全 文 ：·研究论文·
不同附加物对甘草悬浮培养细胞中
甘草酸积累的影响
卞爱华１，高文远１，２，王 娟３
（１．天津大学 药物科学与技术学院，天津 ３０００７２；
２．天津科技大学 中药生物工程研究所，天津 ３００４５７；３．天津中医药大学，天津 ３００１９３）
［摘要］ 目的：研究醋酸钠、苯丙氨酸、亮氨酸对甘草细胞悬浮培养中甘草酸积累的影响。方法：在培养的第
０天，向培养基中加入各种附加物，甘草酸的含量分析采用高效液相色谱法。结果：较低浓度的醋酸钠（０１ｍｍｏｌ·
Ｌ－１）可以较明显的促进甘草细胞中甘草酸的积累，其含量为对照组的２４０倍。当苯丙氨酸添加浓度由０１ｍｍｏｌ
·Ｌ－１增加到２ｍｍｏｌ·Ｌ－１时，细胞中甘草酸的含量逐渐提高。２ｍｍｏｌ·Ｌ－１的苯丙氨酸使甘草酸的含量达到１４１０
μｇ·ｇ－１，为对照组的３６０倍。添加０１ｍｍｏｌ·Ｌ－１亮氨酸使甘草酸的含量提高了２２４倍。随着亮氨酸添加浓度
的增加，甘草细胞中甘草酸的含量逐渐降低，添加２ｍｍｏｌ·Ｌ－１亮氨酸对甘草酸积累有明显的抑制作用。结论：甘
草细胞悬浮培养中，适量的添加醋酸钠、苯丙氨酸及亮氨酸等附加物是提高细胞中甘草酸含量的有效方式之一。
［关键词］ 甘草；细胞悬浮培养；甘草酸；附加物
［中图分类号］Ｓ５６７ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）２３２７３７０４
［收稿日期］ ２００８０２０１
［基金 项 目］ 国 家 “十 一 五”科 技 支 撑 计 划 项 目
（２００６ＢＡＩ０６Ａ１６０２）；国家中医药管理局中医药科学技术研究专项
（０４０５ＺＰ１０）
［通讯作者］ 高文远，Ｔｅｌ／Ｆａｘ：（０２２）８７４０１８９５，Ｅｍａｉｌ：ｐｈａｒｍ
ｇａｏ＠ｔｊｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
甘草为豆科植物甘草 Ｇｌｙｃｙｒｈｉｚａｕｒａｌｅｎｓｉｓ
Ｆｉｓｃｈ．、胀果甘草 ＧｉｎｆｌａｔａＢａｔ．、光果甘草 Ｇｇｌａ
ｂｒａＬ．的干燥根及根茎，为最常用的中药之一。传
统中医理论认为甘草具有补脾益气、止咳祛痰、清热
解毒、调和诸药等功效，现代药理研究表明甘草具有
抗炎、抗氧化、解毒等多种药理活性，这些药理活性
主要基于甘草中的主要活性成分黄酮类和三萜类。
其中主要的三萜类成分甘草酸具有抗炎、抗溃疡、抗
病毒和免疫调节等多种药理活性［１２］，另有报道表明
甘草酸具有增强 ＳＡＲＳ感染者的免疫力的作用［３］，
同时，甘草酸也是用途较很广泛的甜味剂［４］。本研
究的对象为甘草Ｇ．ｕｒａｌｅｎｓｉｓ，国内外对甘草属其他
植物组织培养方面的研究报道较多，而对甘草 Ｇ．
ｕｒａｌｅｎｓｉｓ的植物组织培养方面的报道较少。目前甘
草组织培养方面的报道主要集中在愈伤组织培养及
分化和毛状根培养方面的研究中，对甘草细胞培养
的研究较少。同时，利用不同附加物追加的手段提
高甘草悬浮细胞中甘草酸含量的研究，目前仍未见
报道。利用植物细胞悬浮培养技术生产有价值的次
生代谢产物具有重要的理论和现实意义。本研究旨
在筛选出能够提高甘草悬浮细胞甘草酸的含量的附
加物，为甘草细胞悬浮培养的进一步放大培养奠定
基础。
１ 材料和方法
１．１ 种子
甘草种子由北京时珍中草药研究所提供，经天
津大学高文远教授鉴定为Ｇ．ｕｒａｌｅｎｓｉｓ的种子。
１．２ 愈伤组织的诱导及继代培养
甘草无菌苗的培养参见文献［５］。将无菌芽下
胚轴切成长约０５ｃｍ的小段接于诱导培养基上进
行培养，培养条件为：ＭＳ＋２，４Ｄ２ｍｇ·Ｌ－１＋ＫＴ
０７ｍｇ·Ｌ－１＋３％蔗糖＋１％琼脂，ｐＨ５８，培养温
度（２５±１）℃，黑暗培养。每４周继代１次，继代培
