全 文 ：·1206· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第8期2006年8月
iNOS等有关，产生大量No释放入血，从而产生毒
性作用。
TP是从绿茶中提取的多酚类化合物，主要成
分为儿茶素类，具抗氧化、抗突变、抗癌及抗衰老等
多种生理活性。本研究发现ivTP可呈剂量依赖性
减轻肠I／R所致肝组织形态学改变，表明TP对肠
I／R所致肝损伤具有保护作用。其机制可能为：①抑
制自由基生成，防止脂质过氧化。TP是多酚类化合
物，具很强还原性，可使体内多种过氧化物所产生的
自由基转化为惰性化合物而被清除，并防止脂质过
氧化[1⋯，因而TP可降低肠I／R时MDA的水平。
本研究结果证明了TP抗自由基并防止脂质过氧化
的作用：TP呈剂量依赖性降低肠I／R所致血清和
肝组织中MDA水平的升高，即降低脂质过氧化程
度；而同时呈剂量依赖性增强SOD活力，即提高机
体清除和／或抑制氧自由基能力。②抑制中性粒细胞
聚集。TP呈剂量依赖性减少中性粒细胞在肝的浸
润聚集，从而减轻中性粒细胞的损伤作用。③抑制过
量NO的生成。TP呈剂量依赖性降低外周血及肝
中No水平。推测，TP对内毒素、肿瘤坏死因子、白
介素等多种因子活化iNOS有抑制作用；TP通过抑
制NO与氧自由基相互作用，使OoNO一生成减少，
从而对组织损伤有保护作用。
本研究表明，TP通过保护肠道屏障，抑制自由
基生成，防止脂质过氧化，抑制中性粒细胞聚集及抑
制No的过量生成，对肠I／R引起的肝损伤有保护
作用。TP作为一种资源丰富、成本低廉的天然药物
有着十分广阔的前景。本研究为其扩展临床新用途
提供了有价值的实验依据。
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芍药苷对人骨髓基质细胞HFCL蛋白质表达的作用
郭平1，王升启2
(1．山东中医药大学生化教研室，山东济南250014；2．军事医学科学院放射医学研究所，北京100800)
摘 要：目的 检测芍药苷对人骨髓成纤维样基质细胞系HFCL增殖及蛋白质表达的影响，探讨芍药苷补血作用
的分子机制。方法采用流式细胞术和蛋白质组学方法测定芍药苷对HFCL细胞周期及蛋白质表达的影响。结果
芍药苷能促进HFCL由G。／G-期进入S期，提高增殖指数，使HFCL的9种蛋白质表达上调，5种下调。上调的蛋
白质有Ras相关核蛋白、核纤层蛋白A／C、异柠檬酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、ATP合酶、核蛋白体蛋白质P2和
CCT；下调的蛋白质有人类ee趋化因子和Bax。结论芍药苷能促进HFCL增殖，作用于HFCL多个靶点，促进细
胞结构蛋白质的合成和蛋白质分子伴侣的表达，促进HFCL的能量代谢，抑制HFCL凋亡，间接发挥补血作用。
关键词：芍药苷；骨髓基质细胞；细胞增殖；蛋白质组学
中图分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)08—1206一05
收稿日期：2005—1I-23
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30271617)；全军医药卫生科研基金资助项目(012019)
作者简介：郭平(1960一)，女，四川资中人，副教授，博士，主要从事中药作用分子机制的研究。
Tel：(0531)86253861E—mail：guop86@163．com
*通讯作者王升启Tel：(OLO)66932211E—mail：sqwang@mic．bmi．ac．en
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第8期2006年8月·1207·
Effectofpaeoniflorinonp oteinxpressionofHFCLofhumanbonemarrowstromaicells
GUOPin91，WANGSheng—qi2
(1．ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250014，China；2．InstituteofRadia ionMedicine，
AcademyofMilitaryMedicalSciences，Beijing100850，China)
Abstract：ObjectiveToinvestigatetheffectsofpaeoniflorinonp oliferationandheproteinxpres—
