全 文 ：超声循环法提取连钱草总黄酮
袁春玲，郭伟英
（锦州医学院 药学院，辽宁 锦州 １２１００１）
［摘要］　目的：在超声条件下寻找提取连钱草总黄酮的优化条件。方法：采用正交设计法，以超声功率、超声
时间、提取温度、溶剂体积分数为因素，每个因素３个水平，选择Ｌ９（３
４）正交表，用紫外分光光度法测定总黄酮的含
量做为评价指标。结果：最佳提取条件为超声功率８００Ｗ，超声时间９０（４５，４５）ｍｉｎ，提取温度４０℃，溶剂浓度
６５％。最佳提取条件下总黄酮的质量分数为５２２８％。结论：以乙醇为溶剂，采用超声循环提取技术提取连钱草中
总黄酮，提取温度低，时间短，提取效率高，具有广阔前景。
［关键词］　连钱草；黄酮；超声循环提取；正交试验
［中图分类号］Ｒ２８４．１　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１００１５３０２（２００７）０５０３８５０３
［收稿日期］　２００６０５２６
［通讯作者］　郭伟英，Ｔｅｌ：１３９４１６２７０３２，Ｅｍａｉｌ：ｗｙｉｎｇｕｏ＠
１６３．ｃｏｍ
　　连钱草为唇形科植物活血丹Ｇｌｅｃｈｏｍａｌｏｎｇｉｔｕｂａ
（Ｎａｋａｉ）Ｋｕｐｒ．的干燥地上部分，具有利湿通淋、清
热解毒、散瘀消肿的功效，临床上用于治疗热淋、石
淋、湿热黄疸等疾病［１］。连钱草茎叶含挥发油，主
要含单萜烯类成分，还含有熊果酸、棕榈酸、琥珀酸、
咖啡酸、阿魏酸等。对其非挥发性成分研究很
少［２］。在我国连钱草资源十分丰富，几乎分布于全
国各省，具有极大的开发价值。
目前也有超声和加热回流提取连钱草中总黄酮
的报道［２，３］，但未将超声、加热、循环同时应用于提
取过程。本研究采用超声循环技术对连钱草中总黄
酮进行提取，确定影响效果的主要因素和超声提取
黄酮的优化工艺条件，为有效的提取连钱草中的总
黄酮开辟了新途径。
１　仪器和材料
７２１紫外分光光度计（山东高密分析仪器厂），
“弘祥隆”ＨＦ－２０Ｂ超声循环提取机（北京弘祥隆
生物技术开发有限公司），旋转蒸发器 ＲＥ－５２（上
海精宏实验设备有限公司），ＬＤ４－２Ａ型低速离心
机（北京医用离心机厂），ＴＤ系列电子天平（天津市
天平电子仪器有限公司）。
连钱草（安徽亳州药材公司，由辽宁中医药大
学生药学贾天柱教授鉴定）粉碎，过８０目筛；芦丁
对照品（中国药品生物制品检定所，批号 ００８０
９７０５）。乙醇（ＡＲ，天津市北方天医化学试剂厂），
亚硝酸钠（ＡＲ，天津市泰兴试剂厂），硝酸铝（ＡＲ，天
津市泰兴试剂厂），氢氧化钠（ＡＲ，天津市标准科技
有限公司）。
２　方法与结果
２．１　对照品溶液的制备　精密称取１２０℃常压干
燥至恒重的芦丁对照品２５０ｍｇ，置于１００ｍＬ的量
瓶中，加６０％乙醇约６０ｍＬ，密塞，超声使其溶解，放
冷，加 ６０％乙醇至刻度，摇匀，得芦丁对照品溶液
（０２５ｍｇ·ｍＬ－１）。
２．２　标准曲线的绘制　精密量取芦丁对照品溶液
０，１，２，３，４，５ｍＬ，分别置于２５ｍＬ的量瓶中，分别加
水５，４，３，２，１，０ｍＬ，加５％亚硝酸钠溶液１ｍＬ，摇
匀，放置６ｍｉｎ，加１０％三氯化铝试液１ｍＬ。摇匀，
放置６ｍｉｎ，再加５％的氢氧化钠溶液１０ｍＬ，加水至
刻度，摇匀，放置１５ｍｉｎ后以第１管作空白对照，在
５１０ｎｍ测定吸光度，以吸光度值对芦丁对照品含量
绘制标准曲线，回归方程Ｙ＝６７３７１Ｘ－００００１，线
性范围００１～００５ｍｇ·ｍＬ－１，ｒ＝０９９９９。
２．３　重复性试验　取５份供试品溶液０１ｍＬ，按
标准曲线绘制项下的方法测定总黄酮含量，结果
ＲＳＤ为０９％。
２．４　稳定性试验　取供试品溶液０１ｍＬ，按标准
曲线项下方法操作，并每隔５ｍｉｎ测定一次吸光度。
结果表明，２０ｍｉｎ以内测定吸光度 ＲＳＤ＜２％，建议
定容后立即测定。
２．５　回收率试验　取供试品溶液５份，分别加入芦
丁对照品溶液适量，按标准曲线绘制项下的方法测
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定总黄酮含量，平均回收率１０１３８％，ＲＳＤ１１３％，
结果表明加样回收良好。
