全 文 ：#研究论文#
甘草 •¬质粒转化及不同理化因子对甘草
毛状根生长的影响
杨世海t 3 o刘晓峰u o沈 昕v o郑俊华w
kt1 吉林农业大学 中药材学院 o吉林 长春 tvstt{ ~u1 吉林亚泰k集团l股份有限公司 o吉林 长春 tvssvt ~
v1 北京林业大学 生物科学与技术学院 o北京 tsss{v ~w1 北京大学 药学院 o北京 tsss{vl
≈摘要  目的 }研究甘草毛状根的诱导及外界因子对其生长的影响 ∀方法 }用发根农杆菌 Αγροβαχτεριυµ ρηιζο2
γενε󏅄|wsu和 • tyst感染甘草 Γλψχψρρηιζα υραλενσισ外植体 ∀结果 }u 种发根农杆菌均能诱导甘草产生毛状根 o
…„|wsu比 • tyst表现出较强的对甘草的感染能力 o下胚轴的转化率高于子叶 ∀在 • °培养基上毛状根生长最快 ∀
光照对毛状根生长有抑制作用 ∀毛状根中 x种黄酮类化合物的总量比愈伤组织中高 t1x倍 o其中甘草查耳酮含量
是愈伤组织中的 tx1x倍 ∀结论 }本实验所建立的甘草毛状根培养系统 o为研究甘草毛状根大量培养生产黄酮类化
合物奠定了基础 ∀
≈关键词  甘草 ~发根农杆菌 ~毛状根 ~黄酮类化合物
≈中图分类号  ≥ xyz ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussyltt2s{zx2sw
≈收稿日期  ussx2sz2st
≈通讯作者  3 杨世海 oר¯ }kswvtl wxvvvs{ o ƒ¤¬} kswvtl
wxvvvsw o∞2°¤¬¯}­¯¼¤±ª¶ƒ ¼¤«²²q¦²° q¦±
甘草为豆科植物甘草 Γλψχψρρηιζα υραλενσισ
ƒ¬¶¦«1 o胀果甘草 Γ1 ινφλατα …¤·1 或光果甘草 Γ1
γλαβρα1的干燥根及根茎 ∀甘草主要有效成分为
三萜和黄酮类化合物 ∀现代药理学研究发现甘草黄
酮类对肿瘤 !胃溃疡和肝损伤等具有多方面的药
效≈t  ∀
发根农杆菌 Αγροβαχτεριυµ ρηιζογενεσ感染植物后
能引起植物产生毛状根 ∀发根农杆菌中含有致使植
物产生毛状根的 •¬质粒 o在 √¬µ区基因产物协助下 o
•¬质粒中的 ×2⁄‘„片段转移进植物核基因组中 o就
导致了毛状根的大量出现≈u  ∀由于毛状根培养时生
长迅速且不需添加外源激素 o拥有亲本植株的次级
代谢途径 o遗传的稳定性 o处于分化状态等特点 o引
起了人们的浓厚兴趣 ∀用发根农杆菌诱导药用植物
产生毛状根 o寻求建立适合生产次生代谢产物的培
养系统 o已成为药用植物培养系统的一个研究热
点≈v ow  ∀
作者首次利用发根农杆菌 |wsu菌株对乌拉尔
甘草 Γ1 υραλενσισ进行遗传转化研究 o并建立了转化
根离体培养系统 o考察了不同理化因子对甘草毛状
根生长的影响 ∀
1 材料和方法
111 发根农杆菌活化
发根农杆菌 Α1 ρηιζογενεσ • tyst和发根农杆菌
