全 文 ：含淫羊藿总黄酮大鼠血清对成骨细胞发育的影响
马慧萍１，贾正平１，陈克明２，张汝学１，李茂星１，王 娟１
（１．兰州军区 兰州总医院 药材科，甘肃 兰州 ７３００５０；
２．兰州军区 兰州总医院 骨科研究所，甘肃 兰州 ７３００５０）
［｀摘要］ 目的：研究含淫羊藿总黄酮大鼠血清对体外培养成骨细胞（ＲＯＢ）增殖和分化的影响。方法：将淫羊藿总黄酮
（ＴＦＥ）以０１，１，１０，１００μｇ·ｍＬ－１４种质量浓度、含淫羊藿总黄酮大鼠血清（ＳＲＡＴ）以２５％，５％，１０％３种质量浓
度分别加入新生大鼠颅骨成骨细胞培养液中，研究它们对细胞增殖和分化成熟的影响。细胞增殖采用 ＭＴＴ法进
行分析，细胞分化是于培养第４，８，１２，２０天分别检测碱性磷酸酶活性（比色法）、骨钙素分泌量（放射免疫法）、钙盐
沉积量（比色法）和矿化结节（组织化学法）等。结果：ＴＦＥ４种质量浓度均对 ＲＯＢ细胞增殖和分化无明显影响，
２５％和５％ ＳＲＡＴ则表现出强烈的刺激细胞增殖活性并显著提高碱性磷酸酶活性、骨钙素分泌量、矿化结节数和
钙盐沉积量。结论：淫羊藿总黄酮代谢产物强烈刺激成骨细胞的增殖并促进其分化成熟，说明淫羊藿总黄酮代谢
产物具有抗骨质疏松的活性。
［关键词］ 淫羊藿；黄酮；成骨细胞；分化；增殖
［中图分类号］Ｒ２８５．５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）０８０９２８０４
［收稿日期］ ２００７０５２０
［基金项目］ 全军“十五”规划重点项目（０１Ｚ００８）
［通讯作者］ 贾正平，Ｔｅｌ：（０９３１）８９７５４６０
淫羊藿是中医应用频率最高的中草药之一，李
青南等发现其水提液具有抗骨质疏松活性［１，２］。笔
者的研究证明，淫羊藿总黄酮（ｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｏｆＥｐｉ
ｍｅｄｉｕｍｓａｇｉｔａｔｕｍ，ＴＦＥ）可预防维甲酸诱导的大鼠
骨质疏松症［３５］，本实验研究了 ＴＦＥ对体外培养大
鼠成骨细胞增殖与分化成熟的影响。
１ 材料
１．１ 动物
出生４８ｈ以内的Ｗｉｓｔａｒ大鼠，购自甘肃中医学
院实验动物中心，合格证号ＳＣＸＫ（甘）２００４０００６。
１．２ 药物与试剂
淫羊藿总黄酮由本实验室按以前确定的方法提
取［３］，含量为５９３３％；胰酶、Ⅱ型胶原酶、噻唑蓝、
β磷酸甘油、维生素Ｃ（ＶｉｔＣ）均为Ｓｉｇｍａ公司产品；
ＤＭＥＭ培养基、胎牛血清为Ｇｉｂｃｏ公司产品；碱性磷
酸酶测定试剂盒（１０４ＬＬ）和钙含量试剂盒（５８７Ａ）
由Ｓｉｇｍａ公司生产；骨钙素放射免疫试剂盒由美国
Ｉｍｍｕｔｏｐｉｃｓ公司生产（ｒａｔｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎＩＲＭＡｋｉｔ）；ＢＣＡ
试剂盒为美国 ＰＩＥＲＣＥ公司产品；其余普通试剂均
为分析纯。
１．３ 仪器
ＣＯ２培养箱（美国 ｎｕａｉｒｅ）；酶标仪（ＢｉｏＲａｄ，
Ｍｏｄｅｌ５５０）；紫外可见分光光度计（ＨＰ８４５３，美
国）；放射免疫计数器（ＳＮ６８２，上海原子核研究
所）；各种培养皿均为美国康宁（Ｃｏｒｎｉｎｇ）公司产品。
２ 方法
２．１ 大鼠颅骨成骨细胞的培养
大鼠成骨细胞（ＲＯＢ）用酶解法从新生大鼠颅
骨获取［６］。１０只新生 Ｗｉｓｔａｒ大鼠采用颈椎脱位法
致死，置７５％乙醇中浸泡１０ｍｉｎ，揭去头顶皮肤，剥
出头盖骨，仔细去除附着的骨膜、血管等结缔组织，
ＰＢＳ（０１ｍｏｌ·Ｌ－１，ｐＨ７４）清洗２遍后，剪成约１
ｍｍ×１ｍｍ的小片。将小骨片转入５ｍＬ混合酶消
化液中（１ｍｇ·ｍＬ－１Ⅱ型胶原酶 ＋０５％胰蛋白
酶），３７℃振荡孵育２０ｍｉｎ，再转入１ｍｇ·ｍＬ－１单
纯Ⅱ型胶原酶中振荡消化６０ｍｉｎ，连续２次。合并
２次消化液，低速离心收集所释放的细胞。细胞悬
浮于含１０％胎牛血清、１００μｇ·ｍＬ－１链霉素、１００Ｕ
·ｍＬ－１青霉素的ＤＭＥＭ培养液中，计数并调整细胞
密度后种植于 １００ｍｍ×２０ｍｍ的培养器中（Ｃｏｒ
ｎｉｎｇ，ＵＳＡ），３７℃，５％ＣＯ２的饱和湿度条件下培养。
每４ｄ换一次新鲜培养液。待细胞长满皿底后用
０２５％胰蛋白酶消化悬浮，１∶４传代一次后进行试
验。
·８２９·
第３３卷第８期
