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Fingerprint comparison of effective parts of Ermiao wan categorizedformula in anti-gouty syndrome of damp and heat

二妙丸类方抗湿热证痛风有效部位群指纹图谱比较研究



全 文 :相关性,总黄酮的指纹图谱中主要特征峰均可在药
材中找到相应的峰。
[参考文献]
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HPLCfingerprintoftotalflavonoidsofFoliumApocyniVeneti
HAOXuliang,ZHANGSuqiong,WANGXiaojian,LIQingshan
(SchoolofPharmaceuticalScience,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China)
  [Abstract] Objective:ToestablishasensitiveandspecificHPLCfingerprintforthequalitycontrolingoftotalflavonoidsofFolium
ApocyniVeneti.Method:HPLCanalysiswasperformedonaKromasilC18column(46mm×250mm,5μm)withthemixtureofsolventA
[acetonitrilephosphoricacid(95∶5)]andsolventB(005% phosphoricacid)ingradientmodeataflowrateof10mL·min-1.Thede
tectionwavelengthwassetat360nm.Thecolumntemperaturewassetat25℃andtheinjectionvolumewas20μL.Result:Thechromato
graphicfingerprintoftotalflavonoidswasestablishedwhichshowed17characteristicpeaksfrom7patchesoftotalflavonoidsproducts.The
similarityfromdiferentpatcheswas095100analyzedbythesoftwareof‘ComputeraidedSimilarityEvaluation’andshowedhighsimili
tudeinpeaknumbersandtheretentiontime.Moreover,comparisonoftheHPLCprofilesofthetotalflavonoidswiththecorespondingFolium
ApocyniVenetileavesindicatedthattheywerecloselyrelatedtoeachother.Conclusion:Thechromatographicfingerprintofthetotalfla
vonoidswithhighspecificityandcanbeusedtocontrolitsqualityandassurethehomogenicityforeachpatchofthetotalflavonoids.
[Keywords] FoliumApocyniVeneti;totalflavonoids;HPLC;fingerprint [责任编辑 鲍 雷]
[收稿日期] 20071228
[基金项目] 江苏省方剂重点实验室开放项目(022021014010)
[通讯作者] 尹莲,Tel:13813971246,Fax:(025)85811524,Email:yinlian162@163.com
二妙丸类方抗湿热证痛风有效部位群
指纹图谱比较研究
李 欣1,尹 莲1,段金廒2,丁安伟1,2
(1.南京中医药大学 药学院,江苏 南京 210046;
2.江苏省方剂研究重点实验室,江苏 南京 210046)
[摘要] 目的:为探索类方方剂配伍物质基础变化特征,研究二妙丸类方(二妙丸、三妙丸、四妙丸及加味四妙
丸)配伍物质基础的关联。方法:建立加味四妙丸抗湿热证痛风有效部位群HPLC指纹图谱,利用对照品确定指纹
图谱共有峰成分、组方药有效部位色谱峰归属以及有效部位群共有峰的组方药有效部位来源,测定二妙丸类方抗
