养基，ＰＢＳ液清洗３次。刺五加诱导组加入预
诱导液（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基，１０％胎牛血清，１０μｇ
·Ｌ－１ｂＦＧＦ）培养２４ｈ，换用诱导液（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培
养基，１００ｍＬ·Ｌ－１刺五加）诱导５ｈ，再换用维持液
（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基，１００ｍＬ·Ｌ－１刺五加，ｂＦＧＦ１０
μｇ·Ｌ－１，２％Ｂ２７）继续维持７ｄ；空白对照组预诱导
同刺五加组，诱导时仅加入ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基诱导
５ｈ，换用维持液（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基，ｂＦＧＦ１０μｇ
·Ｌ－１，２％Ｂ２７）继续维持７ｄ。各组分别于诱导前、
诱导后１，３，５ｈ，７ｄ吸去培养液，ＰＢＳ缓冲液冲洗３
次，４％多聚甲醛固定３０ｍｉｎ备用。
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２．３ 免疫细胞化学染色 采用间接免疫荧光法。
将制备好的载玻片用 ＰＢＳ缓冲液洗涤３次，０３％
ＴｒｉｔｏｎＸ１００破膜３０ｍｉｎ，ＰＢＳ缓冲液洗涤３次，正
常血清封闭２０ｍｉｎ，吸去血清，不洗，分别加入兔抗
大鼠ＣＤ５４（１∶１００）、兔抗大鼠 ＣＤ４４（１∶１００）、兔抗
大鼠ＣＤ１４（１∶１００）、兔抗大鼠ＮＳＥ（１∶１００）、兔抗大
鼠ｎｅｓｔｉｎ、兔抗大鼠 ＧＦＡＰ、兔抗大鼠 βⅢ Ｔｕｂｕｌｉｎ
（１∶２００）一抗，对照组用 ＰＢＳ液代替一抗，４℃过
夜，ＰＢＳ缓冲液洗涤３次，加入羊抗小鼠二抗ＦＩＴＣ
（１∶５０）或羊抗小鼠二抗ＣＹ３（１∶２００），室温孵育２
ｈ，５０％甘油封片，激光共聚焦显微镜观察拍照。每
张玻片采用双人双盲随机记数２００个细胞，计算阳
性细胞百分比例，其中阳性细胞≥６１％为强阳性
（），３０％～６０％为阳性（），６％～３０％为弱阳性
（＋），１％～５％为可疑（±），＜１％为阴性（－）。
２．４ ｐ６５核移位定量检测 采用间接免疫荧光法，
观察诱导前、诱导后５ｈｐ６５核移位情况。实验步骤
同前，其中一抗采用ｐ６５单抗，工作效价１∶１００，二抗
采用羊抗小鼠ＦＩＴＣ，工作效价１∶５０，荧光显微镜观察
绿色荧光信号位置，每张玻片采用双人双盲随机记数
２００个细胞，以胞核绿色荧光信号阳性细胞占所有观
察细胞数的百分比，代表ＮＦκＢ激活的百分率。
２．５ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析 观察诱导前、诱导后 ５ｈ
ＩκＢα的表达情况。各组按分组时间以 ＰＢＳ冲洗细
胞３次，然后加入 ＲＩＰＡ细胞裂解液２００μＬ及１００
ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＰＭＳＦ２μＬ冰上裂解３０ｍｉｎ，１２０００×ｇ
离心３０ｍｉｎ。收集上清蛋白质样本，Ｂｒａｄｆｏｒｄ法检
测蛋白浓度，加入５倍上样缓冲液，在沸水中变性５
ｍｉｎ，取５０μｇ蛋白用 ＳＤＳＰＡＧＥ分离后电转移至
ＰＶＤＦ膜上。取出膜用脱脂奶粉封闭１ｈ，然后置于
杂交袋中，加入 ＩκＢα抗体（１∶１０００），４℃孵育过
夜。ＴＢＳＴ漂洗 １０ｍｉｎ×３次，ＨＲＰ标记兔抗大鼠
ＩｇＧ（１∶１０００），３７℃孵育１ｈ，ＴＢＳＴ漂洗１０ｍｉｎ×４
次。ＰＶＤＦ膜上覆盖足量 ＥＣＬ发光试剂，化学发光
显色，照相。试验重复３次，结果经 ＢｉｏＲａｄ公司图
像分析软件ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ４４０分析，测定各蛋白显
色条带和内参 βａｃｔｉｎ蛋白显色条带的累积吸光度
（ＩＡ），以目标蛋白与对应的内参蛋白显色条带ＩＡ的
比值，即相对ＩＡ值，表示目标蛋白的相对表达量。
２．６ 统计学处理 所有实验数据以 珋ｘ±ｓ表示，采
用ＳＰＳＳ１００统计软件分析实验结果，单因素方差
