全 文 ：怀牛膝愈伤组织悬浮培养及其多糖
含量的初步研究
薛建平，石晶莹
（郑州轻工业学院 食品与生物工程学院，河南 郑州 ４５０００２）
［摘要］ 目的：研究怀牛膝悬浮培养条件及其对愈伤组织中 ＡＢＰＳ含量的影响。方法：采用正交试验和单因
素试验，研究接种时间、接种量、碳源添加及ｐＨ对细胞生长量及多糖含量的影响。结果和结论：适宜ＡＢＰＳ生产的
培养基是１／４ＭＳ＋６ＢＡ０５ｍｇ·Ｌ－１＋２，４Ｄ１０ｍｇ·Ｌ－１＋蔗糖２％＋葡萄糖２％＋果糖１％，ｐＨ６０，培养时间
５０ｄ，接种量７ｇ·Ｌ－１。
［关键词］ 怀牛膝；细胞悬浮培养；多糖
［中图分类号］Ｓ５６７ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）２１２４６７０３
［收稿日期］ ２００７１２１２
［基金项目］ 郑州轻工业学院博士基金项目
［通讯作者］ 薛建平，Ｔｅｌ：（０５６１）３８０２０２５，Ｅｍａｉｌ：ｘｕｅｊｐ２０００
＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
怀牛膝 ＡｃｈｙｒａｎｔｈｅｓｂｉｄｅｎｔａｔａＢＩ．为苋科牛膝属
植物，主产于河南武陟、温县、博爱等地，是著名的
“四大怀药”之一。其根含有多种化学成分，包括多
糖类、皂苷类、植物甾酮类、黄酮类、生物碱及香豆素
等［１］。牛膝多糖（Ａｂｉｄｅｎｔａｔａｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ＡＢ
ＰＳ）是一种免疫调节剂，能够促进细胞免疫和体液
免疫，具有抗肿瘤和抗凝血的作用，临床应用前景十
分广阔［２］。国内外对怀牛膝的研究主要集中于成
分分析、药理作用等方面［３４］，关于细胞悬浮培养及
其多糖含量方面的研究鲜见报道。本实验就怀牛膝
细胞悬浮培养中接种时间、接种量、碳源添加及 ｐＨ
对怀牛膝细胞生长及多糖的含量进行初步研究，为
建立高效的ＡＢＰＳ离体生产体系提供技术基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料培养 在超净工作台上，选取由固体培养
基继代１５ｄ左右结构疏松的淡黄色愈伤组织，放入
经高压灭菌的１／４ＭＳ＋６ＢＡ０５ｍｇ·Ｌ－１＋２，４Ｄ
１０ｍｇ·Ｌ－１液体培养基中，其中蔗糖 ３％，ｐＨ６０，
并用镊子夹碎。每隔１０ｄ继代１次，继代５次，即
得细胞分散度高、传代较为稳定的怀牛膝愈伤组织
悬浮细胞系。每次吸取牛膝愈伤悬浮细胞系注入装
有经高压灭菌的新鲜培养基５０ｍＬ的１００ｍＬ三角
瓶。摇床转速１１０ｒ·ｍｉｎ－１，培养温度（２５±１）℃。
１．２ 培养条件和培养基设计 培养时间对愈伤组
织的生长量和 ＡＢＰＳ含量的影响设计为１０～６０ｄ，
每隔１０ｄ取样１次；接种量设计分别为１，３，５，７，９
ｇ·Ｌ－１；以蔗糖（Ａ）、葡萄糖（Ｂ）和果糖（Ｃ）为碳源，
采用Ｌ９（３
４）正交设计，质量分数分别为０，１％，２％；
以ｐＨ计调整灭菌后的培养基 ｐＨ分别为５０，５５，
６０，６５，研究ｐＨ对愈伤组织生长量和 ＡＢＰＳ含量
的影响。
１．３ 标准曲线的制备［５］ 以干燥至恒重的葡萄糖
