全 文 ：化瘀理肺方对肺纤维化大鼠 ＴＧＦβ，Ｓｍａｄ３及 ＣＴＧＦ表达的影响
焦芳芳，刘世青，王 琴，李 飞
（山东大学 附属千佛山医院 呼吸科，山东 济南 ２５００１４）
［收稿日期］ ２００７０７２０
［基金项目］ 山东省科技攻关课题（２００６ＧＧ２３０２０３０）
［通讯作者］ 刘世青，Ｔｅｌ：（０５３１）８９２６８２１７，Ｅｍａｉｌ：Ｌｉｕｓｈｉｑｉｎｇ＠
ｓｄｈｏｓｐｉｔａＬ．ｃｏｍ．ｃｎ
肺纤维化是一种渐进性的致死性疾病，发病机制
尚不完全明确，且发病日趋上升，但目前对肺纤维化
临床上尚无有效的治疗方法［１］。近年来临床报道显
示，中医辨证与辨病结合组方用药能提高疗效且副作
用小，因此寻求有效的中药治疗具有重要意义。作者
在原有中医药防治肺纤维化理论的基础上，深入研究
肺纤维化发病机制，认为肺纤维化基本病机为“肺肾
虚损，痰瘀阻络”，以“活血化瘀，祛痰理肺，畅利气
机”为治则组成化瘀理肺方，通过动物实验研究化瘀
理肺方对大鼠肺纤维化的治疗作用并探讨其机制。
１ 材料
１．１ 动物
健康雄性清洁级Ｗｉｓｔａｒ大鼠，体重１８０～２２０ｇ，
由山东大学实验动物中心提供，动物合格证号 ｓｓｘｋ
（鲁）２００３０００４。
１．２ 药物
化瘀理肺方颗粒由丹参、半夏、当归、水蛭、黄
芪、补骨脂、薏苡仁、鱼腥草、地龙组成，用药比例为
４∶０５∶４∶０５∶４５∶１∶１５∶２∶１，所用中药为浓缩颗粒
剂，由江阴天江药业有限公司生产，批号０５０９０２５，
经蒸馏水溶解配成含生药１３４１ｇ·Ｌ－１的混悬液，
高压灭菌，４℃冰箱保存备用。注射用盐酸博莱霉
素（１５ｍｇ／支），由日本药株式会社生产，批号
９５０３３０，使用时用蒸馏水配成１ｇ·Ｌ－１的溶剂。氢
化可的松琥珀酸钠（５０ｍｇ／支），由天津市生物化学
制药厂生产，批号２００６０３０１。
１．３ 试剂
转化生长因子 β（ＴＧＦβ）抗体、Ｓｍａｄ３抗体、结
缔组织生长因子（ＣＴＧＦ）抗体（０２ｍＬ，２００ｍｇ·
Ｌ－１）及链霉亲和素过氧化物酶复合物（ＳＡＢＣ）免疫
组化试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。
１．４ 仪器
电子天平（ＦＡ１６０４Ｓ型，上海天平仪器厂），１００
μＬ微量注射器（上海医用激光仪器厂），捷达 ８０１
系列形态学显微图像分析系统（江苏捷达科技发展
有限公司）。
２ 方法
２．１ 模型制备及分组
大鼠５６只随机分为４组，模型组（博莱霉素 ＋
生理盐水）、化瘀理肺方组（博莱霉素 ＋化瘀理肺
方）、激素组（博莱霉素＋氢化可的松琥珀酸钠）、正
常对照组（生理盐水 ＋生理盐水），每组１４只。用
１％戊巴比妥钠（３５ｍＬ·ｋｇ－１）腹腔内注射麻醉，
将大鼠仰卧位固定于实验台，固定头和四肢，开口器
固定口腔，拉出舌，用压舌板压舌腹，在额镜直视下，
趁动物吸气瞬间迅速行气管插管，模型组、化瘀理肺
方组、激素组缓慢注入０４％博莱霉素０２５ｍＬ（５
ｍｇ·ｋｇ－１），对照组注入生理盐水０２５ｍＬ作为正
常对照，注药后立即旋转动物，使药液在肺内均匀分
布。次日开始，化瘀理肺方组每天给予化瘀理肺方
药物混悬液灌胃（２ｍＬ／只，１３４ｇ·ｋｇ－１），激素组
每天给予氢化可的松琥珀酸钠腹腔注射（５ｍＬ／只，
００２５ｇ·ｋｇ－１），对照组和模型组每天给予生理盐
水（２ｍＬ／只）灌胃。于给药后第１４，２８天每组各处