分析进行显著性检验，Ｐ＜００５为有显著性差异。
３ 结果
３．１ ＭＳＣｓ生长形态学观察 大鼠全骨髓细胞悬液
接种于塑料培养瓶后，４ｈ倒置显微镜观察，少数细胞
贴壁，呈圆形、短梭形或三角形，核位于中央。１２ｈ时
短梭形或三角形贴壁细胞增多。２４ｈ更换培养液后，
２～３ｄ出现长梭形贴壁细胞，圆形细胞减少，并可见
细胞集落形成。初期的细胞集落由几个或几十个细
胞组成；５～６ｄ圆形细胞进一步减少，而梭形细胞集
落增多。集落中心细胞密度增大，外周细胞逐渐稀
疏，呈放射状分布，细胞集落大小不等；１周左右，细
胞密度进一步增加，细胞接近８０％～９０％融合时原代
培养结束。原代培养消化后细胞数达（５～６）×１０５
个／ｍＬ。刚传代的细胞呈圆形，散在均匀分布于瓶
底，８ｈ后形态重新变为长梭形成纤维细胞样，生长潜
伏期较短，为１～２ｄ，２～４ｄ是细胞快速增殖期，５～６
ｄ达到大部分融合。传至３代后，细胞形态很均匀，
呈单层漩涡状排列的长梭形成纤维样细胞，细胞仍然
保持良好的增殖能力（图１，２）。
图１ 原代第７天ＭＳＣｓ（×２０）
图２ 第３代ＭＳＣｓ（×２０）
３．２ ＭＳＣｓ细胞表型鉴定 原代、第３代细胞表面
抗原 ＣＤ５４表达阳性依次为（７３３８±１４６）％，
（９５１８±３６６）％；ＣＤ４４表达阳性依次为（７６５６±
６２０）％，（９４３６±３４７）％；ＣＤ１４表达阳性依次为
（２３１９±３５３）％，（２３７±０６１）％，表明培养的
ＭＳＣｓ传到第３代后纯度已达到９０％以上。
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３．３ ＭＳＣｓ诱导后形态学观察 两组预诱导２４ｈ，
细胞形态无明显变化。刺五加诱导组诱导１ｈ，部分
细胞体积减小，立体感增强，胞体收缩成锥形或球
形；随时间推移，锥形或球形细胞增多；诱导５ｈ，较
多细胞成三角形或球形，细胞微丝收缩，伪足形成细
长突起，局部交织成网，有些细胞周围有光晕，类似
神经细胞，部分细胞脱落、死亡（图３）；空白对照组
无明显变化（图４）。诱导７ｄ，多数细胞成锥形、三
角形、球形，交织成网，形成较典型的神经元样细胞，
并见部分细胞伸出长轴突（图５）。空白对照组偶见
锥形细胞（图６）。
图３ 刺五加组诱导５ｈ（×４０）
图４ 对照组诱导５ｈ（×４０）
３．４ ＭＳＣｓ诱导后细胞鉴定 间接免疫细胞荧光染
图５ 刺五加组诱导７ｄ（×２０）
图６ 对照组诱导７ｄ（×２０）
色提示，刺五加诱导组诱导１ｈ时ｎｅｓｔｉｎ表达即为强
阳性，到第７天仍为阳性，而βⅢＴｕｂｕｌｉｎ在第１小时
为弱阳性，３，５ｈ则为强阳性，并持续到７ｄ仍为阳
性。ＮＳＥ在第３小时为弱阳性，第５小时，７ｄ则为强
阳性，未见胶质细胞标记蛋白ＧＡＦＰ的表达；对照组
各标记蛋白表达均为阴性或可疑或弱阳性（表１）。
３．５ ｐ６５核移位检测结果 诱导前，ＭＳＣｓ细胞ｐ６５
信号主要位于胞浆（９０４±２３）％。刺五加组诱导
后，ｐ６５信号主要仍在胞浆（６７８±７３）％，但是较诱
导前有显著降低（Ｐ＜００１）；对照组诱导后，ｐ６５信号
主要在胞核，而胞浆中信号明显减弱（１３６±４３）％，
较诱导前和刺五加组均有显著降低（Ｐ＜００１）。
表１ 神经细胞标记蛋白的间接免疫荧光染色结果
指标
刺五加组
预诱导２４ｈ 诱导１ｈ 诱导３ｈ 诱导５ｈ 诱导７ｄ
空白组
预诱导２４ｈ 诱导１ｈ 诱导３ｈ 诱导５ｈ 诱导７ｄ
ｎｅｓｔｉｎ － － － － － ＋
βⅢ Ｔｕｂｕｌｉｎ － ＋ － － － ± ＋
ＮＳＥ － ± － － － ± ＋
ＧＡＦＰ － － － － － － － － － －
以上结果提示，对照组无血清培养状态可激活
ＭＳＣｓ中ＮＦκＢ，使之向胞核移位，而刺五加可抑制
ＮＦκＢ向胞核的移位（图７～９）。
３．６ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果 诱导前 ＩκＢα蛋白相对 ＩＡ
为１００００，诱导后刺五加组 ＩκＢα蛋白相对 ＩＡ为
０４５５６±０１００８，较诱导前明显下降（Ｐ＜００１）。
诱 导 后 对 照 组 ＩκＢα 蛋 白 相 对 ＩＡ 为
００２９６±０００９９，较诱导前及诱导组明显下降
（Ｐ＜００１）。表明刺五加诱导 ＭＳＣｓ分化为神经细
胞时抑制了ＮＦκＢ的活化（图１０）。