湿热证痛风有效部位群指纹图谱,比较指纹图谱共有峰成分特征及配伍变化。结果:加味四妙丸有效部位群有60
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个共有峰,分别来源于组方药生物碱、黄酮、有机酸部位。基础方与类方间有效部位群指纹图谱共有峰在数目及相
对峰面积比值方面呈现一定的变化规律。结论:二妙丸及其类方有共同的物质基础,从基础方到各类方,抗湿热证
痛风物质基础的配伍变化具有相关性。
[关键词] 二妙丸类方;有效部位群;HPLC指纹图谱;配伍变化
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)16197105
  二妙丸(EM)引自《医学纲目》朱震亨方,由黄
柏、苍术二药组成,是燥湿清热的经典方剂。三妙丸
(S3M)是在EM基础上加牛膝以活血化淤通络,补
肝肾强筋骨,专治下焦湿热之痹证。四妙丸(S4M)
在S3M基础上加薏苡仁,以增强祛湿热而利筋络之
力,主治湿热下注之痿证。临床常用S4M加味治疗
急性痛风[1],S4M加清热药(忍冬藤和土茯苓)即加
味四妙丸(GSM),是抗湿热证痛风的有效方剂[2]。
它们均是EM类方,又依次为基础方和类方,临床治
疗湿热下注证的各种病症[3]。
EM作为基础方,其有效部位主要由苍术挥发
油、黄柏生物碱组成,其中生物碱由小檗碱(批号713
9906)、巴马汀、药根碱、黄柏碱、木兰花碱等组成,具
有抗炎和免疫抑制作用[4];牛膝、薏苡仁的有效部位
为皂苷类等成分[5];土茯苓和忍冬藤两加味药中主要
有黄酮类、有机酸类成分,其中土茯苓中落新妇苷等
黄酮类成分,具有抗炎、镇痛、利尿作用[6],忍冬藤中
的绿原酸具有抗炎、抑菌作用[7]。GSM抗痛风有效
部位群由挥发油、生物碱、黄酮、有机酸、皂苷和糖类
组成[8],系统比较二妙丸类方[9]及其有效部位群抗湿
热证痛风生物效应显示,从基础方到类方,效应的变
化存在着一定的联系和规律[10]。为进一步研究二妙
丸类方物质基础配伍变化规律,作者建立了能充分反
映生物碱、黄酮、有机酸等成分信息的GSM有效部位
群HPLC指纹图谱,比较二妙丸类方指纹图谱共有峰
成分特征及配伍变化。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪Agilent1100,含在线真空脱气
机、高压二元梯度泵、恒温自动进样器、柱温箱、Agi
lent1100化学工作站等。
黄柏 PhelodendronchinenseSchneid.、苍术 At
ractylodeschinensisKoidz.、薏苡仁 CorxLacrymajobi
L.var.mayuen,牛膝AchyranthesbidintataBl.、忍冬
藤 LonicerajaponicaThunb.、土茯苓 Smilaxglabra
Roxb.6味药均自购,由南京中医药大学药学院中药
鉴定教研室王春根教授鉴定。
绿原酸(批号 110753200413)、药根碱(批号
0733200005)、小檗碱(批号7139906)、巴马汀(批号
110713200208)、落新妇苷(自制,HPLC峰面积归一
化法纯度>98%)、紫丁香苷(批号111574200201)等
购自中国生物制品检定所(批号)。甲醇(色谱纯),
冰醋酸(分析纯),娃哈哈纯净水,其他制备试剂为分
析纯。
2 方法与结果
2.1 供试品溶液的制备
对照品样品制备:将对照品精密称量后,甲醇定
容,配制成01g·L-1对照品供试液;将对照品溶液
加入加味四妙丸有效部位群溶液中,配制成对照品
供试液。
黄柏生物碱提取物:按文献[8]方法,黄柏醇提
后,经大孔树脂纯化得生物碱提取物,纯度为
645%。
按文献[10]方法制备二妙丸类方有效部位群,正
丁醇萃取,回收溶剂后用80%甲醇定容,其中二妙丸类
方有效部位群(EMP,S3MP,S4MP,GSMP)样品配制质
量浓度为04g·mL-1;黄柏生物碱、土茯苓黄酮、忍冬
藤黄酮、忍冬藤有机酸配制质量浓度为1g·mL-1。
苍术、黄柏、牛膝、薏苡仁、土茯苓、忍冬藤各称
取10g,甲醇浸泡过夜,超声05h,过滤,取滤液定
容10mL,制备成1g·mL-1样品。
2.2 色谱条件
KromasilC18色谱柱(46mm×200mm,5μm);流
动相A甲醇,B15%的醋酸水溶液;梯度洗脱程序为0
~60min,10%~45%A;60~85min,45%~75%A;85~
95min,75%~85%A;95~100min,85%~10%A;流速
