全 文 :相关性,总黄酮的指纹图谱中主要特征峰均可在药
材中找到相应的峰。
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HPLCfingerprintoftotalflavonoidsofFoliumApocyniVeneti
HAOXuliang,ZHANGSuqiong,WANGXiaojian,LIQingshan
(SchoolofPharmaceuticalScience,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China)
[Abstract] Objective:ToestablishasensitiveandspecificHPLCfingerprintforthequalitycontrolingoftotalflavonoidsofFolium
ApocyniVeneti.Method:HPLCanalysiswasperformedonaKromasilC18column(46mm×250mm,5μm)withthemixtureofsolventA
[acetonitrilephosphoricacid(95∶5)]andsolventB(005% phosphoricacid)ingradientmodeataflowrateof10mL·min-1.Thede
tectionwavelengthwassetat360nm.Thecolumntemperaturewassetat25℃andtheinjectionvolumewas20μL.Result:Thechromato
graphicfingerprintoftotalflavonoidswasestablishedwhichshowed17characteristicpeaksfrom7patchesoftotalflavonoidsproducts.The
similarityfromdiferentpatcheswas095100analyzedbythesoftwareof‘ComputeraidedSimilarityEvaluation’andshowedhighsimili
tudeinpeaknumbersandtheretentiontime.Moreover,comparisonoftheHPLCprofilesofthetotalflavonoidswiththecorespondingFolium
ApocyniVenetileavesindicatedthattheywerecloselyrelatedtoeachother.Conclusion:Thechromatographicfingerprintofthetotalfla
vonoidswithhighspecificityandcanbeusedtocontrolitsqualityandassurethehomogenicityforeachpatchofthetotalflavonoids.
[Keywords] FoliumApocyniVeneti;totalflavonoids;HPLC;fingerprint [责任编辑 鲍 雷]
[收稿日期] 20071228
[基金项目] 江苏省方剂重点实验室开放项目(022021014010)
[通讯作者] 尹莲,Tel:13813971246,Fax:(025)85811524,Email:yinlian162@163.com
二妙丸类方抗湿热证痛风有效部位群
指纹图谱比较研究
李 欣1,尹 莲1,段金廒2,丁安伟1,2
(1.南京中医药大学 药学院,江苏 南京 210046;
2.江苏省方剂研究重点实验室,江苏 南京 210046)
[摘要] 目的:为探索类方方剂配伍物质基础变化特征,研究二妙丸类方(二妙丸、三妙丸、四妙丸及加味四妙
丸)配伍物质基础的关联。方法:建立加味四妙丸抗湿热证痛风有效部位群HPLC指纹图谱,利用对照品确定指纹
图谱共有峰成分、组方药有效部位色谱峰归属以及有效部位群共有峰的组方药有效部位来源,测定二妙丸类方抗
湿热证痛风有效部位群指纹图谱,比较指纹图谱共有峰成分特征及配伍变化。结果:加味四妙丸有效部位群有60
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个共有峰,分别来源于组方药生物碱、黄酮、有机酸部位。基础方与类方间有效部位群指纹图谱共有峰在数目及相