Α1 ρηιζογενε󏅄|wsu分别由中国科学院遗传所和
北京林业大学森林生物技术中心提供 ∀取保存于
us h甘油k p us ε 冰箱内存放l中 Α1 ρηιζογενεσ |wsu
和 Α1 ρηιζογενεσ tyst o分别在含 xs °ª#pt卡那霉素
k®¤±¤°¼¦¬±l的 ≠ …和 ≠∞…琼脂培养基上划板培
养 ∀培养 v ∗ w §后 o长出一些肉眼可见的菌落 ∀挑
取单菌落接种于 ≠ …和 ≠∞…液体培养基中 o置于
tusµ#°¬±pt摇床上 ou{ ε 暗培养 ∀uw ∗ w{ «后 o再转
入新配制的液体培养基中继续活化 o活化 v ∗ w次 o
当细菌长至对数生长期时 o即可用来感染外植体进
行转化 ∀
112 无菌植物材料的准备
甘草种子由北京时珍中草药研究所提供 o经北
京大学药学院郑俊华教授鉴定为 Γ1 υραλενσισ,种子
置 w ε 冰箱内保存备用 ∀
挑选充实饱满的甘草种子 o用沙磨破种皮 o用自
来水冲洗 s1x «o用 s1t h ‹ª≤¯ u溶液浸 tu ∗ tx °¬±o再
用无菌水冲洗 w ∗ x次 o用灭菌滤纸吸干种子表面水
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第 vt卷第 tt期
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分 o接种在盛有 ≥sk不加任何激素l琼脂培养基的
三角瓶中 o置于 ux ε o光照 tu «#§pt的条件下培养 o
v §后种子伸出胚根 o待生长 u周后 o苗高 v ∗ w ¦°
时 o即可用作外植体材料 ∀
113 甘草 •¬质粒转化
将外植体置于 ≥s琼脂培养基上 oux ε o每天
日光灯照射 tu «o预培养 v ∗ w §o然后用于转化 ∀向
已灭菌的培养皿中加入对数生长期的发根农杆菌
u ∗ v °o用 ≥s液体培养基稀释 ts倍 ∀将外植体
在菌液中浸 us ∗ vs °¬±o用灭过菌的滤纸吸去外植
体表面多余菌液 o置于 ≥s琼脂培养基上 oux ε 漫
射光下培养 ∀共培养 v ∗ x §后 o当有细菌长出时 o
转移到附加 uss °ª#pt头孢霉素的 ≥s琼脂培养
基上除农杆菌 ∀一般在接种 tw §左右 o外植体上即
有不定根长出 o萌发的不定根连同外植体一起继续
杀菌 o当毛状根长至 u ¦°以上时 o可从外植体上切
下转入新的附加有 uss °ª#pt头孢霉素的 ≥s琼
脂培养基上 o每 u周继代培养 t次 o直至完全除菌 ∀
取完全除菌的毛状根转移到 ≥s液体培养基中 o建
立毛状根离体培养体系 ∀
114 甘草 •¬质粒转化根的鉴定
采用 ≥²∏·«¨µ± ¥¯²·¬±ª杂交技术来证实发根农杆
菌 •¬质粒的 ×2⁄‘„成功转移到植物基因组中 ∀分
别提取甘草无菌苗k空白对照l !甘草毛状根和发根
农杆菌 •¬质粒的 ⁄‘„ ∀将含有 µ²¯≤ 基因的 µ²¯≤2
³˜≤t|重组质粒酶解后得到 t1{ ®¥的片段并进行