08mL·min-1;检测波长280nm;柱箱温度30℃;进
样量10μL;分析时间100min。
2.3 方法学考察
2.3.1 精密度考察 取 GSMP供试品,连续进样6
次,按2.2项下色谱条件测定色谱图,各共有峰相对保
留时间RSD均小于05%,占总峰面积10%以上的共
有峰相对峰面积RSD均小于3%,表明精密度良好。
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2.3.2 重现性考察 按 2.1项下方法制备 6批
GSMP供试品,2.2项下色谱条件测定色谱图,各共
有峰相对保留时间 RSD均小于05%,占总峰面积
10%以上的共有峰相对峰面积 RSD均小于3%,表
明重现性良好。
2.3.3 稳定性试验 取 GSMP供试品,分别在0,
2,4,6,8,10h进样,按2.2项下色谱条件测定色谱
图,各共有峰的相对保留时间RSD均小于05%,占
总峰面积10%以上的共有峰相对峰面积 RSD均小
于3%,表明样品溶液在10h内稳定性较好。
2.4 GSMP指纹图谱建立
按2.1项下方法制备10批GSMP样品,2.2项下
色谱条件测定色谱图,制订指纹图谱技术参数。其中
保留时间及峰面积相对稳定的60个共有峰峰面积占
总峰面积90%以上,确定为GSMP指纹图谱共有峰,
见图1。与对照品比对,第39个共有峰(tR490291
min)是巴马汀,定作参照峰。计算其他各共有峰相对
保留时间和相对峰面积比值,按其相对保留时间定
性,各共有峰相对保留时间的RSD均小于05%,其
中占峰面积10%以上的15,18,19,27,33,37,39,40号
峰的相对峰面积的RSD均小于3%。
2.5 指纹图谱共有峰定性分析
1~60为共有峰
图1 GMP有效部位群HPLC图
  2.2项下色谱条件测定对照品、组方药及其有效
部位色谱图,与GSMP指纹图谱对比见图2。根据各
色谱峰相对保留时间比值比对,以及对加入定量对照
品的与未加入定量对照品的加味四妙丸供试液的峰
面积变化进行对比,确定第14,28,37,43,51号峰来
源于土茯苓黄酮部位,其中,37号共有峰为落新妇
苷;第4,34,38,44号峰来源于忍冬藤黄酮部位;第
17,18,46号峰来源于忍冬藤有机酸,其中,第18号峰
为绿原酸;第20号峰为黄柏中的紫丁香苷,第11,21,
23号峰来源于牛膝,第7,54号峰来源于薏苡仁,其余
42个共有峰来源于黄柏生物碱部位,其中,36号峰为
药根碱,39号峰为巴马汀,40号峰为小檗碱。
1.土茯苓有机酸;2.忍冬藤有机酸;3.土茯苓黄酮;4.忍冬藤黄酮;5.黄柏生物碱;6.牛膝;7.薏苡仁;8.GSMP
图2 组方药及其有效部位与GSMPHPLC指纹图谱叠加图
2.6 二妙丸类方有效部位群HPLC指纹图谱比较
按2.2项下色谱条件测定 EMP,S3MP,S4MP,
GSMPHPLC指纹图谱,叠加图见图3,二妙丸类方
与基础方二妙丸有效部位群的指纹图谱特征相似。
EM基础方与类方有效部位群共有峰及其相对
峰面积比值见表1。EMP指纹图谱43个共有峰来
源于黄柏,其中 42个共有峰来源于生物碱部位;
S3MP指纹图谱共有峰在EMP基础上增加了3个牛
膝共有峰;S4MP指纹图谱共有峰在S3MP的基础上
增加了薏苡仁2个共有峰;GSMP指纹图谱共有峰
在S4MP的基础上增加了加味药14个共有峰,来源
于加味药黄酮和有机酸类部位。
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1.EMP;2.S3MP;3.S4MP;4.GSMP
图3 二妙丸类方有效部位群HPLC指纹图谱叠加图
表1 二妙丸类方指纹图谱共有峰相对峰面积比值
峰号 成分归属
峰面积比值
EMP S3MP S4MP GSMP
峰号 成分归属
峰面积比值
EMP S3MP S4MP GSMP
1 黄柏生物碱 0060 0082 0079 0069 31 黄柏生物碱 0023 0013 0016 0042
2 黄柏生物碱 0007 0009 0009 0011 32 黄柏生物碱 0061 0052 0048 0074
3 黄柏生物碱 0027 0030 0031 0032 33 黄柏生物碱 0046 0037 0042 0100
4 忍冬藤黄酮 0000 0000 0000 0009 34 忍冬藤黄酮 0000 0000 0000 0033
5 黄柏生物碱 0008 0008 0009 0012 35 黄柏生物碱 0055 0036 0023 0081
6 黄柏生物碱 0030 0042 0075 0058 36 盐酸药根碱 0099 0078 0068 0098