对峰面积比值方面呈现一定的变化规律。结论:二妙丸及其类方有共同的物质基础,从基础方到各类方,抗湿热证
痛风物质基础的配伍变化具有相关性。
[关键词] 二妙丸类方;有效部位群;HPLC指纹图谱;配伍变化
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)16197105
二妙丸(EM)引自《医学纲目》朱震亨方,由黄
柏、苍术二药组成,是燥湿清热的经典方剂。三妙丸
(S3M)是在EM基础上加牛膝以活血化淤通络,补
肝肾强筋骨,专治下焦湿热之痹证。四妙丸(S4M)
在S3M基础上加薏苡仁,以增强祛湿热而利筋络之
力,主治湿热下注之痿证。临床常用S4M加味治疗
急性痛风[1],S4M加清热药(忍冬藤和土茯苓)即加
味四妙丸(GSM),是抗湿热证痛风的有效方剂[2]。
它们均是EM类方,又依次为基础方和类方,临床治
疗湿热下注证的各种病症[3]。
EM作为基础方,其有效部位主要由苍术挥发
油、黄柏生物碱组成,其中生物碱由小檗碱(批号713
9906)、巴马汀、药根碱、黄柏碱、木兰花碱等组成,具
有抗炎和免疫抑制作用[4];牛膝、薏苡仁的有效部位
为皂苷类等成分[5];土茯苓和忍冬藤两加味药中主要
有黄酮类、有机酸类成分,其中土茯苓中落新妇苷等
黄酮类成分,具有抗炎、镇痛、利尿作用[6],忍冬藤中
的绿原酸具有抗炎、抑菌作用[7]。GSM抗痛风有效
部位群由挥发油、生物碱、黄酮、有机酸、皂苷和糖类
组成[8],系统比较二妙丸类方[9]及其有效部位群抗湿
热证痛风生物效应显示,从基础方到类方,效应的变
化存在着一定的联系和规律[10]。为进一步研究二妙
丸类方物质基础配伍变化规律,作者建立了能充分反
映生物碱、黄酮、有机酸等成分信息的GSM有效部位
群HPLC指纹图谱,比较二妙丸类方指纹图谱共有峰
成分特征及配伍变化。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪Agilent1100,含在线真空脱气
机、高压二元梯度泵、恒温自动进样器、柱温箱、Agi
lent1100化学工作站等。
黄柏 PhelodendronchinenseSchneid.、苍术 At
ractylodeschinensisKoidz.、薏苡仁 CorxLacrymajobi
L.var.mayuen,牛膝AchyranthesbidintataBl.、忍冬
藤 LonicerajaponicaThunb.、土茯苓 Smilaxglabra
Roxb.6味药均自购,由南京中医药大学药学院中药
鉴定教研室王春根教授鉴定。
绿原酸(批号 110753200413)、药根碱(批号
0733200005)、小檗碱(批号7139906)、巴马汀(批号
110713200208)、落新妇苷(自制,HPLC峰面积归一
化法纯度>98%)、紫丁香苷(批号111574200201)等
购自中国生物制品检定所(批号)。甲醇(色谱纯),
冰醋酸(分析纯),娃哈哈纯净水,其他制备试剂为分
析纯。
2 方法与结果
2.1 供试品溶液的制备
对照品样品制备:将对照品精密称量后,甲醇定
容,配制成01g·L-1对照品供试液;将对照品溶液
加入加味四妙丸有效部位群溶液中,配制成对照品
供试液。
黄柏生物碱提取物:按文献[8]方法,黄柏醇提
后,经大孔树脂纯化得生物碱提取物,纯度为
645%。
按文献[10]方法制备二妙丸类方有效部位群,正
丁醇萃取,回收溶剂后用80%甲醇定容,其中二妙丸类
方有效部位群(EMP,S3MP,S4MP,GSMP)样品配制质
量浓度为04g·mL-1;黄柏生物碱、土茯苓黄酮、忍冬
藤黄酮、忍冬藤有机酸配制质量浓度为1g·mL-1。
苍术、黄柏、牛膝、薏苡仁、土茯苓、忍冬藤各称
取10g,甲醇浸泡过夜,超声05h,过滤,取滤液定
容10mL,制备成1g·mL-1样品。
2.2 色谱条件
KromasilC18色谱柱(46mm×200mm,5μm);流
动相A甲醇,B15%的醋酸水溶液;梯度洗脱程序为0
~60min,10%~45%A;60~85min,45%~75%A;85~
95min,75%~85%A;95~100min,85%~10%A;流速
08mL·min-1;检测波长280nm;柱箱温度30℃;进
样量10μL;分析时间100min。
2.3 方法学考察