vu°同位素标记 o以此用作鉴定质粒转化根的分子探
针与甘草毛状根 ⁄‘„杂交 ∀
115 甘草毛状根生物量的测定
收获甘草毛状根培养物 ∀先用镊子取出根 o挤
净根中所含培养基 o用分析天平称鲜重 ∀用蒸馏水
漂洗 t °¬±o{s ε 烘干 o称干重 ∀
116 黄酮类化合物的含量测定
11611 样品溶液制备 取干燥的毛状根样品 o用研
钵研成粉末 o准确称取 t1s ªo置 ts °具塞试管中 o
每次加入 ts °氯仿 o置超声波中提取 v次 o分别提
取 |s oys ovs °¬±o过滤 o合并 v次滤液 o回收溶剂 o用
甲醇溶解残渣 o在 ts °量瓶中定容 o用脂溶性微孔
滤膜过滤 o备用 ∀
11612 对照品溶液配制 精密称取甘草素 !异甘草
素 !甘草苷 !异甘草苷 !甘草查耳酮对照品各 ts °ªo
分别溶于 ts °量瓶中 o加甲醇定容 o作为对照品溶
液 ∀
11613 色谱条件 • ¤·¨µ¶ ¬¯¯ ±¨±¬∏° usts高效液相
色谱仪 o• ¤·¨µ¶||y 二极管阵列检测器 o≥«¬°2°¤¦®
≤≤2’⁄≥色谱柱 o流动相 ¤}v h醋酸水溶液 o¥}tss h
乙腈 o梯度洗脱 }s °¬±o¤2¥k|sΒtsl ~vs °¬±o¤2¥kxsΒ
xsl ~ws °¬±o¤2¥kusΒ{sl ~wx °¬±o¤2¥k|sΒtsl ~w| °¬±o
¤2¥k|sΒtsl ∀检测波长 }甘草素和甘草苷为 uzz1s
±° ~其余 v组分为 vzt1y ±°∀
在上述色谱条件下 o用 ‹°≤ 测定各样品的峰
面积 o根据回归方程计算甘草素 !异甘草素 !甘草苷 !
异甘草苷和甘草查耳酮的含量 ∀
2 结果与讨论
211 不同发根农杆菌对甘草不同的诱导效应
不同发根农杆菌菌株对甘草下胚轴及子叶的转
化能力不同 ∀从表 t可见 o|wsu菌株的转化频率高
于 tyst菌株 o就下胚轴和子叶而言 o又以下胚轴的
转化率较高 ∀
表 t 不同发根农杆菌对甘草不同的诱导效应
菌株 外植体 数量 生根的外植体数 频率r h
tyst 下胚轴 vy t| xu q{
子叶 u| tu wt qw
|wsu 下胚轴 uz uv {x qu
子叶 vu t| x| qw
212 甘草 •¬质粒转化根的筛选
本试验观察了感染发根农杆菌 |wsu的甘草外
植体和对照外植体k未感染发根农杆菌l在 ≥s培
养基及 ≥ n Ž±ux n ≤³«uss琼脂培养基上培养 v周
后的情况 ∀结果见表 u ∀
表 u 甘草 •¬质粒转化根的筛选
处理 外植体 数量 接种情况 v周后生根外
植体数
≥s琼脂培养基 下胚轴 uz 未接种 u
子叶 t{ s
下胚轴 uy 接种 us
子叶 u| tw
≥ n Ž±ux n
≤³«uss
琼脂培养基
下胚轴 vw 未接种 s
子叶 uv s
下胚轴 vt 接种 uu
子叶 u{ tv
注 }≥ n Ž±ux n ≤³«uss琼脂培养基为附加 ux °ª#pt卡那霉素 !