7 薏苡仁   0000 0000 0003 0065 37 落新妇苷  0000 0000 0000 0094
8 黄柏生物碱 0020 0017 0016 0027 38 忍冬藤黄酮 0000 0000 0000 0088
9 黄柏生物碱 0051 0049 0049 0060 39 巴马汀   1000 1000 1000 1000
10 黄柏生物碱 0034 0025 0024 0031 40 小檗碱   0672 0663 0633 0655
11 牛膝    0000 0005 0005 0009 41 黄柏生物碱 0025 0008 0006 0035
12 黄柏生物碱 0024 0021 0015 0022 42 黄柏生物碱 0031 0012 0008 0029
13 黄柏生物碱 0011 0008 0006 0009 43 土茯苓黄酮 0000 0000 0000 0094
14 土茯苓黄酮 0000 0000 0000 0029 44 忍冬藤黄酮 0000 0000 0000 0088
15 黄柏生物碱 0060 0087 0118 0102 45 黄柏生物碱 0037 0022 0015 0043
16 黄柏生物碱 0098 0073 0070 0093 46 忍冬有机酸 0000 0000 0000 0063
17 忍冬有机酸 0000 0000 0000 0029 47 黄柏生物碱 0028 0003 0004 0054
18 绿原酸   0000 0000 0000 0119 48 黄柏生物碱 0033 0008 0003 0017
19 黄柏生物碱 0127 0129 0398 0455 49 黄柏生物碱 0020 0006 0015 0081
20 紫丁香苷  0043 0018 0050 0034 50 黄柏生物碱 0023 0004 0005 0040
21 牛膝    0000 0082 0050 0058 51 土茯苓黄酮 0000 0000 0000 0031
22 黄柏生物碱 0038 0024 0013 0077 52 黄柏生物碱 0026 0009 0009 0069
23 牛膝    0000 0008 0011 0027 53 黄柏生物碱 0014 0003 0003 0025
24 黄柏生物碱 0022 0018 0015 0050 54 薏苡仁   0000 0000 0010 0032
25 黄柏生物碱 0051 0043 0046 0081 55 黄柏生物碱 0030 0024 0090 0535
26 黄柏生物碱 0075 0058 0033 0093 56 黄柏生物碱 0054 0036 0038 0059
27 黄柏生物碱 0019 0012 0027 0032 57 黄柏生物碱 0131 0095 0101 0154
28 土茯苓黄酮 0000 0000 0000 0144 58 黄柏生物碱 0114 0089 0097 0106
29 黄柏生物碱 0164 0145 0141 0109 59 黄柏生物碱 0079 0063 0068 0080
30 黄柏生物碱 0019 0014 0007 0023 60 黄柏生物碱 0079 0059 0065 0106
  基础方EM配伍类方后,生物碱部位共有峰相
对峰面积有一定的变化趋势。小檗碱在配伍后相对
峰面积比值相对稳定;药根碱,8,9,22,24,25,26,
30,31,32,33,35,41,45,47,49,50,52,53,56,57,
59,60号共有峰配伍牛膝(S3M)、薏苡仁(S4M)后,
相对峰面积比值减小,配伍土茯苓、忍冬藤后
(GSM),相对峰面积增加;10,12,13,16,20,29,42,
48号共有峰配伍牛膝(S3M)、薏苡仁(S4M)及加味
药(GSM)后,相对峰面积有减小趋势;1,2,3,5,6,
15,19,27,55号峰共有峰在 S3M,S4M,GSM中相对
峰面积有增加的趋势。EM配伍牛膝、薏苡仁后,多
数共有峰有增加的趋势。
3 结果讨论
方剂配伍规律是中医药理论的特色和关键,以
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经典方作为基础方,按其制方规范加减配伍所形成
的多种类方在临床上应用较多。将传统医学理论与
现代科技相结合,研究经典方与其类方的药效物质
基础变化规律,阐明类方方剂配伍规律的科学内涵,
是探索方剂配伍规律的重要途径之一。中药复方化
学成分复杂,而以有效部位为药效物质基础的基本