４ 讨论
ＭＳＣｓ具有多向分化潜能，不仅可分化为多种中
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图７ ＭＳＣ诱导前，ｐ６５主要在胞浆中（×３００，ＦＩＴＣ）
图８ 对照组诱导后，ｐ６５移位到胞核中（×３００，ＦＩＴＣ）
图９ 刺五加组诱导后，ｐ６５仍在胞浆中（×２００，ＦＩＴＣ）
图１０ 诱导后ＩκＢα的表达（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）
胚层来源的间质细胞，如软骨细胞、成骨细胞、脂肪
细胞、成肌细胞等，还可在特定条件下跨越胚层横向
分化为神经细胞［１４］。Ｗｏｏｄｂｕｒｙ［４］等采用抗氧化剂
β巯基乙醇（βＭＥ）、二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）、叔丁基
对羟基茴香醚（ＢＨＡ）等在体外诱导ＭＳＣｓ成为神经
细胞。作者［６８］采用抗氧化剂 βＭＥ及中药黄芩苷
诱导成年大鼠 ＭＳＣｓ表达 ＮＳＥ，结果提示，ＭＳＣｓ可
以定向诱导分化为神经细胞或神经元样细胞。并且
ＭＳＣｓ具有取材方便，增殖速度快，可自体获取，回植
后不会发生免疫排斥反应；避免了伦理道德方面的
争论，能够最大限度地满足临床需要，是理想的种子
细胞。因此ＭＳＣｓ将在神经系统损伤和变性疾病细
胞替代疗法中起重要作用。在体外建立 ＭＳＣｓ分
离、纯化和扩增，以及筛选和优化诱导 ＭＳＣｓ向神经
元样细胞转化的最佳方案是细胞治疗的前提。
本研究采用简单易行的全骨髓贴壁培养方法，
多次换液和传代以纯化、扩增 ＭＳＣｓ，获得的 ＭＳＣｓ
在体外有较强的扩增能力。传至第３代时 ＭＳＣｓ的
重要表面标记 ＣＤ４４，ＣＤ５４的表达已达９０％以上，
而造血干细胞的表面标记 ＣＤ１４则下降至２３７％。
表明本研究所采用的细胞培养条件适于 ＭＳＣｓ的纯
化和扩增，培养细胞为 ＭＳＣｓ。第３代以后的 ＭＳＣｓ
已可用于细胞的诱导分化和细胞治疗。
刺五加是临床治疗心脑疾病的常用药物，能够
补肝肾，益精壮骨［９］。本研究证实刺五加能够定向
诱导ＭＳＣｓ表达多种神经细胞相关的特异性标记蛋
白，如神经元细胞标记物 ＮＳＥ，βⅢ Ｔｕｂｕｌｉｎ，不表达
胶质细胞标记蛋白 ＧＦＡＰ，证明诱导后细胞具备了
神经元细胞的部分特点。
ＮＦκＢ是分布和作用均十分广泛的、存在于真
核细胞内的一种具有基因转录多向调控作用的转录
因子，参与免疫反应、炎症、氧应激等多种重要的病
理生理过程及细胞增殖和分化过程［５］。在静止细
胞中，ＮＦκＢ与其抑制蛋白（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎκＢ，ＩκＢ）结
合，以三聚体（即 ｐ５０，ｐ６５形成的异源二聚体和抑
制蛋白ＩκＢα）无活性形式存在于细胞质中。细胞受
肿瘤坏死因子α（ＴＮＦα）、白细胞介素ＩＬ１等细胞
外信号刺激后，ＩκＢα激酶（ＩＫＫ）激活，使 ＩκＢα经
快速磷酸化、泛素化后降解，释放出的 ＮＦκＢ核易
位，与κＢ反应基因增强子区域中的共有κＢ序列结
合，从而启动和调控相应基因的转录［５］。
本研究发现对照组无血清条件下可导致ｐ６５大
量由胞浆向胞核移位，同时降低细胞内 ＩκＢα的信
号强度，说明血清剥夺状态促进了 ＮＦκＢ的活化。
刺五加则对血清剥夺状态所致ｐ６５向胞核移位有抑
制作用，并减轻ＩκＢα下降程度，表明刺五加可抑制
ＮＦκＢ的活化。
活化的ＮＦκＢ可以调控下游基因的表达，如粒
巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、粒系集落刺激
因子（ＧＣＳＦ）、白细胞介素３（ＩＬ３）、白细胞介素６
（ＩＬ６）等细胞因子［５］。这些细胞因子可以阻碍干细
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第３３卷第１５期
２００８年８月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ １５
Ａｕｇｕｓｔ，２００８
胞进一步分化。本研究对照组中诱导分化效果不
佳，而刺五加组诱导分化明显可能与此有关。
已知的其他中药如川芎嗪、大黄、青藤碱、丹参、