uss °ª#pt头孢霉素的 ≥琼脂培养基
从表 u可以看出 o外植体在不含卡那霉素培养
基上培养时长出的不定根未必都是转化根 o未感染
发根农杆菌的外植体在 ≥s培养基上培养一段时
间后 o也可能萌发出不定根 o但这种不定根在离体培
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第 vt卷第 tt期
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养条件下不能自主生长 o而只有转化根才能在不含
任何激素的培养基上生长 o因此必须对产生的不定
根进行筛选 o方法是将不定根切下 o置于加卡那霉素
的抗性培养基上培养 o结果只有带抗性基因的转化
根才能在这种培养基上生长 ∀
213 甘草 •¬质粒转化根的鉴定
≥²∏·«¨µ± ¥¯²·¬±ª杂交技术广泛用于鉴定 •¬质粒
转化根≈x  ∀由图 t可见来源于未转化植物材料k甘
草原植物l的 ⁄‘„无杂交信号 o由 Α1 ρηιζογενεσ|wsu
诱导的甘草毛状根则有较强的杂交 o证明 •¬质粒上
的 ×2⁄‘„ 已转移并整合到决明细胞核基因组中 ∀
作阳性对照的从 Α1 ρηιζογενεσ |wsu 中提取的质粒
⁄‘„也有强烈杂交 o且除一强烈杂交信号外 o均出
现弱的杂交信号 ∀这是 ⁄‘„ 经双酶切得到的分子
量大小不同 !且都含有µ²¯≤基因的 u个 ⁄‘„片段与
µ²¯≤探针杂交的结果 ∀
图 t 甘草毛状根的 ≥²∏·«¨µ±印迹杂交图
t1 质粒 ⁄‘„ ~u1 未转化植物 ⁄‘„ ~v1毛状根
214 甘草 •¬质粒转化根的离体培养
从甘草外植体上诱导产生的毛状根 o初为白色 o
无向地性 o暴露于空气中的部分着生有侧生绒毛 o而
伸进培养基中的毛状根细长 o生有侧根 ∀当毛状根
在含 uss °ª#pt头孢霉素的琼脂培养基上除菌完全
后 o转入 ≥s液体培养基中培养 o摇床转速 tts µ#
°¬±pt oux ε o光照条件下培养 o建立起甘草毛状根
的离体培养体系 ∀甘草毛状根在 ≥液体培养基中
悬浮培养情况见图 u ∀
图 u ≥s液体培养基中悬浮培养的甘草毛状根
215 甘草毛状根的生长曲线
在 xs °液体培养基中接种 s1x ª毛状根 o在
tts µ#°¬±pt摇床上 o培养温度 ux ε o光照条件下培
养 vs §∀在 vs §生长期中 o每隔 x §取样 t次 o测定
毛状根的鲜重 o绘制生长曲线 o结果如图 v ∀
图 v 离体培养甘草毛状根的生长曲线
在 vs §的培养过程中 o甘草毛状根的生长逐渐
增加 o从第 ts天开始进入对数生长期 o第 ux天时达
最大值 o以后呈下降趋势 ∀
216 不同培养基对甘草毛状根生长的影响
不同培养基对甘草毛状根生长的影响见表 v o
在所实验的 y种基本培养基中 o• °培养基最适于
甘草毛状根的生长 o≥培养基最不利于甘草毛状根
的生长 ∀
表 v 不同培养基对甘草毛状根生长的影响
基本培养基 鲜重rª 干重rª
≥ { qwu ? s qxts s qzu ? s qswu
…x tv qxs ? s qxuw t qs{ ? s qsxu
‘y ts qu{ ? s qwtu s q{w ? s qsws
‘‘ ts qxy ? s qxxy s q|s ? s qsxu
y oz2∂ tw qyw ? s qwx{ t qt{ ? s qsws
• ° tx qv{ ? s qxyw t quy ? s qsyw
217 光照对甘草毛状根生长的影响
与黑暗条件相比 o在连续光照下甘草毛状根的
生长受到一定的抑制 o其鲜重增加减少 tw1t h o干
重增加减少 uu1w h ∀
218 甘草毛状根和愈伤组织中黄酮类化合物含量
与甘草愈伤组织相比 o毛状根中含有的 x种黄
酮类化合物的总量是前者的 t1x倍 o其中甘草查尔
酮含量是愈伤组织中的 tx1x倍 o见表 w ∀有报道 o决
明毛状根中游离蒽醌化合物含量也高于愈伤组
织≈y  ∀可见 o植物毛状根生长迅速快且合成能力强 ∀
3 讨论
各种培养基由于所含组分及其比例不同 o对毛
状根的生长及次生代谢产物的形成有不同的影响 ∀
长春花毛状根在 tru…x培养基上生长良好≈z  ∀西洋
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表 w 甘草毛状根和愈伤组织中黄酮类
化合物的比较 Λª#ªp t
培养物 甘草素 异甘草素 甘草苷 异甘草苷 甘草查耳酮
愈伤组织 v{ qzs tx qxv t| q|{ t| qvv y q|x
毛状根 { qzv tx qu { qsx tw q{| tsz q|y
参毛状根在 ≥2t培养基生长最好 o毛状根的月平均
增长量达 vt1t倍 o…x次之 otru≥最差 ∀通过比较
成分 o发现 ≥2t培养基无机氮含量较高 o推测氮源
可能是影响毛状根生长的重要因素≈{  ∀在无
‘‹w‘’v的≥ 培养基中黄芪毛状根的生长量增加
us h以上≈|  ∀本实验结果表明 o≥培养基最不利于
甘草毛状根的生长 o提示 ‘‹ nw 可能对甘草毛状根的
生长不利 ∀对培养基优化的研究有待进一步深入 o
应采用统计分析方法对培养基中各种成分k氮 !碳 !