２００８年４月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ ８
Ａｐｒｉｌ，２００８
２．２ 含ＴＦＥ大鼠血清（ＳＲＡＴ）的制备
２０只６月龄大鼠，雌雄各半，随机分为２组，一
组为服药组，按１ｇ·ｋｇ－１灌服ＴＦＥ，每天１次，连续
３ｄ。另一组为对照组，只灌服相同体积的溶解液
（载体溶液）。第３次灌胃１５ｈ后，所有大鼠均在
乙醚麻醉下自腹主动脉抽取血液，同组合并后离心
获取血清，血清在５６℃灭活３０ｍｉｎ，０２２μｍ滤膜
过滤除菌后备用。
２．３ 细胞增殖
原代培养的ＲＯＢ细胞按细胞密度２５×１０３个／
孔接种于９６孔培养板中，２４ｈ后换新鲜培养液，并
分别添加：①０，０１，１，１０，１００μｇ·ｍＬ－１的 ＴＦＥ，每
种质量浓度平行做 ６份；②２５％，５％，１０％的
ＳＲＡＴ，胎牛血清浓度同时降至 ５％，每种浓度设相
应对照组，即相同质量浓度的对照血清。４８ｈ后，
培养细胞用 ＰＢＳ洗１遍，每孔加１００μＬＤＭＥＭ培
养液，不含胎牛血清，同时加入１０μＬ０５％的噻唑
蓝，继续培养４ｈ后，弃培养液，加１００μＬＤＭＳＯ，在
酶标仪上测定波长５７０ｎｍ处的吸光度（Ａ）［７］。
２．４ 细胞分化
ＲＯＢ细胞密度按１×１０５个／孔 接种于６孔培养
板中，３ｄ后换含１０％胎牛血清、１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１β甘
油磷酸和５０μｇ·ｍＬ－１ＶｉｔＣ的 ＤＭＥＭ培养液，同
时添加：①０，０１，１，１０或１００μｇ·ｍＬ－１的 ＴＦＥ；②
５％ ＳＲＡＴ，胎牛血清浓度降至５％。所有浓度均平
行做３份，每４ｄ换 １次培养液及干预药物，不传
代，直至２０ｄ。于不同时间进行下列各项指标的检
测。
２．４．１ 碱性磷酸酶活性（ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，
ＡＬＰ） 根据 Ｃｈｅｎｇ等的方法改进［８］。于培养至第
４，８，１２，１６，２０天时，将待测各孔的培养细胞用胰蛋
白酶消化悬浮后收集至０５ｍＬＴｒｉｓ中（ｐＨ７４，含
０１％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００和２ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＭｇＣｌ２），用超声
细胞粉碎仪振荡处理，以使细胞膜破裂，离心，收集
上清液，ＡＬＰ活性用 Ｓｉｇｍａｋｉｔ１０４ＬＬ测定，活性单
位：ｎｍｏｌρｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ·ｍｉｎ－１ｍｇｐｒｏｔｅｉｎ－１，蛋白质
浓度用 ＢＣＡｐｒｏｔｅｉｎａｓｓａｙｋｉｔ测定。
２．４．２ 骨钙素 每次更换新鲜培养液时，将旧培养
液冻存于－３０℃，培养液中骨钙素浓度最后一次性
采用大鼠免疫放射分析试剂盒测定［９］。
２．４．３ 钙含量 将待测各孔培养液吸出后，用ＰＢＳ
洗２遍，加入１ｍｏｌ·Ｌ－１ＨＣｌ１ｍＬ振荡过夜，次日
以１万×ｇ离心１０ｍｉｎ，上清液中 Ｃａ２＋浓度用 Ｓｉｍａ
公司生产的专用试剂盒测定［１０］。
２．４．４ 矿化结节 培养至第２０天时用 ｖｏｎＫｏｓｓａ
染色法显示矿化结节。培养细胞先用 ＰＢＳ洗两遍，
然后用３７％甲醛９０％乙醇固定５ｍｉｎ。加入新鲜
配制的１％硝酸银后置紫外灯下照射３０ｍｉｎ。镜下
观察并照相记录矿化结节形成情况［１１］。
２．５ 统计学处理
试验结果以 珋ｘ±ｓ表示，采用 ＳＰＳＳ１００统计软
件进行ｔ检验。
３ 结果
３．１ 对细胞增殖的影响
ＴＦＥ加入培养液后，各质量浓度均对ＲＯＢ细胞
增殖无影响，但２５％ＳＲＡＴ的 Ａ５７０（０５４±００３）显
著高于对照组（０４４±００５，Ｐ＜００１），５％ＳＲＡＴ
的Ａ５７０（０７６±００４）与其对照组（０５５±００８）的差
别更为明显（Ｐ＜００１），说明这 ２种浓度的 ＳＲＡＴ
刺激细胞增殖。１０％ＳＲＡＴ引起培养细胞悬浮和死
亡，表明该浓度对细胞有一定毒性。
３．２ 对细胞分化的影响
３．２．１ 对ＡＬＰ活性的影响 ＴＦＥ各质量浓度均未
表现出明显的对 ＡＬＰ活性的影响。５％ＳＲＡＴ对
ＡＬＰ活性影响情况见表１。可见加入 ＳＲＡＴ后最早