2.3.1 精密度考察 取 GSMP供试品,连续进样6
次,按2.2项下色谱条件测定色谱图,各共有峰相对保
留时间RSD均小于05%,占总峰面积10%以上的共
有峰相对峰面积RSD均小于3%,表明精密度良好。
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2.3.2 重现性考察 按 2.1项下方法制备 6批
GSMP供试品,2.2项下色谱条件测定色谱图,各共
有峰相对保留时间 RSD均小于05%,占总峰面积
10%以上的共有峰相对峰面积 RSD均小于3%,表
明重现性良好。
2.3.3 稳定性试验 取 GSMP供试品,分别在0,
2,4,6,8,10h进样,按2.2项下色谱条件测定色谱
图,各共有峰的相对保留时间RSD均小于05%,占
总峰面积10%以上的共有峰相对峰面积 RSD均小
于3%,表明样品溶液在10h内稳定性较好。
2.4 GSMP指纹图谱建立
按2.1项下方法制备10批GSMP样品,2.2项下
色谱条件测定色谱图,制订指纹图谱技术参数。其中
保留时间及峰面积相对稳定的60个共有峰峰面积占
总峰面积90%以上,确定为GSMP指纹图谱共有峰,
见图1。与对照品比对,第39个共有峰(tR490291
min)是巴马汀,定作参照峰。计算其他各共有峰相对
保留时间和相对峰面积比值,按其相对保留时间定
性,各共有峰相对保留时间的RSD均小于05%,其
中占峰面积10%以上的15,18,19,27,33,37,39,40号
峰的相对峰面积的RSD均小于3%。
2.5 指纹图谱共有峰定性分析
1~60为共有峰
图1 GMP有效部位群HPLC图
2.2项下色谱条件测定对照品、组方药及其有效
部位色谱图,与GSMP指纹图谱对比见图2。根据各
色谱峰相对保留时间比值比对,以及对加入定量对照
品的与未加入定量对照品的加味四妙丸供试液的峰
面积变化进行对比,确定第14,28,37,43,51号峰来
源于土茯苓黄酮部位,其中,37号共有峰为落新妇
苷;第4,34,38,44号峰来源于忍冬藤黄酮部位;第
17,18,46号峰来源于忍冬藤有机酸,其中,第18号峰
为绿原酸;第20号峰为黄柏中的紫丁香苷,第11,21,
23号峰来源于牛膝,第7,54号峰来源于薏苡仁,其余
42个共有峰来源于黄柏生物碱部位,其中,36号峰为
药根碱,39号峰为巴马汀,40号峰为小檗碱。
1.土茯苓有机酸;2.忍冬藤有机酸;3.土茯苓黄酮;4.忍冬藤黄酮;5.黄柏生物碱;6.牛膝;7.薏苡仁;8.GSMP
图2 组方药及其有效部位与GSMPHPLC指纹图谱叠加图
2.6 二妙丸类方有效部位群HPLC指纹图谱比较
按2.2项下色谱条件测定 EMP,S3MP,S4MP,
GSMPHPLC指纹图谱,叠加图见图3,二妙丸类方
与基础方二妙丸有效部位群的指纹图谱特征相似。
EM基础方与类方有效部位群共有峰及其相对
峰面积比值见表1。EMP指纹图谱43个共有峰来
源于黄柏,其中 42个共有峰来源于生物碱部位;
S3MP指纹图谱共有峰在EMP基础上增加了3个牛
膝共有峰;S4MP指纹图谱共有峰在S3MP的基础上
增加了薏苡仁2个共有峰;GSMP指纹图谱共有峰
在S4MP的基础上增加了加味药14个共有峰,来源
于加味药黄酮和有机酸类部位。
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1.EMP;2.S3MP;3.S4MP;4.GSMP
图3 二妙丸类方有效部位群HPLC指纹图谱叠加图
表1 二妙丸类方指纹图谱共有峰相对峰面积比值
峰号 成分归属
峰面积比值
EMP S3MP S4MP GSMP
峰号 成分归属
峰面积比值
EMP S3MP S4MP GSMP
1 黄柏生物碱 0060 0082 0079 0069 31 黄柏生物碱 0023 0013 0016 0042
2 黄柏生物碱 0007 0009 0009 0011 32 黄柏生物碱 0061 0052 0048 0074
3 黄柏生物碱 0027 0030 0031 0032 33 黄柏生物碱 0046 0037 0042 0100
4 忍冬藤黄酮 0000 0000 0000 0009 34 忍冬藤黄酮 0000 0000 0000 0033
5 黄柏生物碱 0008 0008 0009 0012 35 黄柏生物碱 0055 0036 0023 0081
6 黄柏生物碱 0030 0042 0075 0058 36 盐酸药根碱 0099 0078 0068 0098