sionofHFCLofhumanbonemarrowstromalcellsandtodiscussmolecularmechanismofbloodenriching
functionsofpaeoniflorin．MethodsFlowcytometryandproteomicswereu edrespectivelytom asurethe
effectofpaeoniflorinoncellcycleandproteinxpressionofHFCL．ResultsPaeoniflorincouldpromote
HFCLfromGo／G1phasetoSphase，increasep oliferativeindex，up—regulateninekindsofproteins，and
down—regulatefivekindsofproteinsofHFCL．Theproteinsup—regulatedincludeRas—relatednuclearpro—
tein，1aminA／C，isocitratedehydrogenase3(NAD+)，triosephosphateisomerase，ATPsynthase，riboso—
malproteinP2，andchaperonincontainingt-complexolypeptide1．ConclusionThroughpromoting
HFCLproliferation，actingmul pleproteintargets，enhancingthesynthesisofcytoarchitecturepro—
teinsandthexpressionofproteinchaperonin，increasingthenergymetabolismofHFCL，andsuppress—
ingtheapoptosisfHFCL，paeoniflorinplaysindirectlybloodenrichingfu ction．
Keywords：paeoniflorin；bonema rowstr malc lls；cellproliferation；proteomics
白芍是经典补血方剂四物汤的4味药之一，芍
药苷(paeoniflorin)是白芍的主要有效成分，具有
补血、保护神经元及抗心、脑血管损伤等多种作用。
研究显示，芍药苷能促进骨髓造血生长因子的表
达[1]，促进多种骨髓造血祖细胞的增殖[2]。但有关芍
药苷对骨髓基质细胞作用的报道较少。本研究采用
蛋白质组学技术，从整体蛋白质的水平上探讨芍药
苷对人骨髓成纤维样基质细胞系(normalhuman
bonemarrowfibroblastoids romalce lline。
HFCL)蛋白质表达的影响，以考察芍药苷对HFCL
的作用靶点和补血的分子机制。
1材料
1．1 药物：芍药苷购自中国药品生物制品检定所，
质量分数99．0％。用不含血清的IMDM培养液将
芍药苷配制为5mg／mL的溶液，滤过除菌备用。
1．2 细胞系：HFCL来源于正常胎儿骨髓基质细
胞，由中国医学科学院血液学研究所姜学英教授建
系，军事医学科学院放射医学研究所九室保存。培养
于含10％胎牛血清的IMDM培养液，实验均使用
处于对数生长期的细胞。
1．3主要试剂及仪器：IMDM培养液、胎牛血清购
自GibcoBRL公司，胰酶购自Roche公司，丙烯酰
胺、Ⅳ，Ⅳ7一甲叉双丙烯酰胺、Tris—base、过硫酸铵、
四甲基乙二胺、十二烷基磺酸钠(SDS)、尿素、丙基
磺酸盐、Pharmalyte3～10、固定干胶条(immobi—
lizedpHgradientgel，IPG)、IPG缓冲液、低相对分
子质量蛋白质Marker、甘油、琼脂糖、溴酚蓝等均购
自AmershamBiosciences公司。三氟乙酸、碘乙酰
胺购自AcrosOrganics公司。乙腈购自Fisher公
司。碘化丙啶购自Pharmingen公司。其他试剂均为
国产分析纯。
Napco--5410C02培养箱购自Heraeus公司，蛋
白质双向电泳及电泳图谱图像处理采用Amersham
Biosciences公司蛋白质组学研究配套仪器：EttanTM
IPGphor等电聚焦仪，EttanTMDALTsix二向垂直电
泳仪，MultiTempnl温控循环水浴，ProcessorPlus
BaseUnit全自动染色仪，ImageScanner扫描仪。
2 方法
2．1 芍药苷剂量的确定：首先用MTT法检测终质
量浓度分别为0．0078、0．0156、0．0313、0．0625、
0．125、0．25、0．5、1、2、4mg／mL四物汤对HFCL