在第４天即引起 ＡＬＰ活性的显著上升，到第１２，１６
天时分别达到对照组的２倍和３倍，至第２０天时
ＡＬＰ活性趋于下降。
３．２．２ 对骨钙素水平的影响 ＳＲＡＴ对 ＲＯＢ细胞
分泌骨钙素的影响情况见表２。从第４～８天开始，
ＳＲＡＴ组培养液中积累的骨钙素含量即显著高于对
照组，此后２组之间的差距持续增大。
表１ ＳＲＡＴ对不同时间ＲＯＢ细胞 ＡＬＰ活性的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３） ｎｍｏｌ·ｍｉｎ－１·ｍｇ－１
组别 剂量／％ ４ｄ ８ｄ １２ｄ １６ｄ ２０ｄ
ＳＲＡＴ ５ １３９３２±２１０２１） ２２９９８±２６２０２） ８０９４４±５８４５２） １９３０１３±１７７６１２） １２１０５１±１０６２２２）
对照 ５ ９６３６±９０４ １３４９３±１００１ ３１４１１±３０８２ ６３４６１±５０３７ ８３４７３±４００３
注：与对照组相比１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１（表２，３同）
·９２９·
第３３卷第８期
２００８年４月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ ８
Ａｐｒｉｌ，２００８
表２ ＳＲＡＴ对不同时间ＲＯＢ细胞培养液中骨钙素累积量的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３） ｎｇ·ｍＬ－１
组别 剂量／％ ４ｄ ８ｄ １２ｄ １６ｄ ２０ｄ
ＳＲＡＴ ５ ２３９±０５１ ９６６±１７１１） ２０３６±２２３１） ６６９６±５８１２） １５７４±１７５２２）
对照 ５ ２４１±０４５ ５５２±０８４ １３７２±２２９ ３４７７±５８１ ８８８５±７５２
３．２．３ 对钙沉积量的影响 ＳＲＡＴ对培养细胞钙
沉积量的影响见表３。可见从第８天起，ＳＲＡＴ组即
显著高于对照组，此后两组间差异愈来愈明显。
３．２．４ 对矿化结节的影响 随着成骨细胞分化成熟，
成骨细胞形成多层叠加的结节样结构，并不断分泌基
质和矿物质，称为矿化结节（ｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄｂｏｎｅｎｏｄｕｌａｒ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）。第２０天时，ＳＲＡＴ组的矿化结节数（２９７±
２９）显著多于其对照组（１５２±３５），Ｐ＜００１。
表３ ＳＲＡＴ对不同时间ＲＯＢ细胞钙盐沉积量的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３） μｇ／孔
组别 剂量／％ ４ｄ ８ｄ １２ｄ １６ｄ ２０ｄ
ＳＲＡＴ ５ ３２１±０５２ ８０４±０９２１） ３４７２±３４７１） １２０９０±１２８１２） ２４６９１±７３２２）
对照 ５ ３０７±０８０ ６２４±０６１ ２５２９±２５２ ６６９９±６６５ １２５３１±１１７０
４ 讨论
骨质疏松症是一种严重威胁中老年人健康的常
见病和多发病。淫羊藿是中医公认的强筋健骨药
材，但对其有效成分的研究尚不深入。本实验中，直
接加入培养液的ＴＦＥ对成骨细胞无明显影响，而其
含药血清强烈刺激成骨细胞的增殖，显著提高碱性
磷酸酶、骨钙素和钙盐沉积量等成骨性分化指标，根
据血清药理学原理，说明虽然 ＴＦＥ自身无效，但其
经口服后产生的代谢物却具有很好的促进成骨细胞
发育的作用。邱峰等人曾报道淫羊藿苷在大鼠体内
的代谢情况，发现淫羊藿苷经口服后至少产生４种
代谢产物，而淫羊藿苷的原形成分在胆汁和尿液中
几乎检测不到。据此得出结论，口服形式的淫羊藿
苷很可能是以其代谢产物发挥作用的［１２］。
本实验结果表明，淫羊藿总黄酮代谢产物应是
淫羊藿的抗骨质疏松活性之一，其作用机制是刺激
成骨细胞的增殖并促进分化成熟，从而增强骨形成
活动。这一结果显示出淫羊藿黄酮具有开发为抗骨
质疏松新药的良好前景。
［参考文献］
［１］ 李青南，吴 铁，谢 华，等．淫羊藿提取液对去睾丸大鼠骨
代谢的影响［Ｊ］．中草药，１９９３，２４（１２）：６３７．
［２］ 李青南，瘳进民，吴 铁，等．淫羊藿提取液防治激素所致大