为对照品，精密称定００４５ｇ，用蒸馏水定溶至１Ｌ，
制成４５ｍｇ·Ｌ－１的对照品溶液。精密吸取０，０２，
０６，１０，１４，１８，２０ｍＬ，置于试管中，加蒸馏水至
２０ｍＬ，加入５％苯酚溶液１ｍＬ混匀，迅速加入５
ｍＬ浓硫酸，振摇５ｍｉｎ，置沸水浴中１５ｍｉｎ，再置冷
水浴中３０ｍｉｎ，在可见紫外分光光度计上４８５ｎｍ
处测吸光度，以吸光度 Ａ为纵坐标，葡萄糖浓度 Ｗ
为横坐标，经回归处理得回归方程为 Ａ＝００１４６
Ｗ＋００００３，ｒ＝０９９９。
１．４ 细胞鲜重及 ＡＢＰＳ含量的测定 取牛膝愈伤
细胞悬浮培养液，用４００目的尼龙网过滤，并用滤纸
吸取水分，精密称定记录鲜重。然后将所得愈伤组
织放入试管中，加７５ｍＬ蒸馏水，于沸水浴中提取
３０ｍｉｎ（提取２次），合并提取液并浓缩后加入无水
乙醇至８０％，静置过夜，过滤得多糖粗品。计算相
当于０１ｇ牛膝愈伤所得糖液体积，吸出至１００ｍＬ
量瓶中，用水定容至刻度，即得各供试品溶液。采用
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第３３卷第２１期
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上述酚硫酸比色法测定 ＡＢＰＳ含量，每个处理重复
３次。
１．５ 数据处理 运用Ｅｘｃｅｌ对试验数据进行分析。
２ 结果与分析
２．１ 培养时间对愈伤组织生长和 ＡＢＰＳ含量的影
响 用移液枪每次吸取５ｍＬ牛膝愈伤悬浮细胞液，
注入装有新鲜培养基５０ｍＬ的１００ｍＬ的三角瓶中。
每隔１０ｄ随机抽取称重，测多糖含量。对于愈伤组
织生长量来说，在第 ５０天时达到最大值，而对于
ＡＢＰＳ合成而言，在第３０天时 ＡＢＰＳ含量最高。方
差分析表明，培养时间对细胞生长和 ＡＢＰＳ合成都
具有极显著影响（Ｐ＜００１）。因此以怀牛膝细胞悬
浮培养获得 ＡＢＰＳ为目标，培养５０ｄ时每升培养基
可得到最多（表１）。
表１ 培养时间对愈伤组织的生长量和ＡＢＰＳ积累的影响
培养时间／ｄ 鲜重／ｇ·Ｌ－１ ＡＢＰＳ／ｍｇ·ｇ－１ ＡＢＰＳ／ｍｇ·Ｌ－１
１０ ５００ ３８４１ １９２３２
２０ １２４９ ４２０７ ５２２５０
３０ １９３０ ４４２６ ８５８２６
４０ ３１５０ ３４８１ １１０６１９
５０ ４８８６ ３０９５ １５０３１５
６０ １２３７ ２６２２ ３２５２９
２．２ 接种量对愈伤组织生长量和 ＡＢＰＳ含量的影
响 将怀牛膝悬浮细胞系用４００目的尼龙网过滤，
分别称取００５，０１５，０２５，０３５，０４５ｇ放入悬浮培
养基中，使其接种量分别为１，３，５，７，９ｇ·Ｌ－１。摇
床中培养５０ｄ后称重并测定多糖含量。当接种量
为７ｇ·Ｌ－１时，愈伤组织生长量和细胞生产 ＡＢＰＳ
量都最高。方差分析表明，接种量对于愈伤组织生
长量和ＡＢＰＳ含量均具有极显著影响（Ｐ＜００１），
因此选择７ｇ·Ｌ－１为最佳接种量（表２）。
表２ 接种量对愈伤组织的生长量和ＡＢＰＳ积累的影响
接种量／ｇ·Ｌ－１ 鲜重／ｇ·Ｌ－１ ＡＢＰＳ／ｍｇ·ｇ－１
１ ２９６ ３２１８
３ １０７５ ３１５４
５ ６４０９ ４１３４
７ ８５４２ ４５３８
９ ６３１８ ３９８５
２．３ 碳源种类和浓度对愈伤组织生长量和ＡＢＰＳ含