7 薏苡仁 0000 0000 0003 0065 37 落新妇苷 0000 0000 0000 0094
8 黄柏生物碱 0020 0017 0016 0027 38 忍冬藤黄酮 0000 0000 0000 0088
9 黄柏生物碱 0051 0049 0049 0060 39 巴马汀 1000 1000 1000 1000
10 黄柏生物碱 0034 0025 0024 0031 40 小檗碱 0672 0663 0633 0655
11 牛膝 0000 0005 0005 0009 41 黄柏生物碱 0025 0008 0006 0035
12 黄柏生物碱 0024 0021 0015 0022 42 黄柏生物碱 0031 0012 0008 0029
13 黄柏生物碱 0011 0008 0006 0009 43 土茯苓黄酮 0000 0000 0000 0094
14 土茯苓黄酮 0000 0000 0000 0029 44 忍冬藤黄酮 0000 0000 0000 0088
15 黄柏生物碱 0060 0087 0118 0102 45 黄柏生物碱 0037 0022 0015 0043
16 黄柏生物碱 0098 0073 0070 0093 46 忍冬有机酸 0000 0000 0000 0063
17 忍冬有机酸 0000 0000 0000 0029 47 黄柏生物碱 0028 0003 0004 0054
18 绿原酸 0000 0000 0000 0119 48 黄柏生物碱 0033 0008 0003 0017
19 黄柏生物碱 0127 0129 0398 0455 49 黄柏生物碱 0020 0006 0015 0081
20 紫丁香苷 0043 0018 0050 0034 50 黄柏生物碱 0023 0004 0005 0040
21 牛膝 0000 0082 0050 0058 51 土茯苓黄酮 0000 0000 0000 0031
22 黄柏生物碱 0038 0024 0013 0077 52 黄柏生物碱 0026 0009 0009 0069
23 牛膝 0000 0008 0011 0027 53 黄柏生物碱 0014 0003 0003 0025
24 黄柏生物碱 0022 0018 0015 0050 54 薏苡仁 0000 0000 0010 0032
25 黄柏生物碱 0051 0043 0046 0081 55 黄柏生物碱 0030 0024 0090 0535
26 黄柏生物碱 0075 0058 0033 0093 56 黄柏生物碱 0054 0036 0038 0059
27 黄柏生物碱 0019 0012 0027 0032 57 黄柏生物碱 0131 0095 0101 0154
28 土茯苓黄酮 0000 0000 0000 0144 58 黄柏生物碱 0114 0089 0097 0106
29 黄柏生物碱 0164 0145 0141 0109 59 黄柏生物碱 0079 0063 0068 0080
30 黄柏生物碱 0019 0014 0007 0023 60 黄柏生物碱 0079 0059 0065 0106
基础方EM配伍类方后,生物碱部位共有峰相
对峰面积有一定的变化趋势。小檗碱在配伍后相对
峰面积比值相对稳定;药根碱,8,9,22,24,25,26,
30,31,32,33,35,41,45,47,49,50,52,53,56,57,
59,60号共有峰配伍牛膝(S3M)、薏苡仁(S4M)后,
相对峰面积比值减小,配伍土茯苓、忍冬藤后
(GSM),相对峰面积增加;10,12,13,16,20,29,42,
48号共有峰配伍牛膝(S3M)、薏苡仁(S4M)及加味
药(GSM)后,相对峰面积有减小趋势;1,2,3,5,6,
15,19,27,55号峰共有峰在 S3M,S4M,GSM中相对
峰面积有增加的趋势。EM配伍牛膝、薏苡仁后,多
数共有峰有增加的趋势。
3 结果讨论
方剂配伍规律是中医药理论的特色和关键,以
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经典方作为基础方,按其制方规范加减配伍所形成
的多种类方在临床上应用较多。将传统医学理论与
现代科技相结合,研究经典方与其类方的药效物质
基础变化规律,阐明类方方剂配伍规律的科学内涵,