养基为 ＭＳ＋ＮＡＡ２ｍｇ·Ｌ－１＋ＫＴ０７ｍｇ·Ｌ－１＋
３％蔗糖＋１％琼脂，ｐＨ５８。
１．３ 甘草细胞株的获得
将愈伤组织（２ｇ，鲜重）转入含 ５０ｍＬ液体培养
基（ＭＳ＋２，４Ｄ２ｍｇ·Ｌ－１＋ＫＴ０７ｍｇ·Ｌ－１＋３％蔗
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糖，ｐＨ５８）的２５０ｍＬ锥形瓶中悬浮培养，摇床转速
１１０ｒ·ｍｉｎ－１，光照条件为１２ｈ·ｄ－１。每１６ｄ继代１
次，继代时，条件培养基与新鲜培养基的比例为１∶３。
１．４ 附加物添加试验
在培养的第０天向培养基中分别加入０１，１，２
ｍｍｏｌ·Ｌ－１的醋酸钠、苯丙氨酸、亮氨酸。其他培养
条件同上，每组重复３～４瓶，以未添加附加物的组
分作为对照。
１．５ 生物量测定
将悬浮细胞液置于离心管中，转速 ８０００ｒ·
ｍｉｎ－１，离心１５ｍｉｎ，弃去上清液，用重蒸水洗涤细胞
２次，弃去上清液，称得离心管底部细胞的质量，即
为细胞鲜重（ｆｒｅｓｈｃｅｌｗｅｉｇｈｔ，ＦＷ）；置于烘箱中６０
℃干燥７～８ｈ以至恒重，取出置于干燥箱中冷却至
室温，称其质量为细胞干重（ｄｒｙｃｅｌｗｅｉｇｈｔ，ＤＷ）。
干重增殖倍数＝（收获时细胞干重 －接种时细胞干
重）／接种时细胞干重。
１．６ 甘草酸含量的测定
１．６．１ 样品的制备方法 将约０３ｇ（干重）细胞
粉末置于三角瓶中，加入３０ｍＬ甲醇浸泡２４ｈ后，
超声２次，每次３０ｍｉｎ，过滤，合并滤液，将滤液旋
干，甲醇定容至１ｍＬ，用０２２μｍ滤膜过滤得供试
品溶液。
１．６．２ 对照品溶液的制备 精密称取甘草酸单铵
盐对照品５０７ｍｇ，甲醇溶解并定容至２５ｍＬ量瓶
中，即得对照品溶液。甘草酸对照品购于天津中新
药业中药现代化技术工程中心，纯度大于９８％。
１．６．３ ＨＰＬＣ色谱条件 岛津ＬＣ－１０ＡＴｖｐ液相色
谱仪，ＳＰＤ－１０Ａｖｐ紫外检测器，ＣｏｓｍｏｓｉｌＣｌ８色谱柱
（Ｗａｔｅｒｓ公司，４６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ），流动相 甲
醇１％醋酸（６３∶３７），流速１０ｍＬ·ｍｉｎ－１，检测波
长２５４ｎｍ。
１．６．４ 数据分析 在上述色谱条件下，测定各样品
的峰面积，根据回归方程计算甘草酸的含量。本研
究所有数据均用 ＳＰＳＳ１００软件进行统计学处理。
数据以 珋ｘ±ｓ表示。
２ 结果
２．１ 醋酸钠对甘草细胞生长及甘草酸积累的影响
在培养第０天向培养基中添加醋酸钠对甘草细
胞的生长有轻微的促进作用，并且随着醋酸钠加入
量的增加，细胞生物量的积累越高。而对于甘草酸
的积累，却呈现了相反的效果，加入较低浓度的醋酸
钠（０１ｍｍｏｌ·Ｌ－１）可以较明显的促进甘草细胞中
甘草酸的积累，其含量为对照组的２４０倍，但随着
加入醋酸钠浓度的增加，细胞中甘草酸的含量却逐
渐下降。故在培养的第０天向培养体系中添加较低
的浓度的醋酸钠（０１ｍｍｏｌ·Ｌ－１）利于甘草细胞中
甘草酸的积累（表１）。
表１ 醋酸钠对甘草细胞生长及细胞中
甘草酸的影响（珋ｘ±ｓ）
醋酸钠
／ｍｍｏｌ·Ｌ－１
干重
／ｍｇ
干重增殖
倍数
甘草酸
／μｇ·ｇ－１
０（对照） ７４３２±７５７ ７６０±０８７７ ３９２２±０７２１
０１ ７７２６±２８７ ７９４±０３３３ ９４０１±００４０
１ ８９２３±３６８ ９３３±０４２７ ６７５０±０６５３
２ １０８４±３７８ １１５４±０４３８ ３４９１±０２０２
２．２ 苯丙氨酸对甘草细胞的生长及甘草酸积累的
影响
苯丙氨酸对甘草细胞生物量的积累并无显著影
响，加入２ｍｍｏｌ·Ｌ－１苯丙氨酸轻微地促进了甘草