细胞增殖率的影响。实验结果统计显示，质量浓度在
0．008～1mg／mL四物汤对HFCL的增殖均有显
著的促进作用，其中以质量浓度0．0313mg／mL时
作用最强，并按这一剂量计算芍药苷用量。再根据本
课题组前期研究[3]，芍药苷在四物汤中的量与四物
汤的质量分数为0．265％，折算芍药苷给药终质量
浓度为0．0829／zg／mL。细胞给药时，用不含血清的
IMDM培养液将芍药苷储存液(5mg／mL)100倍
稀释后作为芍药苷应用液。
2．2流式细胞术测定细胞周期：将处于对数生长期
的HFCL细胞悬液接种在25cm2培养瓶中，每瓶接
种4×105个细胞。经CO。培养箱孵育24h，换无血
清培养液，继续孵育48h。换3％低血清培养液。细
胞分为对照组和芍药苷(终质量浓度为0．0829
btg／mL)组，每组4瓶细胞，细胞给药后继续避光培
养12h。消化细胞，离心，吸弃上清液，PBS洗涤细
胞。加入300肛L含5％血清的PBS，再加入700p．L
万方数据
·1208· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第8期2006年8月
无水乙醇，充分摇匀，一20℃固定细胞48h以上。
将固定细胞离心，PBS洗涤。加入100肛LRNaseA
溶液，37℃水浴放置30min以消化RNA，加入
500弘L碘化丙啶溶液，避光反应30min，用流式细
胞仪进行荧光检测，检测各细胞周期DNA水平。计
算细胞增殖指数(PI)。
H=研并礁孺×100％
2．3用蛋白质组学技术确定差异蛋白质
2．3．1细胞培养及给药：HFCL传代培养。将处于
对数生长期的HFCL细胞接种人50am2培养瓶中，
每瓶接种1×106个细胞，C0。培养箱孵育，待贴壁
80％后，换无血清培养液，继续孵育48h。换3％低
血清培养液继续孵育，细胞分为对照组和芍药苷组。
对照组加培养液．12．1mL，芍药苷组加培养液12．1
mL、芍药苷应用液20肛L(终质量浓度0．0829弘g／
mL)。细胞给药后37℃、5％CO。培养箱继续孵育
24h。
2．3．2蛋白质提取：收集细胞于离心管，PBS洗涤
3次，转入EP管。离心，弃上清。加入细胞裂解液，
液氮冻融3次，加入RNaseA，冰浴放置20min。
4℃、12000r／min离心30min，取上清液。用Brad—
ford法测定蛋白质的量。
2．3．3双向电泳：电泳重复3次。IPG(pH3～10)
24am，采用胶内泡涨法。将含有2mg蛋白质的两
组细胞蛋白质提取液分别与IPG胶条溶涨液混合，
进行一向等电聚焦电泳。电泳参数：30V、12h，200
V、1h，500V、1h，1000V、1h，8000V、13h。IPG
胶条分别在含有DTT和碘乙酰胺的平衡液中平衡
15min。将IPG胶条置于预制的12．5％SDS一聚丙
烯酰胺凝胶(简称凝胶)上，进行第二向SDS一聚丙
烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)。电泳参数：80mA、
40min；100mA至溴酚蓝迁移至SDS—PAGE凝胶
底部边缘。
2．3．4凝胶染色与脱色：考马斯亮蓝染色液染色6
h，考马斯亮蓝脱色液脱色12h。
2．3．5凝胶扫描分析及统计处理：扫描凝胶，分析
电泳图谱。差异蛋白质点标准化量以z4_-S表示，统
计分析采用t检验。
2．3．6肽质量指纹谱测定：切下凝胶差异蛋白质
点，脱色，胶内酶切，检测肽质量指纹谱。
2．3．7数据库检索鉴定蛋白质：输入拟查询的物
种、肽质量指纹谱数据等参数，在数据库查寻与其相
匹配的蛋白质。检索数据库：http：／／www．matrix—
science．tom。
3结果
3．1芍药苷对HFCL细胞周期的影响：各组的实
验结果及由此计算细胞增殖指数(proliferativein—
dex，PI)见表1。可见，与对照组相比，芍药苷组
G。／G。期细胞显著降低(P<0．05)，S期细胞显著升
高(P殖指数(P表1芍药苷对HFCL细胞周期的影响(；±s，捍一4)
Table1 Effectofpaeoniflorinoncellcycle
ofHFCL(jis，弹=4)
与对照组比较：。P+P<0．05口5controlgroup
3．2芍药苷对HFCL蛋白质表达的影响：芍药苷
对HFCL蛋白质表达的影响见图1和表2。经质谱
鉴定，1号、3～6号、8～10号和12～14号蛋白质分
别是Ras相关核蛋白、Bax、异柠檬酸脱氢酶3、核纤
层蛋白A／C、CCT、未命名蛋白质、磷酸丙糖异构
酶、人CC趋化因子、核蛋白体蛋白质P2、未知蛋白
质及ATP合酶。
4讨论