是探索方剂配伍规律的重要途径之一。中药复方化
学成分复杂,而以有效部位为药效物质基础的基本
单元,利用现代色谱分析技术,测定有效部位指纹图
谱,符合中药药效物质基础整体性和模糊性的特征
要求。
在GSMP指纹图谱中,主要共有峰来源于二妙
丸生物碱部位,因此,二妙丸及其3个类方指纹图谱
具有很大的相似性。牛膝、薏苡仁有效部位为皂苷,
在该指纹图谱中不能反映出来,S3MP,S4MP指纹图
谱增加的共有峰较少,而GSMP指纹图谱中,增加的
共有峰来源于加味药中黄酮和有机酸有效部位。本
研究是以巴马汀为参照峰,其他共有峰是按相对峰
面积比值进行比较,因此,生物碱部位的共有峰是相
对与巴马汀相对峰面积的相对变化。多数生物碱部
位共有峰在配伍 S3M,S4M后相对含量减少,与前
人研究一致[11]。
作者通过建立 GSMPHPLC指纹图谱,比较二
妙丸类方有效部位群生物碱、黄酮、有机酸有效部位
成分信息的特征及其差异,探索类方方剂物质基础
的表征途径。要全面表征二妙丸类方有效部位群物
质基础特征,还需进一步表征挥发油、皂苷等有效部
位成分特征,并用现代统计分析方法研究多成分配
伍效应变化的相关性。
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FingerprintcomparisonofefectivepartsofErmiaowancategorized
formulainantigoutysyndromeofdampandheat
LIXin1,YINLian1,DUANJinao2,DINGAnwei1,2
(1KeyLaboratoryforModernResearchofTraditionalChineseMedicalFormulaeofJiansu,NanjingUniversity
ofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210046,China)
[Abstract] Objective:TostudythecorelationinthematerialfoundationincompatibilityofErmiaowancategorizedformulas
(Ermiaowan,Sanmiaowan,SimiaowanandmodifiedSimiaowan)andtoexploreitscharacteristicschanges.Method:Determinedthe
fingerprintoftheefectivepartsofErmiaowancategorizedformulasinantigoutysyndromeofdampandheatandcomparedthecomposi
tionfeaturesandcompatibilitychangesoftotalpeaksbyestablishingtheHPLCfingerprintandusingreferencesubstancestoidentifythe
ingredientsofthecommonpeaks,theascriptionandthesourceofthechromatographicpeaks.Result:Theefectivepartsofmodified
SimiaoWanhad60totalpeakswhichcomefromthesitesofalkaloids,flavonoids,organicacids.Thereweresomechangeprinciplesin
thenumberoftotalpeaksandrelativepeakarearatiobetweenbasicformulaandcategorizedformulas.Conclusion:Ermiaowancatego
rizedformulashavesamesubstancefoundationandtherearesomecorelationsinthecompatibilitychanges.
[Keywords] Ermiaowancategorizedformulas;efectiveparts;HPLCfingerprint;compatibilitychanges
[责任编辑 鲍 雷]
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