细胞生物量的积累，同时较显著的提高了细胞中甘
草酸的含量，其含量为对照组的３６０倍。从该试验
整体来看，随着加入苯丙氨酸浓度的增加，细胞中甘
草酸的含量逐渐提高，较高浓度的苯丙氨酸有利于
提高甘草酸的含量。故在培养的第０天向培养体系
中添加２ｍｍｏｌ·Ｌ－１的苯丙氨酸为提高甘草悬浮细
胞中甘草酸含量的有效方法（表２）。
表２ 苯丙氨酸对甘草细胞生长及细胞中
甘草酸的影响（珋ｘ±ｓ）
苯丙氨酸
／ｍｍｏｌ·Ｌ－１
干重
／ｍｇ
干重增殖倍数
甘草酸
／μｇ·ｇ－１
０（对照） ７４３２±７５７ ７６０±０８７７ ３９２２±０７２１
０１ ７４０７±３２６ ７５７±０３７８ ６９２０±０１７７
１ ７５７０±１２５ ７８３±０１１５ ９５７８±１４５５
２ ８４７５±２３３ ８６１±０３８１ １４１０±０１５８
２．３ 亮氨酸对甘草细胞生长及甘草酸积累的影响
亮氨酸对甘草细胞生长及甘草酸积累的影响与
醋酸钠的添加影响效果类似，附加物的加入对细胞
生物量的积累与细胞中甘草酸的积累表现出明显的
不一致性。随着添加亮氨酸浓度的增加，甘草细胞
生物量的积累增加显著，而细胞中甘草酸的含量却
明显降低。添加２ｍｍｏｌ·Ｌ－１的亮氨酸较利于甘草
细胞生物量的积累却严重抑制了甘草酸的积累。而
较低浓度的亮氨酸对甘草酸的积累有较明显的促进
作用，加入０１ｍｍｏｌ·Ｌ－１亮氨酸使甘草酸的含量
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提高２２４倍。因此，在培养的第０天，向培养体系
中添加０１ｍｍｏｌ·Ｌ－１的亮氨酸是促进甘草悬浮细
胞中甘草酸积累的有效手段（表３）。
表３ 亮氨酸对甘草细胞生长及细胞中
甘草酸的影响（珋ｘ±ｓ）
亮氨酸
／ｍｍｏｌ·Ｌ－１
干重
／ｍｇ
干重增殖倍数
甘草酸
／μｇ·ｇ－１
０（对照） ７４３２±７５７ ７６０±０８７７ ３９２２±０７２１
０１ ７１８０±９６９ ７３１±１１２１ ８７７２±０４５２
１ ８８３１±２５４ ９２２±０２９５ ２７１１±０７５５
２ １００２０±６７１ １０６０±０７７１ ０８９９±０８９０
３ 讨论
本研究考察了醋酸钠，亮氨酸和苯丙氨酸３种
附加物对甘草细胞生长及甘草酸积累的影响。结果
表明，醋酸钠的用量对甘草细胞生长及甘草酸的积
累有较大影响，较高浓度的醋酸钠利于甘草细胞的
生长，而较低浓度的醋酸钠有利于细胞中甘草酸的
积累。亮氨酸试验结果与醋酸钠的试验结果类似，
都表现了不同附加物用量对甘草细胞生长和对甘草
酸积累促进效果的不一致性，由此可以推断，促进甘
草细胞生长与甘草酸积累的作用机制不同，关于附
加物的作用机制有待于进一步研究。值得注意的是
高浓度亮氨酸（２ｍｍｏｌ·Ｌ－１）的追加对甘草酸的积
累表现了明显的抑制作用，这说明通过附加物的追
加提高次生代谢产物的方法中，附加物的用量是一
个非常重要的因素。关于醋酸盐及亮氨酸对提高细
胞悬浮培养中次生代谢产物方面的应用，在西洋参
细胞悬浮培养的研究中有过报道［６］，１００ｍｇ·Ｌ－１亮
氨酸对西洋参细胞生长无明显影响，但对皂苷合成
有促进作用，４４４ｍｇ·Ｌ－１的醋酸镁对培养物生长和
皂苷合成都有促进作用。
苯丙氨酸在植物体内可以通过参与蛋白质的合
成和作为碳源和氮源来影响细胞的生长［７］。在植
物细胞的次生代谢中，苯丙氨酸是一个代谢中间体，
它对生物碱、木质素、黄酮等多种次生代谢物质的生
物合成都有重要作用［８］，因而苯丙氨酸被广泛的作
为附加物来提高植物细胞悬浮培养中次生代谢产物
的含量。Ｍｉｚｕｋａｍｉ［９］等早在１９７７年就发现苯丙氨
酸可以促进紫草细胞萘醌类化合物的合成。李家
儒［１０］等的研究表明适宜浓度的苯丙氨酸可以促进