本研究结果显示，芍药苷促进HFCL由G。／G，
期进入S期，显著提高HFCL增殖指数，并能调节
多种蛋白质的表达。
经流式细胞术检测，芍药苷促进HFCL的增
殖。蛋白质组学的研究显示，芍药苷能促进核蛋白体
蛋白质P2、多种细胞结构蛋白质和蛋白质分子伴侣
的表达。核蛋白体蛋白质P2是真核细胞60S大亚
基的组成成分，参与蛋白质生物合成，在肽链延长过
程中发挥重要作用。CCT是一种异寡聚体分子伴
侣，协助新翻译的多肽链折叠卷曲。CCT表达水平
与细胞生长率相关[4]。实验证实，CCT的蛋白质及
mRNA表达在细胞生长，特别是由G，／S转换到早
S期时强烈上调。Ras相关核蛋白是一种小GTP结
合蛋白，属于Ras超家族，在细胞分裂周期中有多
种作用，包括细胞核物质的转运，有丝分裂纺锤体的
装配和细胞核核膜的装配和形成[5’6]，并参与控制
DNA合成和细胞周期进程。核纤层蛋白则是纤维
性核纤层的特异性蛋白，参与核稳定性、染色质结构
和基因表达等过程。本研究显示，芍药苷使HFCL
万方数据
中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第8期2006年8月·1209·
A一对照组B一芍药苷组图中左侧横向箭头表示第一向等电聚焦电泳的方向，IPG胶条的pH梯度由左向右为3～lo；左侧纵向
箭头表示第二向SDS—PAGE的方向，相对分子质量由上向下逐渐减小；右侧纵向蛋白点为蛋白质marker；图中数字是差异蛋白质
的编号
A—controlB—paeonifloringr upInfigure，horizontalarrownleftsideindicatesdirectionof1Disoelectricfocusing；fromle t
toright，pHgradientofIPGstripis3 to10；verticalarrowOileftsideindicatesdirectionof2DSDS—PAGE，molecularweightis
decreasedgra uallyfromuptodown；proteinpointsverticaldirectiononrightsideareproteinmarkers；numbersinfigu ea e
serialnumbersofdifferentialproteins
图1 HFCL蛋白质双向电泳图谱
Fig．1Two’dimensionalgelelectrophoretogramofHFCLp oteins
表2芍药苷所致HFCL差异表达蛋白质的鉴定
Table2 IdentificationofdifferentexpressedproteinsofHFCLinducedbypaeoniflorin
与对照组比较：’P。P的核蛋白体蛋白质P2、CCT、Ras相关核蛋白及核
纤层蛋白表达显著升高，从而促进骨髓基质细胞的
增殖，间接发挥促进骨髓造血的作用。
趋化因子是一类具有趋化特殊类型细胞参与免
疫及炎症反应的细胞因子超家族。单核细胞趋化蛋
白1～5、巨噬细胞炎性蛋白1a一17、3仅、3p等均属于
CC趋化因子。在趋化因子超家族中，有多种趋化因
子与造血调控有关。它们对造血的调控表现在多个
方面，如抑制造血干／祖细胞增殖，使造血干细胞停
留在G。期；动员骨髓造血干细胞进入外周血。本研
究显示，芍药苷使HFCL的CC趋化因子表达显著
减少，减弱了这种造血负调控作用。
Bax蛋白在凋亡发生过程中起重要枢纽作用，
在对凋亡刺激响应时，Bax经历构象改变、暴露膜靶
位域[7]、与线粒体膜结合，形成渗透性膜转移孑L复合
物，建立线粒体膜通道，介导线粒体发生释放反应，
释放细胞色素C、凋亡诱导因子、促凋亡蛋白等。当
Bax表达相对增多时，Bax／Bax二聚体增加，促进凋
亡发生。本研究显示芍药苷可使Bax蛋白质在HF—
CL表达显著减少，从而抑制HFCL细胞的凋亡。
万方数据
·1210· 中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第8期2006年8月
三羧酸循环是葡萄糖、甘油、脂肪酸及某些氨基
酸彻底氧化分解的共同途径。异柠檬酸脱氢酶3是
三羧酸循环的关键酶，其活性受许多变构剂调节。线
粒体ATP合酶是在细胞氧化磷酸化过程中，利用
横跨线粒体内膜的质子电化学梯度来催化ATP合
成的酶。本研究显示，芍药苷能显著上调异柠檬酸脱
氢酶和ATP合酶在HFCL的表达，促进能量代谢，
改善骨髓基质细胞的功能。
本研究结果表明，芍药苷作用于骨髓基质细胞
多种蛋白质靶点，促进细胞结构蛋白质的合成和蛋
白质分子伴侣的表达，促进HFCL的能量代谢，抑