丹参酮ＩＡ、雷公藤提取物、三七总皂苷、粉防己碱、
黄芩提取物、姜黄素及其他一些中药复方制剂均能
通过调控ＮＦκＢ的活化，从而有利于各种疾病的治
疗［１０１３］。一些诱导 ＭＳＣｓ分化的诱导剂，如２巯基
乙醇、ＤＭＳＯ，ＢＨＡ，黄芩苷等，都可以抑制 ＮＦκＢ的
活化［６７，１１１２］。因此推测刺五加诱导ＭＳＣｓ分化为神
经元样细胞的可能机制是通过抑制 ＮＦκＢ的活化，
有无其他机制参与需要进一步的研究。
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Ｓｔｕｄｙｏｆｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｎｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｍａｒｒｏｗｓｔｒｏｍａｃｅｌｓｉｎｔｏ
ｎｅｕｒｏｎｌｉｋｅｃｅｌｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＣｉｗｕｊｉａｉｎｊｅｃｔｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏ
ＹＡＮＧＱｉｎ，ＸＩＥＰｅｎｇ，ＺＥＮＧＺｈｉｌｅｉ，ＬＩＡｏ，ＹＡＮＧＪｕｎ，ＬＩＹｏｎｇｍｅｉ
（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＮｅｕｒｏｌｏｇｙ，ｔｈｅＦｉｒｓｔＨｏｓｐｉｔａｌＡｆｉｌｉａｔｅｄｏｆＣｈｏｎｇｑｉｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＣｈｏｎｇｑｉｎｇＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆ
Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｏｎｇｑｉｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４０００１６，Ｃｈｉｎａ；
２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ＣｈｏｎｇｑｉｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４０００１６，Ｃｈｉｎａ；
３ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＩｍａｇｉｎｇ，ｔｈｅＦｉｒｓｔＨｏｓｐｉｔａｌＡｆｉｌｉａｔｅｄｏｆＣｈｏｎｇｑｉｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４０００１６，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｓｔｕｄｙｗｈｅｔｈｅｒｔｈｅｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒｋａｐｐａＢ（ＮＦκＢ）ｐｌａｙａｒｏｌｅｉｎｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｍａｒｏｗｓｔｒｏｍａ
ｃｅｌｓ（ＭＳＣｓ）ｉｎｔｏｎｅｕｒｏｎｌｉｋｅｃｅｌｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＣｉｗｕｊｉａｉｎｊｅｃｔｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｒａｔｓｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐａｎｄ
Ｃｉｗｕｊｉａｉｎｄｕｃｅｄｇｒｏｕｐ．Ｃｅｌｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｗｉｔｈｉｎｖｅｒｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＭＳＣｓｐｈｅｎｏｔｙｐｅ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｎｅｕｒａｌｍａｒｋｅｒｐｒｏｔｅｉｎ
ａｎｄｎｕｃｌｅｕｓｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｏｆＮＦκＢｓｕｂｕｎｉｔＲｅｌＡ（ｐ６５）ａｆｔｅｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ；ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩκＢαｉｎ
ＣｉｗｕｊｉａｉｎｄｕｃｅｄｇｒｏｕｐａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．Ｒｅｓｕｌｔ：ＴｈｅｄｅｃｒｅａｓｅｄｖｏｌｕｍｅｏｆｓｏｍｅＭＳＣｓ，ｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｅｄ
ｔｈｒｅｅｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｓｈｒｉｎｋａｇｅｏｆｃｅｌｂｏｄｙｗｉｔｈｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｓｐｉｒｅｏｒｒｏｕｎｄｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄａｆｔｅｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎｂｙＣｉｗｕｊｉａｆｏｒ１
ｈｏｕｒ．Ａｆｔｅｒ５ｈｏｕｒｅｘｐｏｓｕｒｅｔｏＣｉｗｕｊｉａ，ｃｈａｎｇｅｓｉｎｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆＭＳＣｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｏｗｓ：ａｐｐｅａｒａｎｃｅｏｆｍｏｒｅｔｒｉａｎｇｕｌａｒｏｒｒｏｕｎｄ
ｓｈａｐｅｓｃｅｌｓ，ｒｅｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｆｉｌａｍｅｎｔｉｎＭＳＣｓ，ｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｓｌｅｎｄｅｒｐｒｏｃｅｓｓｆｒｏｍｐｓｅｕｄｏｐｏｄｗｉｔｈｒｅｔｉｃｕｌａｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｅｘｆｏｌｉａｔｉｏｎａｎｄ
ｎｅｃｒｏｓｉｓ．Ａｆｔｅｒ７ｄａｙｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，ｍｏｓｔＭＳＣｓｂｅｃａｍｅｔｒｉａｎｇｕｌａｒａｎｄｒｏｕｎｄｓｈａｐｅｓ，ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇａｔｙｐｉｃａｌｎｅｕｒｏｎａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｃｅｍｅｔｈｏｄｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｎｅｓｔｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄｉｓｐｌａｙｅｄｉｎｔｅｎｓｉｖｅｌｙｐｏｓｉｔｉｖｅｉｎＣｉｗｕｊｉａｇｒｏｕｐａｔ１ｈｏｕｒ，ａｎｄｓｔｉｌｒｅｍａｉｎｐｏｓｉｔｉｖｅａｔ７
ｄａｙ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，βＩＩＴｕｂｕｌｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｗｅａｋｌｙｐｏｓｉｔｉｖｅａｔ１ｈｏｕｒａｎｄｉｎｔｅｎｓｉｖｅｐｏｓｉｔｉｖｅａｔ３ａｎｄ５ｈｏｕｒ．Ｉｔｗａｓｓｔｉｌｐｏｓｉｔｉｖｅａｔ７