红豆杉培养细胞中紫杉醇的合成。向茶树培养细胞
饲喂外源苯丙氨酸后，能够使培养细胞内２种儿茶
素的形成水平各增加 ４成［１１］。另外，高丽华等［１２］
的研究表明，在悬浮培养水母雪莲细胞过程中添加
醋酸钠和苯丙氨酸等附加物可以促进雪莲黄酮合
成。本试验中较高浓度的苯丙氨酸（２ｍｍｏｌ·Ｌ－１）
在最大程度上促进了甘草酸的积累。
对于甘草悬浮细胞能否产生甘草酸的问题有不
同报道。根据 Ｔａｍａｋｉ等［１３］及 ＳｈａｍｓＡｒｄａｋａｎｉ等［４］
的报道，光果甘草的悬浮细胞可以产生甘草酸，而
Ｋｏｂａｙａｓｈｉ等［１４］及 Ｈａｙａｓｈｉ等［１５］却未能从光果甘草
愈伤组织和悬浮细胞中检测到甘草酸的存在。本试
验成功获得了能够积累甘草酸的甘草细胞悬浮系，
并且通过附加物添加的方法成功地提高了细胞中甘
草酸的含量。
高等植物次生代谢产物生物合成途径极其复
杂，并由于生物合成途径中限速酶的存在，常常使终
产物的产量受某些底物数量的影响，因此，在植物细
胞悬浮培养过程中，可以通过附加物的添加来提高
目的产物的含量。本研究虽然成功地利用附加物追
加的方法提高了甘草酸的含量，但是附加物在次生
代谢产物生物合成途径中的哪一步骤起作用及如何
发挥作用尚不清楚，因此附加物促进甘草酸积累的
作用机制有待于进一步的研究。
植物细胞悬浮培养过程中次生代谢物的产量通
常较低，目前，提高植物细胞培养过程中次生代谢物
产量的方法主要有高产细胞株的筛选、培养基和培
养条件的优化、前体和诱导子的添加以及改进培养
方式［１６］，并有研究表明，２种或多种手段联合应用
会对次生代谢产物的提高起到协同作用［１７］。本试
验研究了单一附加物对甘草酸含量的影响，对于多
种手段的协同作用应做进一步的研究，以筛选出提
高甘草悬浮细胞中甘草酸含量更为有效的方法，为
甘草细胞的放大培养奠定基础。
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Ｔｉａｎｊｉｎ３００４５７，Ｃｈｉｎａ；３．ＴｉａｎｊｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｔｉａｎｊｉｎ３００１９３，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｅｃｔｓｏｆｓｅｖｅｒａｌａｄｄｉｔｉｖｅｓ（ｓｏｄｉｕｍａｃｅｔａｔｅ，ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅａｎｄａｍｉｄｏｃａｐｒｏｉｃａｃｉｄ）
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ｍｅｄｉｕｍａｔｔｈｅｂｅｇｉｎｎｉｎｇｏｆｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅ．ＴｈｅｇｌｙｃｙｒｈｉｚｉｎｃｏｎｔｅｎｔｉｎＧ．ｕｒａｌｅｎｓｉｓｃｅｌｓｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙＨＰＬＣ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｔｈｅｌｏｗｅｒｓｏｄｉ
ｕｍａｃｅｔａｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ０１ｍｍｏｌ·Ｌ－１ｅｎｈａｎｃｅｄｔｈｅｇｌｙｃｙｒｈｉｚｉｎｃｏｎｔｅｎｔｂｙ２４ｔｉｍｅｓａｎｄｔｈｅｈｉｇｈｅｒｓｏｄｉｕｍａｃｅｔａｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎｔｈｅｈｉｇｈｅｒａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｂｉｏｍａｓｓ．Ｇｌｙｃｙｒｈｉｚｉｎｃｏｎｔｅｎｔｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｌｉｇｈｔｌｙｗｈｅｎｔｈｅｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅｄｏｓａｇｅｓｉｎｃｒｅａｓｅｄ
ｇｒａｄｕａｌｙｆｒｏｍ０１２ｍｍｏｌ·Ｌ－１．Ｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｇｌｙｃｙｒｈｉｚｉｎｃｏｎｔｅｎｔｏｆ１４１０μｇ·ｇ－１ｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｗｉｔｈｔｈｅａｄｄｉｔｉｏｎｏｆ２ｍｍｏｌ·Ｌ－１
ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅｗｈｉｃｈｗａｓ３６０ｔｉｍｅｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌ．Ｔｈｅａｄｄｉｔｉｏｎｏｆ０１ｍｍｏｌ·Ｌ－１ａｍｉｄｏｃａｐｒｏｉｃａｃｉｄｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｇｌｙ
ｃｙｒｈｉｚｉｎｃｏｎｔｅｎｔｂｙ２２４ｔｉｍｅｓ．Ｗｉｔｈｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｏｆｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆａｍｉｄｏｃａｐｒｏｉｃａｃｉｄ，ｔｈｅｇｌｙｃｙｒｈｉｚｉｎｃｏｎｔｅｎｔｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｌｉｇｈｔｌｙ
ａｎｄｔｈｅｈｉｇｈｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ２ｍｏｌ·Ｌ－１ｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｇｌｙｃｙｒｈｉｚｉｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅａｄｄｉｔｉｏｎｏｆｓｏｄｉｕｍａｃｅｔａｔｅ，
ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅａｎｄａｍｉｄｏｃａｐｒｏｉｃａｃｉｄｔｏｔｈｅｍｅｄｉｕｍｗｅｒｅｅｆｅｃｔｉｖｅａｐｐｒｏａｃｈｅｓｔｏｅｎｈａｎｃｅｔｈｅｇｌｙｃｙｒｈｉｚｉｎｃｏｎｔｅｎｔｉｎＧ．ｕｒａｌｅｎｓｉｓｃｅｌｓ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｇｌｙｃｙｒｈｉｚａｕｒａｌｅｎｓｉｓ；ｃｅｌｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅ；ｇｌｙｃｙｒｈｉｚｉｎｃｏｎｔｅｎｔ；ａｄｄｉｔｉｖｅｓ
［责任编辑 吕冬梅］
·０４７２·
第３３卷第２３期
２００８年１２月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ ２３
Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，２００８