单元,利用现代色谱分析技术,测定有效部位指纹图
谱,符合中药药效物质基础整体性和模糊性的特征
要求。
在GSMP指纹图谱中,主要共有峰来源于二妙
丸生物碱部位,因此,二妙丸及其3个类方指纹图谱
具有很大的相似性。牛膝、薏苡仁有效部位为皂苷,
在该指纹图谱中不能反映出来,S3MP,S4MP指纹图
谱增加的共有峰较少,而GSMP指纹图谱中,增加的
共有峰来源于加味药中黄酮和有机酸有效部位。本
研究是以巴马汀为参照峰,其他共有峰是按相对峰
面积比值进行比较,因此,生物碱部位的共有峰是相
对与巴马汀相对峰面积的相对变化。多数生物碱部
位共有峰在配伍 S3M,S4M后相对含量减少,与前
人研究一致[11]。
作者通过建立 GSMPHPLC指纹图谱,比较二
妙丸类方有效部位群生物碱、黄酮、有机酸有效部位
成分信息的特征及其差异,探索类方方剂物质基础
的表征途径。要全面表征二妙丸类方有效部位群物
质基础特征,还需进一步表征挥发油、皂苷等有效部
位成分特征,并用现代统计分析方法研究多成分配
伍效应变化的相关性。
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FingerprintcomparisonofefectivepartsofErmiaowancategorized
formulainantigoutysyndromeofdampandheat
LIXin1,YINLian1,DUANJinao2,DINGAnwei1,2
(1KeyLaboratoryforModernResearchofTraditionalChineseMedicalFormulaeofJiansu,NanjingUniversity
ofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210046,China)
[Abstract] Objective:TostudythecorelationinthematerialfoundationincompatibilityofErmiaowancategorizedformulas
(Ermiaowan,Sanmiaowan,SimiaowanandmodifiedSimiaowan)andtoexploreitscharacteristicschanges.Method:Determinedthe
fingerprintoftheefectivepartsofErmiaowancategorizedformulasinantigoutysyndromeofdampandheatandcomparedthecomposi
tionfeaturesandcompatibilitychangesoftotalpeaksbyestablishingtheHPLCfingerprintandusingreferencesubstancestoidentifythe
ingredientsofthecommonpeaks,theascriptionandthesourceofthechromatographicpeaks.Result:Theefectivepartsofmodified
SimiaoWanhad60totalpeakswhichcomefromthesitesofalkaloids,flavonoids,organicacids.Thereweresomechangeprinciplesin
thenumberoftotalpeaksandrelativepeakarearatiobetweenbasicformulaandcategorizedformulas.Conclusion:Ermiaowancatego
rizedformulashavesamesubstancefoundationandtherearesomecorelationsinthecompatibilitychanges.
[Keywords] Ermiaowancategorizedformulas;efectiveparts;HPLCfingerprint;compatibilitychanges
[责任编辑 鲍 雷]
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第33卷第16期
2008年8月
         
    中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
       
Vol.33,Issue 16
August,2008