磷 !钙 !镁等l进行多因素多水平的筛选 ∀
自然状态下 o光是影响植物生长的最主要的生
态因子之一 ∀光照对毛状根的抑制作用 o在其他植
物毛状根上也有表现 ∀胡之璧等报道≈|  o光抑制黄
芪毛状根的生长 ∀常振战在进行掌叶大黄毛状根培
养时也发现暗培养的毛状根比光培养的毛状根产生
更多侧根 o生长更快≈y  ∀本实验结果表明甘草毛状
根在暗培养条件下有利于生物量积累 ∀
≈参考文献 
≈t  贾国惠 o贾世山 q甘草中黄酮的药理研究进展 q中国药学杂
志 ot||{ ovvk|l }xtv q
≈u  ≤«¬¯·²±  ⁄o× ³¨©¨µ⁄ „ o °¨ ·¬·„ o ετ αλ. Αγροβαχτεριυµ ρηιζογενεσ
¬±¶¨µ·¶×2⁄‘„ ¬±·²·«¨ ª¨ ±²° ¶¨²©·«¨ «²¶·³¯¤±·µ²²·¦¨¯¯¶q Νατυρε ,
t|{u ou|x }wvu q
≈v  刘本叶 o叶和春 o李国风 o等 q •¬质粒在植物科学中应用的新
进展 q植物学通报 ot||{ otxkwl }t q
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植物毛状根的次生代谢 q天然产物研究与开发 ot||| ottkvl }
tsw q
≈x  费厚满 o梅康凤 o沈 昕 o等 q发根农杆菌对绞股蓝的转化及
毛状根中皂甙的产生 q植物学报 ot||v ovxk{l }yuy1
≈y  常振战 q大黄 !决明 •¬质粒转化根离体培养及其活性成分研
究 }≈学位论文  q北京 }北京医科大学 ot||z q
≈z  刘红蕾 o张玉臻 o陶文沂 q营养及环境条件对农杆菌诱导的长
春花发根生长和生物碱合成的影响 q药物生物技术 oussv ots
kvl }txx q
≈{  王冲之 o丁家宜 q不同培养基及外源激素对西洋参毛状根生
长和皂甙含量的影响 q植物资源与环境学报 ousst otskwl }t q
≈|  胡之璧 o郑志仁 o李幸平 o等 q膜荚黄芪毛状根培养系统的建
立和外界因子对其生长的影响 q植物学报 ot||{ owskxl }ww{ q
Ρι πλασµιδ τρανσφορµατιον οφ Γλψχψρρηιζα υραλενσισ ανδ
εφφεχτσ οφ σοµεφαχτορσ ον γροωτη οφ ηαιρψ ροοτσ
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(t1 Χολλεγε οφ Χηινεσε Μεδιχιναλ Ματεριαλ, ϑιλιν Αγριχυλτυραλ Υνιϖερσιτψ, Χηανγχηυν tvstt{ , Χηινα ;
u . ϑιλιν ΨαΤαι Γρουπ Χο . Λτδ . , Χηανγχηυν tvssvt , Χηινα ;