２．６　总黄酮含量的测定　吸取１ｍＬ供试品溶液，
然后按标准曲线制备项下方法测定吸光度值，带入
芦丁标准曲线方程得出质量浓度，然后计算各提取
液中总黄酮的含量（以芦丁计），即为得率。公式如
下：
总黄酮（％）＝
ＣＶ１Ｖ２
１０００ＷＶ３
×１００％
Ｃ：测定液黄酮质量浓度（ｍｇ·ｍＬ－１）；Ｗ：药品
量（ｇ）；Ｖ１：提取定容体积（ｍＬ）；Ｖ２：显色反应定容体
积（ｍＬ）；Ｖ３：显色反应取样液体积（ｍＬ）。
２．７　传统总黄酮提取方法及含量测定　按照黄齐
慧等在不同采收期对连钱草中总黄酮的影响［４］中
采用的提取方法：精密称取６０℃干燥至恒重的样品
粗粉１０ｇ，置玻璃烧瓶中，加入６０％乙醇１００ｍＬ，
水浴加热回流提取６０ｍｉｎ，提取２次，过滤，合并滤
液，放置２４ｈ后，过滤，减压回收乙醇，加蒸馏水定
容至１００ｍＬ，测定吸光度，计算总黄酮质量分数为
５１６８％。按照祝德秋等在连钱草中总黄酮的含量
测定［３］中采用的提取方法：取连钱草粉末约０５ｇ，
精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加６０％乙醇６０
ｍＬ，密塞，称定重量，超声５０ｍｉｎ。放冷，密塞，再称
定重量，用６０％乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤，
测定吸光度，计算总黄酮质量分数为４０２７％。
２．８　单因素分析
２．８．１　固液比　分别按照固液比１∶１００；１∶５０；１∶１０
加入相应的连钱草和６０％乙醇，在４００Ｗ，１０００ｒ·
ｍｉｎ－１，室温下进行超声循环提取２０ｍｉｎ，测定黄酮吸
光度，并算出含量。结果总黄酮质量分数依次为
４４２５％，３４７０％，３２０７％。从实验结果可以得出，固
液比为１∶１００时提取效率最高，因此以下的单因素分
析及正交实验均采用固液比为１∶１００。
２．８．２　乙醇体积分数　取连钱草２４ｇ，分别用梯度
乙醇（９５％，８０％，６０％，４０％，２０％，０％）２４００ｍＬ，
在４００Ｗ，１０００ｒ·ｍｉｎ－１，室温下进行超声循环提
取２０ｍｉｎ，测定黄酮吸光度，并算出含量。结果总黄
酮质量分数依次为 ０７１４％，２６４４％，３７７２％，
３８９０％，３５９４％，２７３３％。从实验结果可以得出，
从既节省溶剂又高效的角度可以考虑４０％乙醇，但
是溶剂浓度降低大量水溶性杂质给后续工作带来大
量麻烦。６０％乙醇中黄酮含量较高，因此选择６０％
乙醇进行正交实验。
２．８．３　超声时间　取连钱草２４ｇ，６０％乙醇２４００
ｍＬ，在４００Ｗ，１０００ｒ·ｍｉｎ－１，室温下进行超声循环
提取，每１０ｍｉｎ取样１次，测定黄酮吸光度，并算出
含量。即在超声时间为 １０，２０，３０，４０，５０，６０ｍｉｎ
时，黄 酮 质 量 分 数 依 次 为 ２６１４％，４３０６％，
４３８０％，４６９２％，４８７０％，４９００％。从实验可以
看出，随着时间的增加黄酮质量分数也在增加，但
５０ｍｉｎ以后增长趋缓，因此选择５０ｍｉｎ左右进行正
交试验。
２．８．４　超声次数　取连钱草２４ｇ，６０％乙醇２４００
ｍＬ，在４００Ｗ，１０００ｒ·ｍｉｎ－１，室温下进行超声循环
提取，每次２０ｍｉｎ，测定黄酮吸光度，并算出含量。提
取次数分别为１，２，３，４次时，总黄酮质量分数依次为
４１２８％，４６３４％，４６３５％，４６５１％。可以看出，随着
提取次数的增加黄酮质量分数也随着增加，但是２次
以后含量增长缓慢，因此提取２次即可。
２．８．５　提取温度　温度过高乙醇挥发严重，而且杂
质溶出增加；温度过低，影响黄酮在乙醇中的溶出。
因此，综合考虑，选取２０，３０，４０℃进行正交实验。
２．９　正交实验设计及各因素水平设置　选取超声
功率（Ａ）、超声时间（Ｂ）、提取温度（Ｃ）、溶剂体积分
数（Ｄ）为主要考察因素，各因素及水平设置如表１
所示。正交实验采用 ４因素 ３水平正交表，即 Ｌ９
（３４）正交表进行实验，见表２。且在正交表安排的
每个实验号条件下进行３次重复实验。
表１　因素水平
Ａ
超声功率
／Ｗ
Ｂ
超声时间
／ｍｉｎ
Ｃ
提取温度
／℃
Ｄ
溶剂体积分数