死７只，留取标本。
２．２ 标本的采集
将大鼠全麻后称体重，仰卧固定，沿腹正中线逐
层切开腹壁，找到腹主动脉放血处死，分离肺组织，
用电子天平称肺重，计算肺系数（肺系数＝肺重ｍｇ／
体重ｇ），取右肺中叶置于１０％甲醛中固定，常规石
蜡包埋，连续４μｍ厚石蜡切片，ＨＥ染色。
２．３ 制作组织芯片
组织芯片的制作具体步骤如下［２］：制作空白石蜡
块，根据样本数量在空白石蜡块上钻孔（选用钻头直
径约２ｍｍ），在ＨＥ染色切片上选取具有代表性的部
位并标记，再用金属空心管（内径约２ｍｍ）从经定位
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第３３卷第１２期
２００８年６月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
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Ｊｕｎｅ，２００８
的目标石蜡块上钻取组织，并转移到已钻孔的空白石
蜡块的相应位置，将蜡块置４０℃烤箱内数天，使组织
与石蜡充分融合，按常规方法连续切片，厚４μｍ，５６
℃烤片３ｈ以上，供免疫组化染色用。
２．４ 观察指标
２．４．１ 组织病理学 按Ｓｚａｐｉｅｌ等方法［３］，光学显微
镜下观察组织切片病理改变来评价肺泡炎及肺纤维
化的程度，分级标准：０级：无肺泡炎或肺纤维化
（－）；１级：轻度肺泡炎或肺纤维化（＋），受累面积少
于全肺２０％；２级：中度肺泡炎或肺纤维化（），占
２０％～５０％；３级：重度肺泡炎或肺纤维化（），受累
面积＞５０％，肺泡融合，肺实质结构紊乱。等级计数
资料转化为计量资料，方法如下：－以“０”表示，＋以
“１”表示，以“２”表示，以“３”表示，以此类推。
２．４．２ 免疫组化染色 免疫组化染色采用链霉亲
和素生物素酶复合物（ＳＡＢＣ）法，以细胞胞浆中出
现黄色或棕黄色颗粒为阳性反应。肺组织中 ＴＧＦ
β，Ｓｍａｄ３，ＣＴＧＦ的表达采用捷达８０１系列形态学显
微图像分析系统进行免疫组化图像分析，经标准灰
度校正后，随机取５个视野，测定ＴＧＦβ，Ｓｍａｄ３，ＣＴ
ＧＦ的平均积分吸光度（Ａ）。
２．５ 统计学处理
采用ＳＰＳＳ１３０软件对实验数据进行统计学处
理，数据以 珋ｘ±ｓ表示。同一时间点的４个组进行单
因素方差分析（ＯｎｅＷａｙＡＮＯＶＡ），方差齐用最小显
著差法（ＬＳＤ）检验，方差不齐用 Ｔａｍｈａｎｅ＇ｓＴ２检验，
以Ｐ＜００５为差异有统计学意义。
３ 结果
３．１ 各组肺系数比较
模型组与激素组肺系数均显著大于对照组
（Ｐ＜００１，Ｐ＜００５），化瘀理肺方组第１４天肺系数
明显大于对照组（Ｐ＜００５），第２８天肺系数与对照
组比较无统计学意义，化瘀理肺方组和激素组肺系
数均显著小于模型组（Ｐ＜００１，Ｐ＜００５），化瘀理
肺方组与激素组比较无明显差异。见表１。
表１ 各组大鼠肺系数的比较（珋ｘ±ｓ，ｎ＝７）
组别
剂量
／ｇ·ｋｇ－１
肺系数
１４ｄ ２８ｄ
对照 － ４６９±０３６ ４７７±０３２
模型 － ９６４±２２７１） ９２１±１９２１）
激素 ００２５ ７５３±１８５１，４） ６９２±１８１２，４）
化瘀理肺方 １３４ ６７５±２１６２，３） ６４８±１８９３）
注：与对照组比较１）Ｐ＜００１，２）Ｐ＜００５；与模型组比较３）Ｐ＜