量的影响 本实验选用的碳源有蔗糖（Ａ）、葡萄糖
（Ｂ）和果糖（Ｃ）３种，每个因素进行３水平正交试验
（表３），质量分数分别为０，１％，２％。极差Ｒ值大小
可知各因素对试验结果影响的主次顺序（表４），对鲜
重影响顺序为蔗糖＞葡萄糖＞果糖，其最佳培养基组
合为Ａ３Ｂ３Ｃ１；对于ＡＢＰＳ影响顺序为果糖＞葡萄糖＞
蔗糖，其最佳培养基组合为Ｃ２Ｂ３Ａ１。
表３ 碳源对愈伤组织生长量和ＡＢＰＳ积累影响
正交试验结果
培养基 鲜重／ｇ·Ｌ－１ ＡＢＰＳ／ｍｇ·ｇ－１
Ａ１Ｂ１Ｃ１ ０００ ０００
Ａ１Ｂ２Ｃ２ ２２７３ ５１９５
Ａ１Ｂ３Ｃ３ ２２７３ ５２４７
Ａ２Ｂ１Ｃ２ ３１５０ ３９４５
Ａ２Ｂ２Ｃ３ １９３３ ４０３１
Ａ２Ｂ３Ｃ１ ８３４０ １７５３
Ａ３Ｂ１Ｃ３ ３１５０ ３８２５
Ａ３Ｂ２Ｃ１ ９３７３ １８５６
Ａ３Ｂ３Ｃ２ ８６３０ ４６３０
表４ 碳源添加种类和添加量对愈伤组织的
生长和ＡＢＰＳ质量分数极差分析
均值
鲜重／ｇ·Ｌ－１
Ａ Ｂ Ｃ
ＡＢＰＳ／ｍｇ·ｇ－１
Ａ Ｂ Ｃ
Ｋ１ １５１６ ２１００ ５９０４ ３４８１ ２５９０ １２０３
Ｋ２ ４４７４ ４５２７ ４６８４ ３２４３ ３６９４ ４５９０
Ｋ３ ７０５１ ６４１４ ２４５２ ３４３７ ３８７７ ４３６８
Ｒ ５５３６ ４３１４ ３４５２ ２３８ １２８７ ３３８７
由于２个指标分析结果不一致，且经方差分析
３个因素影响均不显著，因此实验设计需综合考虑。
对于因素Ａ而言，其对鲜重影响排第１位，对 ＡＢＰＳ
影响排第 ３位，因此主要考虑鲜重的结果而选取
Ａ３。因素Ｂ对 ＡＢＰＳ和 鲜重的最优选择均是 Ｂ３。
对于Ｃ其对鲜重的影响排第３位，而对 ＡＢＰＳ的影
响排第１位，综合考虑应取Ｃ２。所以本试验经极差
分析后的较优条件为 ９号培养基 Ａ３Ｂ３Ｃ２，即蔗糖
２％、葡萄糖 ２％、果糖 １％，ＡＢＰＳ总量为 ３９９５６９
ｍｇ·Ｌ－１，确实高于其他８种培养基。
２．４ ｐＨ对愈伤组织生长量和 ＡＢＰＳ含量的影响
将配好的１／４ＭＳ＋６ＢＡ０５ｍｇ·Ｌ－１＋２，４Ｄ１０
ｍｇ·Ｌ－１液体培养基，其中碳源添加为３％的蔗糖。
高压灭菌后分成４份，在超净工作台上调 ｐＨ分别
为５０，５５，６０，６５，将５ｍＬ牛膝愈伤悬浮细胞液
接入装有新鲜培养基５０ｍＬ的１００ｍＬ的三角瓶，摇
床震荡培养５０ｄ后，抽取愈伤组织称重并测定多糖
含量。在 ｐＨ６０时愈伤生长量达到最大值，在 ｐＨ
５０时ＡＢＰＳ含量最高，方差分析表明 ｐＨ对细胞生
长和 ＡＢＰＳ合成都具有极显著影响（Ｐ＜００１）。因
两者最佳ｐＨ不一致，故考虑以每升悬浮培养细胞
获得最多ＡＢＰＳ为目标，ｐＨ６０为宜（表５）。
３ 讨论
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表５ ｐＨ对愈伤组织的生长和ＡＢＰＳ积累的影响
ｐＨ 鲜重／ｇ·Ｌ－１ ＡＢＰＳ／ｍｇ·ｇ－１ ＡＢＰＳ／ｍｇ·Ｌ－１
５０ ２７６８ ５９７２ １６２６９８
５５ ４５７４ ２６１１ １１８５８３
６０ ７７４４ ４３８７ ３３８３１２
６５ １９８２ ２９２８ ５８７４７
多糖是植物体内的初生代谢产物［６］，在悬浮细