／％
４００ ８０（４０，４０） ２０ ６０
６００ ９０（４５，４５） ３０ ６５
８００ １００（５０，５０） ４０ ７０
表２　正交试验结果 ％
Ｎｏ． 总黄酮质量分数 加和
１ ３９８２ ４０４０ ４３３７ １２３５９
２ ４５１６ ４６３４ ４６０４ １３７５４
３ ４８７２ ４８７２ ４６０４ １４３４８
４ ４３３８ ４１２９ ４０４０ １２５０７
５ ４８７２ ４９９０ ４９９１ １４８５３
６ ４２７８ ４５７４ ４３９７ １３２４９
７ ４８７２ ５０５０ ４９６１ １４８８３
８ ４１６０ ４３３８ ４１００ １２５９８
９ ４２１８ ４３９６ ４５４６ １３１６０
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　　采用极差法对正交试验结果进行差异分析，由
表２可以看出连钱草中总黄酮的最佳提取条件为
Ａ３Ｂ２Ｃ３Ｄ２，即超声功率８００Ｗ，超声时间９０（４５，４５）
ｍｉｎ，提取温度４０℃，溶剂浓度６５％。由表２中 Ｒ
值可以看出，４种因素对连钱草中总黄酮提取效果
的影响程度依次为：提取温度 ＞溶剂浓度 ＞超声时
间＞超声功率。该提取工艺最大的影响因素是提取
温度，最小的是超声功率。
２．１０　方差分析　对表２的试验结果进行方差分析
和Ｆ检验结果见表３。Ｆ检验结果表明，提取温度、
溶剂浓度对黄酮提取率都具有显著的影响。
表３　方差分析
方差来源 离差平方和 自由度 方差 Ｆ Ｐ
Ａ ０００２１ ２ ０００１１ ００６０ 　
Ｂ ０１２３６ ２ ００６１８ ３３７７ 　
Ｃ ２１３９７ ２ １０６９９ ５８４６４ ＜００１
Ｄ ０３３５５ ２ ０１６７８ ９１６９ ＜００１
Ｅ（误差） ０３２８７ １８ ００１８３ 　 　
　　注：Ｆ００１（２，１８）＝６０１
２．１１　最佳工艺验证实验　在最佳提取条件下进行
３次重复实验，所提取的总黄酮质量分数平均值为
５２２８％，大于正交设计中的含量，所得结果正确。
且所得总黄酮含量高于２．７传统总黄酮提取方法及
含量测定中的结果。
３　讨论
本实验在最大吸收波长的选择上，是将芦丁对
照品、供试品溶液分别按标准品溶液的制备和标准
曲线绘制项下的方法制得后，于波长２００～８００ｎｍ
扫描，均可见在 ５１０ｎｍ处有最大吸收，因此选择
５１０ｎｍ作为芦丁和供试液测定的最大吸收波长。
结果表明提取温度和溶剂浓度对提取效果有极
显著的影响。分析原因认为适度增加温度有利于提
高溶剂的溶解度，但温度过高导致溶剂挥发而使溶
剂浓度减小。溶剂的浓度过高或过低都不易于连钱
草中总黄酮的溶出，而且采用低体积分数的乙醇作
为提取溶剂虽然成本较低又安全，但是提取液中含
有较多的蛋白质和糖类等易溶于水的成分，在存放
过程中易腐败变质，后续的过滤、浓缩和纯化等操作
困难费时。时间和功率因素对提取效果的影响不显
著，证明了超声提取的效率很高，短时间较低功率即
可实现比较完全的提取。
［参考文献］
［１］　中国药典［Ｓ］．一部．２０００：１３４．
［２］　杨念云，段金廒，李　萍，等．连钱草中的黄酮类化学成分［Ｊ］．
中国药科大学学报，２００５，３６（３）：２１０．
［３］　祝德秋，罗启剑，崔　岚，等．连钱草中总黄酮的含量测定［Ｊ］．
药学服务与研究，２００３，３（１）：６２．
［４］　黄齐慧，陈小英．不同采收期对连钱草中总黄酮的影响［Ｊ］．国
际医药卫生导报，２００４，１０（１８）：１６０．
ＣｉｒｃｕｌａｔｅｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｆｒｏｍＧｌｅｃｈｏｍａｌｏｎｇｉｔｕｂａ
ｂｙｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｗａｖｅ
ＹＵＡＮＣｈｕｎｌｉｎｇ，ＧＵＯＷｅｉｙｉｎｇ
（ＪｉｎｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｅｇｅ，Ｊｉｎｚｈｏｕ１２１００１，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｉｎＧｌｅｃｈｏｍａｌｏｎｇｉｔｕｂａｂｙｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ
ｗａｖｅ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｕｓｉｎｇｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｔｅｓｔ，ｔｈｅｅｆｅｃｔｓｏｆｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｐｏｗｅｒ，ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｔｉｍｅ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄｓｏｌｖｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｗｅｒｅｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ，ｔｈｅｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｗａｓｇｕｉｄｅｄｂｙｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔｈｅｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ．
Ｒｅｓｕｌｔ：Ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｏｎｄｉｔｉｏｎｗａｓａｓｆｏｌｏｗ：ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｐｏｗｅｒ；８００Ｗ，ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｔｉｍｅ９０ｍｉｎ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ４０℃，ｓｏｌｖｅｎｔ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ６５％．Ｔｈｅｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｃｏｎｃｅｎｔｉｓ５２２８％．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｕｓｉｎｇｅｔｈａｎｏｌａｓｓｏｌｖｅｎｔ，ｃｉｒｃｕｌａｔｅｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ
ｆｒｏｍＧ．ｌｏｎｇｉｔｕｂａｗｉｔｈｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｗａｖｅｉｓｆｅａｓｉｂｌｅｗｉｔｈｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｉｎｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｓｈｏｒｔｔｉｍｅａｎｄｈｉｇｈｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｙｉｅｌｄ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　Ｇｌｅｃｈｏｍａｌｏｎｇｉｔｕｂａ；ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｎｄｃｉｒｃｕｌａｔｅｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｔｅｓｔ
［责任编辑　鲍　雷］
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