００１，４）Ｐ＜００５；与激素组比较５）Ｐ＜００１，６）Ｐ＜００５（表２，３同）
３．２ 组织病理学
３．２．１ 大体观察 正常对照组：双肺外观无异常，
表面光滑、饱满，呈粉红色，肺泡结构正常。模型组：
双肺体积缩小，呈灰白色，硬度增加，表面有白色大
小不等结节样改变、串珠状充气空泡及条索状凹沟。
化瘀理肺方组与正常组相近，只有少数肺叶呈暗红
色，边缘有点状出血及部分肺叶体积缩小，偶见大小
不等结节样改变。激素组与模型组相似，仅有少部
分肺叶表面光滑，局部见大小不等的结节，边缘有点
状出血，部分肺叶体积缩小，有白色结节。
３．２．２ 各组肺泡炎及肺纤维化程度的比较 正常
对照组各观察点均无明显病变。模型组灌注博莱霉
素后第１４天肺泡腔内可见大量炎性细胞渗出，肺
泡间隔明显增宽，成纤维细胞和胶原纤维明显增多；
第２８天肺纤维化程度加重，肺泡结构破坏，肺泡壁
明显增厚，肺间质纤维成分明显增多，毛细血管腔明
显增粗，个别闭塞，但肺部炎症浸润情况较前有所减
轻。激素组肺泡炎的程度同模型组比较有明显的减
轻（Ｐ＜００５），且随时间演变有逐渐减轻趋势；肺纤
维化程度较模型组比较有所减轻，但不明显，且随时
间推移有加重趋势。化瘀理肺方组肺泡炎和肺纤维
化的程度较模型组均明显减轻，第１４天时肺泡炎的
程度和纤维细胞的数量减轻程度（Ｐ＜００５，Ｐ＜
００１），第２８天时肺泡炎的减轻程度较对照组已无
统计学意义，肺纤维化的减轻程度有减缓的趋势，且
同激素组比较也有明显的减轻（Ｐ＜００５），但同对
照组比较仍较严重（Ｐ＜００５）。见表２。
表２ 各组大鼠肺泡炎、肺纤维化程度的比较（珋ｘ±ｓ，ｎ＝７）
组别
剂量
／ｇ·ｋｇ－１
１４ｄ
肺泡炎 肺纤维化
２８ｄ
肺泡炎 肺纤维化
对照 － ０００±０００ ０００±０００ ０００±０００ ０００±０００
模型 － ２５７±０５３１） ２２９±０４９１） ２１４±０３８１） ２４２±０６９１）
激素 ００２５ １５７±０５３１，４） １８６±０６９１） １２９±０４９１，４） ２１４±０６９１）
化瘀理肺方 １３４ １２９±０４９２，３） １１４±０６９２，４） ０８６±０６９４） １００±０５８２，３，６）
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３．３ 免疫组织化学染色
ＴＧＦβ蛋白在对照组仅在少数细支气管黏膜上
皮细胞的胞浆中弱表达，模型组 ＴＧＦβ蛋白主要定
位于肺泡巨噬细胞、支气管黏膜上皮细胞、血管内皮
细胞及成纤维细胞等细胞的胞浆中。化瘀理肺方组
ＴＧＦβ蛋白表达明显少于模型组（Ｐ＜００１），第２８
天时亦少于激素组（Ｐ＜００５），且与对照组比较已
无统计学意义。激素组较模型组有所减少，但无统
计学意义。见表３。
Ｓｍａｄ３蛋白在正常对照组弱表达；ＣＴＧＦ蛋白在
正常对照组基本不表达，两者在模型组较对照组表
达均明显增强，前者主要定位在炎症细胞的胞浆及
胞核中；后者在支气管黏膜上皮细胞、肺泡上皮细
胞、血管内皮成纤维细胞等细胞胞浆中表达。化瘀
理肺方组Ｓｍａｄ３蛋白和ＣＴＧＦ蛋白的表达明显少于
模型组（Ｐ＜００１，Ｐ＜００５），第２８天时与激素组比
较（Ｐ＜００５），与对照组比较无统计学意义；激素组
较模型组也有所减少，但无统计学意义。见表３。
表３ 各组大鼠ＴＧＦβ，Ｓｍａｄ３，ＣＴＧＦ蛋白表达（Ａ）的比较（珋ｘ±ｓ，ｎ＝７）
组别
剂量
／ｇ·ｋｇ－１