胞的培养过程中，怀牛膝多糖的合成与积累也表现
出初生代谢产物的特征，即在细胞培养的早期合成
比较旺盛，３０ｄ后，其合成和积累开始下降。但怀
牛膝愈伤组织生长量加快，考虑总的ＡＢＰＳ收获量，
最终选择５０ｄ作为细胞收获期。
低接种量会使达到最大细胞量的时间延长，但
生长时间的延长通常对培养细胞不利，因为培养环
境会随着时间的延长有所变化；而过高的接种量易
导致培养液黏度增大，引起氧气和营养物质的传输
受限，细胞会因为缺乏营养而衰竭［７］。通过实验可
知７ｇ·Ｌ－１为适宜的接种量。
在植物细胞对碳源的利用过程中会将蔗糖分解
成葡萄糖和果糖，然后再优先利用葡萄糖。因此在
添加碳源时考虑蔗糖、葡萄糖、果糖的配比可加快细
胞的生长和初生代谢产物的合成。
液体培养基的 ｐＨ会影响细胞膜电位，膜电位
的变化又会影响细胞膜透性以及培养物体内常规成
分的出入，从而影响细胞生长和多糖合成积累［８］。
怀牛膝细胞生长和多糖的合成在 ｐＨ的选择上是一
对矛盾，在工业生产中，需要找到二者的契合点，才
能获得较高的产率。因为多糖的产量是由细胞生物
量和多糖的百分含量２个因素决定的，所以最终选
择ｐＨ６０。
综合以上分析，适宜怀牛膝愈伤组织悬浮培养
生 产 ＡＢＰＳ的 培 养 基 为 １／４ＭＳ＋６ＢＡ ０５
ｍｇ·Ｌ－１＋２，４Ｄ１０ｍｇ·Ｌ－１＋蔗糖２％ ＋葡萄糖
２％＋果糖１％，ｐＨ６０，培养时间５０ｄ，接种量７ｇ
·Ｌ－１。做验证实验，５０ｄ后测得愈伤组织鲜重为
１０３５１ｇ·Ｌ－１，每升培养液可得到 ＡＢＰＳ为 ４
８７７３９ｍｇ·ｇ－１，每克愈伤组织中 ＡＢＰＳ为 ４７１２
ｍｇ，远远高于怀牛膝原植株中 １７ｍｇ·ｇ－１［７］。因
此，深入研究怀牛膝愈伤组织悬浮培养条件，对今后
利用细胞工程技术工厂化生产ＡＢＰＳ具有重要的现
实意义。
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Ｐｒｉｍａｒｙｓｔｕｄｙｏｎｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｅｌｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ
ｃｏｎｔｅｎｔｏｆＡｃｈｙｒａｎｔｈｅｓｂｉｄｅｎｔａｔａ
ＸＵＥＪｉａｎｐｉｎｇ，ＳＨＩＪｉｎｇｙｉｎｇ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＦｏｏｄａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＺｈｅｎｇｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＬｉｇｈｔＩｎｄｕｓｔｒｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５０００２，Ｃｈｉｎａ）
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［责任编辑 吕冬梅］
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