ｄａｙ．ＮＳＥｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｗｅａｋｌｙｐｏｓｉｔｉｖｅａｔ３ｈｏｕｒａｎｄｉｎｔｅｎｓｉｖｅｐｏｓｉｔｉｖｅａｔ５ｈｏｕｒａｎｄ７ｄａｙ．ＧＦＡＰｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｎｅｇａｔｉｖｅ．Ｈｏｗｅｖ
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Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ １５
Ａｕｇｕｓｔ，２００８
ｅｒ，ｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｅｖｅｒｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍａｒｋｅｒｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｎｅｇａｔｉｖｅｏｒｗｅａｋｌｙｐｏｓｉｔｉｖｅ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐ６５ｗａｓｉｎｃｙｔｏｐｌａｓｍ．
ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｍｅｔｈｏｄｓｈｏｗｅｄＩκＢαｐｒｏｔｅｉｎｒｅｌａｔｉｖｅＩＡｗａｓ１．０００ｂｅｆｏｒｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ｉｔｗａｓ０．４５５６±０．１００８ａｆｔｅｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎｉｎＣｉｗｕｊｉａ
ｇｒｏｕｐａｎｄｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｔｈａｎｂｅｆｏｒｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎ（Ｐ＜０．０１）．Ｉｔｗａｓ０．０２９６±０．００９９ａｆｔｅｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎｉｎｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐａｎｄｄｅ
ｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｔｈａｎｂｅｆｏｒｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｉｎＣｉｗｕｊｉａｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｅｄａｔａｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＭＳＣｓｃａｎｉｎｄｕｃｅｄｉｆ
ｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎｔｏｎｅｕｒｏｎｌｉｋｅｃｅｌｓｂｙＣｉｗｕｊｉａ，ａｎｄＣｉｗｕｊｉａｃｏｕｌｄｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｏｆＮＦκＢｆｒｏｍｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍｔｏｔｈｅｎｕｃｌｅｕｓ，
ｗｈｉｃｈｍａｙｂｅｒｅｌａｔｅｔｏｔｈｅｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＭＳＣｓｉｎｔｏｎｅｕｒｏｎｌｉｋｅｃｅｌｓ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｍａｒｏｗｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｓ；Ｃｉｗｕｊｉａｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；ＮＦκＢ；ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；ｎｅｕｒｏｎ