v . Χολλεγε οφ Βιολογιχαλ Σχιενχεσ ανδ Τεχηνολογψ, Βειϕινγ Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ, Βειϕινγ tsss{v , Χηινα ;
w . Σχηοολ οφ Πηαρµαχευτιχαλ Σχιενχεσ , Πεκινγ Υνιϖερσιτψ, Βειϕινγ tsss{v , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε : ײ¶·∏§¼·«¨ ¬±§∏¦·¬²± ²©«¤¬µ¼ µ²²·¶²© Γλψχψρρηιζα υραλενσισ ¤±§ ©¨©¨¦·²©¶²°¨³«¼¶¬¦¤¯ ¤¶º¨¯¯ ¤¶¦«¨ °¬¦¤¯
©¤¦·²µ¶²±·«¨ ªµ²º·«²©«¤¬µ¼µ²²·¶q Μετηοδ : ‹¼³²¦²·¼¯¶¤±§¦²·¼¯ §¨²±¶²© Γ . υραλενσισ º µ¨¨ ¬±©¨¦·¨§º¬·« Αγροβαχτεριυµ ρηιζογενε󏅄|wsu
¤±§ Α. ρηιζογενεσ • tyst oµ¨¶³¨¦·¬√¨¯¼ q Ρεσυλτ : ‹¤¬µ¼µ²²·¶º µ¨¨ ¬±§∏¦¨§¥¼·º²¶·µ¤¬±¶²© Α. ρηιζογενεσo¤±§…„|wsu ¶«²º §¨¤¶·µ²±ª¨µ
¬±©¨¦·¬√¨¤¥¬¯¬·¼q׫¨ ©µ¨ ∏´¨ ±¦¼ ²©·µ¤±¶©²µ°¤·¬²± ²©«¼³²¦²·¼¯¶º¤¶«¬ª«¨µ·«¤±·«¤·²©¦²·¼¯ §¨²±¶q„°²±ª·«¨ §¬©©¨µ¨±·° §¨¬¤·¨¶·¨§o • ° ° §¨¬2
∏° ¼¬¨ §¯¨§·«¨ ©¤¶·¨¶·ªµ²º·«µ¤·¨ ²©«¤¬µ¼µ²²·¶q¬ª«·¬±«¬¥¬·¨§·«¨ ªµ²º·«²©«¤¬µ¼µ²²·¶q׫¨ ·²·¤¯ ¤°²∏·²©x ©¯¤√²±²¬§¶¬± «¤¬µ¼µ²²·¶º¤¶t1x
·¬° ¶¨¤¶°∏¦«¤¶·«¤·¬±·«¨ ¦¤¯ ∏¯¶o¤°²±ª·«¨ ° ¬¯¦²¦«¤¯¦²±¨ ¦²±·¨±·º¤¶tx1x·¬° ¶¨¤¶·«¤·²©¦¤¯ ∏¯¶qΧονχλυσιον : ׫¨ ιν ϖιτρο ¦∏¯·∏µ¨ ¶¼¶2
·¨° ²©·«¨ «¤¬µ¼µ²²·¶ ¶¨·¤¥¯¬¶«¨ § ¤¯¬§¤©²∏±§¤·¬²±©²µ°¤¶¶³µ²§∏¦·¬²± ²©©¯¤√²±²¬§¶¥¼ «¤¬µ¼µ²²·¦∏¯·∏µ¨ q
[ Κεψ ωορδσ] Γλψχψρρηιζα υραλενσισ; Αγροβαχτεριυµ ρηιζογενεσ~«¤¬µ¼µ²²·~©¯¤√²±²¬§¶
≈责任编辑 张宁宁 
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第 vt卷第 tt期
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