１４ｄ
ＴＧＦβ１ Ｓｍａｄ３ ＣＴＧＦ
２８ｄ
ＴＧＦβ１ Ｓｍａｄ３ ＣＴＧＦ
对照 － ４９７±１２９ ５４６±１４６ ４８４±１６３ ４９２±１３２ ５５５±１３９ ４８６±１６４
模型 － ９５７±１３６１） ９３０±１６３１） ９４１±１４０１） ９７８±１１２１） ９４０±１５８１） ９６５±１４０１）
激素 ００２５ ７９７±１９０１） ７６６±１５５２） ７６０±１５２１） ８２８±１６３１） ７８６±１６９１） ７９３±１６３１）
化瘀理肺方 １３４ ６７３±１２１２，３） ７２０±１５４２，４） ６７４±１９９２，３） ６３７±１３７３，６） ５９７±１５４３，６） ５９３±１７５３，６）
４ 讨论
中医对肺纤维化的治疗积累了丰富的经验，有
报道显示［４，５］用中药方剂治疗肺纤维化取得一定效
果。作者基于中医理论组成化瘀理肺方，方中丹参
功长活血化瘀生新，通行血脉，半夏燥湿化痰浊，消
痞散结，既消已生之痰，又杜生痰之源，二者合用有
利消除络脉之痰浊瘀血，共为君药；当归、水蛭为臣
药，助君药祛痰生新、化痰散节、畅通络脉；黄芪具有
补气升阳、益肺固表之功，补骨脂补肾壮阳，温脾，治
肺肾虚喘，有补肾纳气定喘之功，二药为伍，共同辅
助君药，达到气旺血生，血充气固，瘀去络通，百脉流
畅，以维持正常气机的升降出入；薏苡仁、鱼腥草、地
龙合用为佐药。全方共奏补肺固表、益肾纳气、逐瘀
通络、畅利气机之功。
大量动物实验及临床研究表明，肺纤维化发生
与促进炎症及促进细胞分裂增殖的细胞因子大量产
生有密切关系。ＴＧＦβ在肺纤维化中发挥了重要作
用［６］，已被大多数学者公认为是肺纤维化形成及发展
的关键性细胞因子，Ｓｍａｄ通路在调控ＴＧＦβ介导的
细胞外基质积聚过程中处于十分重要的地位。ＣＴＧＦ
是除ＴＧＦβ外的另一种重要的组织纤维化生长因子，
属即刻早期基因。以上这些细胞因子之间的相互作
用在肺纤维化的发生发展中起到重要的作用，因此，
它们在抗纤维化治疗的研究中日益受到重视。
通过本实验的研究发现，模型组的ＴＧＦβ，ＣＴＧＦ，
Ｓｍａｄ３蛋白表达明显增加，且有进行性增加的趋势，
造模后第２８天，肺纤维化大鼠 ＴＧＦβ，ＣＴＧＦ，Ｓｍａｄ３
蛋白的表达较造模后第１４天时蛋白的表达明显增
加，而经化瘀理肺方干预后，这些蛋白的表达明显减
少，其中第２８天时与正常对照组的蛋白表达水平无
明显差异。
综上所述，化瘀理肺方对博来霉素引起的大鼠
肺纤维化有一定的治疗作用，其作用机制可能与减
少ＴＧＦβ，ＣＴＧＦ，Ｓｍａｄ３蛋白的表达有关。
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ｔｏｒｂｅｔａ（１）ａｎｄｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｇａｍｍａ［Ｊ］．ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌＬｕｎｇＣｅｌ
ＭｏｌＰｈｙｓｉｏｌ，２００２，２８３（４）：Ｌ８０６．
［责任编辑 古云侠］
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第３３卷第１２期
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Ｊｕｎｅ，２００８