［责任编辑 古云侠］
［收稿日期］ ２００７０８１０
［通讯作者］ 张洪泉，Ｔｅｌ：（０５１４）７９７８８２１，Ｅｍａｉｌ：ｈｑｚｈａｎｇｙｚ
＠１２６．ｃｏｍ
雾化吸入银杏叶总黄酮对哮喘小鼠
Ｔｈ１／Ｔｈ２失衡的影响
陈莉莉，翁晓静，李 心，张洪泉
（扬州大学 医药研究所，江苏 扬州 ２２５００１）
［摘要］ 目的：研究银杏叶总黄酮（ｔｏｔａｌｇｉｎｋｇｏｆｌａｖｏｎｅｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ，ＴＦＧ）对哮喘小鼠辅助性Ｔ细胞１／辅助性Ｔ
细胞２（Ｔｈ１／Ｔｈ２）失衡的影响。方法：４８只ＢＡＬＢ／ｃ小鼠随机分为正常组、哮喘组、ＴＧＦ雾化吸入组以及地塞米松
组，以卵蛋白（ＯＶＡ）、氢氧化铝免疫系统致敏和局部激发的方法建立哮喘模型。自实验第２１天起给予ＴＦＧ治疗组
连续雾化吸入５０ｇ·Ｌ－１ＴＦＧ溶液３０ｍｉｎ，地塞米松组腹腔注射地塞米松１ｍｇ·ｋｇ－１，连续１０ｄ。第３２天酶联免
疫吸附实验（ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）法测定肺细胞灌洗液（ｂｒｏｎｃｈａｌｖｅｏｌａｒｌａｖａｇｅｆｌｕｉｄ，ＢＡＬＦ）中
细胞因子γ干扰素（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎγ，ＩＦＮγ）、白介素４（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ４，ＩＬ４）和血清中总免疫球蛋白 Ｅ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ
Ｅ，ＩｇＥ）含量，观察各组肺组织的病理变化，免疫组织化学染色技术检测肺组织中ＧＡＴＡ连接蛋白３（ＧＡＴＡｂｉｎｄｉｎｇ
ｐｒｏｔｅｉｎ３，ＧＡＴＡ３）的表达情况。结果：与模型组比较，ＴＦＧ组 ＢＡＬＦ中 ＩＬ４含量（４９．３０±７９５）ｎｇ·Ｌ－１降低
（Ｐ＜００１）、ＩＦＮγ水平升高（４９０８±５４６）ｎｇ·Ｌ－１（Ｐ＜００１）、血浆总 ＩｇＥ水平降低（９４７±１５２）μｇ·Ｌ－１
（Ｐ＜００１）；模型组支气管平滑肌肥厚，黏膜充血、水肿，管腔内可见黏液栓，并有大量炎性细胞浸润；而 ＴＦＧ组和
地塞米松组小鼠的上述炎症性改变明显减轻；模型组ＧＡＴＡ３表达显著，ＴＦＧ治疗组则明显减轻。结论：雾化吸入
ＴＦＧ对哮喘小鼠有明显的治疗作用，其机制可能与阻断ＧＡＴＡ３的表达、恢复Ｔｈ１／Ｔｈ２平衡有关。
［关键词］ 银杏叶总黄酮；哮喘；Ｔｈ１／Ｔｈ２；雾化吸入
［中图分类号］Ｒ２８５５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）１５１８６５０４
哮喘发病机制复杂，越来越多的研究表明，Ｔ细
胞在哮喘的发生发展中起了重要作用，它们通过释
放Ｔｈ２型细胞因子如ＩＬ４，ＩＬ５等触发炎性反应，导
致嗜酸性粒细胞在气道募集并活化；而 Ｔｈ１细胞则
具有与细胞相反的作用，他们通过释放 Ｔｈ１型细胞
因子如ＩＦＮγ，ＩＬ１２等拮抗 Ｔｈ２型细胞因子的功能
而抑制哮喘反应。目前普遍认为，哮喘患者存在
Ｔｈ２占优势的Ｔｈ１／Ｔｈ２失平衡，如何通过调节 Ｔｈ１／
Ｔｈ２型细胞之间的平衡己成为哮喘免疫治疗的一个
热点［１］。
银杏叶具敛肺，平喘，活血化瘀，止痛的作用，用
于治疗哮喘在我国已有悠久的历史，自古便是定喘
汤的主要成分之一。２０世纪 ８０年代后的研究表
明，银杏叶提取物对哮喘治疗有一定作用。黄酮类
化合物为银杏叶中含量最多的有效成分。本研究通
过含量较高的银杏叶黄酮提取物（含量 ＞６０％）对
哮喘小鼠Ｔｈ１／Ｔｈ２平衡的影响，探讨银杏叶总黄酮
平喘作用的机制，为银杏叶的进一步开发利用提供
理论依据。
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第３３卷第１５期
２００８年８月
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ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ １５
Ａｕｇｕｓｔ，２００８