制HFCL凋亡，间接发挥补血作用。本课题组将在
进一步工作中研究芍药苷作用的量效关系，并对目
标蛋白质进行深入的生物学功能研究，为阐明芍药
苷补血作用的分子机制提供依据。
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鱼工鱼软骨多糖的分离纯化及生物活性的研究
郭斌1，韩冠英2，李智p
(1．中国医科大学基础医学院天然药物研究室，辽宁沈阳 110001；2．锦州医学院，辽宁锦州121001)
摘要：目的研究红鱼软骨多糖(raycartilageglycosaminoglycans，RCG)的提取、分离与纯化方法，并初步探讨
其生物活性。方法采用盐酸胍提取、丙酮分级沉淀、膜超滤、Sephadex凝胶柱色谱分离、纯化获得缸鱼软骨多糖，
由HPLC确定其相对分子质量和质量分数；建立Lewis肺癌小鼠模型，将实验分为生理盐水(Saline)组、不同剂
量(500、250、125mg／kg)红鱼软骨多糖组、环磷酰胺(CTX．60mg／kg)组，观察小鼠肿瘤生长情况，绘制肿瘤生长
曲线，计算原发瘤与肺转移灶数抑瘤率，免疫组织化学染色计数肿瘤组织微血管密度(MVD)，采用RT—PCR检测
瘤组织血管内皮生长因子(VEGF)基因表达。结果经HPLC检测，该组分为单一多糖，其质量分数达99％以
上。生物活性检测结果表明，与生理盐水组比较，该多糖各剂量组小鼠的肿瘤生长曲线平缓，原发瘤抑瘤率、肺转移
灶数与生理盐水组比较差异显著(P<0．05、0．01)；与生理盐水组比较，红鱼软骨多糖各剂量组MVD显著减少、
VEGFmRNA表达水平显著降低(P移，并可抑制肿瘤的血管形成。
关键词：红鱼软骨多糖；Lewis肺癌；微血管密度(MVD)；血管内皮生长因子(VEGF)
中图分类号：R286．91；R979．1文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)08—1210—05
Isolation，purification，andbiologicalactivitiesofraycartilageglycosaminoglycans
GUOBinl，HANGuan—yin92，LIZhil
(1．DepartmentofEthnopharmacology，BasicMedicalCo lege，ChinaMedicalUniversity，Shenyang110001，China；
2．JinzhouMedicalCo lege，Jinzhou121001，China)
Abstract：ObjectiveToexplorethmethodsfextraction，isolation，purification，andbiolog lac—
tivitiesofraycartilageglycosaminoglycans(RCG)．MethodsRCGwaspurifiedbyguanidinehydrochlo—
ridextraction，acetonefractio alpr cipitation，ultrafiltration，andSephadexcolumnchromatography．The
purityandmolecularmassofRCGweremeasuredbymeansofHPLC．ThemodelofmousewithLewis
收稿日期：2006—01—05
基金项目：辽宁省教育厅基金资助项目(202173371)
作者简介；郭斌(1969一)，男，辽宁锦州人，副主任药师，博士，研究方向为天然药物开发。
Tel：(0416)4140066E—mail：jyguobin@126．corn
*通讯作者李智Tel：(024)23256666—5319E—mail：lizhijia@263．net
万方数据
芍药苷对人骨髓基质细胞HFCL蛋白质表达的作用
作者： 郭平， 王升启， GUO Ping， WANG Sheng-qi
作者单位： 郭平,GUO Ping(山东中医药大学,生化教研室,山东,济南,250014)， 王升启,WANG Sheng-
qi(军事医学科学院放射医学研究所,北京,100800)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(8)
被引用次数： 4次

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本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200608038.aspx