鼠骨质疏松的实验研究［Ｊ］．中国药学杂志，１９９６，３１（８）：
６４７．
［３］ 马慧萍，贾正平，谢景文，等．淫羊藿总黄酮的提取分离工艺
研究［Ｊ］．华西药学杂志，２００２，１７（１）：１．
［４］ 马慧萍，贾正平，葛 欣，等．淫羊藿总黄酮抗大鼠实验性骨
质疏松作用研究［Ｊ］．华西药学杂志，２００２，１７（３）：１６３．
［５］ 马慧萍，贾正平，白孟海，等．淫羊藿总黄酮抗大鼠实验性骨
质疏松生化学指标的影响［Ｊ］．中国药理学通报，２００３，１９
（２）：１８７．
［６］ ＨｉｇｉｗａＨ，ＮａｒｕｓｅＭ，ＡｄａｃｈｉＣ，ｅｔａｌ．Ｉｐｒｉｆｌａｖｏｎｅｄｏｗｎｒｅｇｕ
ｌａｔｅｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｌｅｖｅｌｓｄｕｒｉｎｇｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｒａｔｃａｌｖａｒ
ｉａｌｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｌｉｋｅｃｅｌｓ［Ｊ］．ＪＢｉｏｃｈｅｍ，１９９９，１２６：１６８．
［７］ 王洪复．骨细胞图谱与骨细胞体外培养技术［Ｍ］．上海：上海
科学技术出版社，２００１：６３．
［８］ ＣｈｅｎｇＳＬ，ＹａｎｇＪＷ，ＲｉｆａｓＬ，ｅｔａｌ．Ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎ
ｍａｒｏｗｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｓｉｎｖｉｔｒｏ：ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｏｓｔｅｏ
ｂｌａｓｔｐｈｅｎｏｔｙｐｅｂｙｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ［Ｊ］．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１９９４，
１３４：２７７．
［９］ ＹａｍａｍｏｔｏＮ，ＦｕｒｕｙａＫ，ＨａｎｄａＫ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆ
ｔｈｅｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｐｈｅｎｏｔｙｐｅｄｕｒｉｎｇｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｏｓｔｅｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ
ｃｅｌｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｆｅｔａｌｒａｔｃａｌｖａｒｉａ：ｍｏｄｅｌｆｏｒｉｎｖｉｔｒｏｂｏｎｅｆｏｒｍａ
ｔｉｏｎ［Ｊ］．ＢｉｏｌＰｈａｒｍＢｕｌ，２００２，２５：５０９．
［１０］ ＪａｉｓｗａｌＮ，ＨａｙｎｅｗｏｒｔｈＳＥ，ＣａｐｌａｎＡＩ，ｅｔａｌ．Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｄｉｆ
ｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｐｕｒｉｆｉｅｄｃｕｌｔｕｒｅｅｘｐａｎｄｅｄｈｕｍａｎｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ
ｓｔｅｍｃｅｌｓｉｎｖｉｔｒｏ［Ｊ］．ＪＣｅｌｕａｒＢｉｏｃｈｅｍ，１９９８：２９５．
［１１］ 席 越，王戈平，黄啸原．骨组织病理解剖学技术［Ｍ］．北京：
人民卫生出版社，１９９７：６０．
［１２］ 邱 峰，陈英杰，鹿野美弘，等．淫羊藿甙在大鼠体内的代谢
［Ｊ］．药学学报，１９９９，３４（３）：２２２．
Ｅｆｅｃｔｓｏｆｒａｔｓｅｒｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｅｘｔｒａｃｔｏｆ
Ｅｐｉｍｅｄｉｕｍｓａｇｉｔａｔｕｍｏｎｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ
ＭＡＨｕｉｐｉｎｇ１，ＪＩＡＺｈｅｎｇｐｉｎｇ１，ＣＨＥＮＧＫｅｍｉｎｇ２，ＺＨＡＮＧＲｕｘｕｅ１，ＬＩＭａｏｘｉｎｇ，ＷＡＮＧＪｕａｎ１
·０３９·
第３３卷第８期
２００８年４月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ ８
Ａｐｒｉｌ，２００８
（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＬａｎｚｈｏｕＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，ＰＬＡ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００５０，Ｃｈｉｎａ；
２．ＩｍｓｔｉｔｕｔｅｏｆＯｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ，ＬａｎｚｈｏｕＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，ＰＬＡ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００５０，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｅｃｔｓｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｅｘｔｒａｃｔｏｆＥｐｉｍｅｄｉｕｍｓａｇｉｔａｔｕｍ（ＴＦＥ）ｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
ａｎｄｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｎｅｗｂｏｒｎｒａｔｃａｌｖａｒｉａｌｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ（ＲＯＢ）．Ｍｅｔｈｏｄ：ＴＦＥｗａｓｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｏｆＲＯＢａｔ
０１，１，１０ａｎｄ１００μｇ·ｍＬ－１ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｓｅｒｕｍｏｆｒａｔｓａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄＴＦＥＳ（ＳＲＡＴ）ｗａｓａｌｓｏａｄｄｅｄｉｎｔｏｔｈｅｍｅｄｉｕｍｉｎａｐａｒ
ａｌｅｌｔｒｅａｔｍｅｎｔａｔ２５％，５％ ａｎｄ１０％ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｉｒｅｆｅｃｔｓｏｎｃｅｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｗａｓｓｔｕｄｉｅｄｂｙＭＴＴａｎｄｔｈｅ
ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｍａｒｋｓ．Ｒｅｓｕｌｔ：ＴＦＥｈａｄｎｏａｐｐｒｅｃｉａｂｌｅａｎｄｏｎｃｅｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｔａｎｙｃｏｎｃｅｎ
ｔｒａｔｉｏｎ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，２５％ ａｎｄ５％ ＳＲＡＴｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｃｅｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｓｔｒｏｎｇｌｙａｎｄ，５％ ＳＲＡＴｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｐｒｏｍｏｔｅｄｔｈｅｍａｔｕｒａｔｉｏｎａｎｄ
ｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｂｙｉｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ，ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，ｃａｌｃｉｕｍｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｍｉｎ
ｅｒａｌｉｚｅｄｎｏｄｕｌａｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｅｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｏｆＴＦＥｓｈｏｕｌｄｂｅｔｈｅａｎｔｉｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＥｐｉｍｅｄｉｕｍｓａｇｉｔａｔｕｍ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｅｐｉｍｅｄｉｕｍｓａｇｉｔａｔｕｍ；ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ；ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
［责任编辑 古云侠］
［收稿日期］ ２００７０８２９
［通讯作者］ 吕秋军，Ｔｅｌ：（０１０）６６９３２２０１，Ｅｍａｉｌ：ｌｕｑｊ６６＠
ｙａｈｏｏ．ｃｏ
甘草苷对原代海马神经细胞的保护和营养作用
杨 云，卞广兴，吕秋军
（军事医学科学院 放射与辐射研究所，北京 １００８５０）
［摘要］ 目的：研究甘草苷（ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｎ，ＬＱ）对β淀粉样蛋白（Ａβ２５～３５）所致大鼠原代神经细胞损伤的保护作用
和营养作用。方法：采用大鼠原代海马神经元Ａβ２５～３５损伤模型，四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ）法测定细胞活力、流式细胞
术检测神经细胞凋亡、荧光探针法检测细胞内钙离子浓度，考察 ＬＱ神经保护作用；通过考察 ＬＱ诱导海马神经元
轴突延长的作用和流式细胞术检测其对海马神经干细胞分化为胆碱能神经元作用观察其神经营养作用。结果：１０
μｍｏｌ·Ｌ－１Ａβ２５～３５显著降低细胞的存活率；明显升高细胞内钙离子水平；诱导细胞凋亡发生，凋亡率达２８％。预先
给预０１，１，１０μｍｏｌ·Ｌ－１浓度的ＬＱ处理细胞６ｈ，可显著抑制Ａβ２５～３５导致的细胞死亡，能够明显降低Ａβ２５～３５导致
的细胞内钙离子浓度升高，流式细胞检测凋亡率分别降低到１０％，１５％ ，２２％，提示 ＬＱ能够拮抗 Ａβ２５～３５导致的细
胞凋亡。ＬＱ能够显著增加神经生长因子（ＮＧＦ）介导的海马神经元轴突延长，特异性的促分裂原活化蛋白激酶
（ＭＡＰＫ）抑制剂能够部分阻断该作用。另外，ＬＱ可以诱导神经干细胞体外定向分化为胆碱能神经元。结论：甘草
苷对Ａβ２５～３５导致的大鼠原代神经细胞损伤具有神经保护作用，同时甘草苷对原代海马神经元有营养作用。
［关键词］ 甘草苷；海马神经元；凋亡；轴突；海马神经干细胞；Ａβ２５～３５
［中图分类号］Ｒ２８５．５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）０８０９３１０５
甘草苷（ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｎ，ＬＱ）是甘草的主要有效成分
之一，属于以２苯基色原酮（２ｐｈｅｎｙｌｃｈｒｏｍｏｎｅ）为
母核的二氢黄酮类化合物，其分子式为 Ｃ２１Ｈ２２Ｏ９。
文献报道，甘草苷药效显著，具有抗溃疡、抗病毒、抗
抑郁等作用［１３］。目前对甘草苷的神经保护及营养
作用报道很少，本研究就此进行初步的考察。
１ 材料
１．１ 药物和试剂
甘草苷（中国药品生物制品检定所，批号
２００６０４，纯度＞９８５％）；β淀粉样蛋白（Ａβ２５～３５）、多
聚Ｌ赖氨酸氢溴化物、ＰＤ９８０５９（Ｓｉｇｍａ公司）；四甲
基偶氮唑盐（ＭＴＴ，Ｆｌｕｋａ公司）；解剖液（ｍｍｏｌ·
Ｌ－１：葡萄糖１５１，蔗糖２１９，ＮａＣｌ１３６９，ＫＣｌ５４，
Ｎａ２ＨＰＯ４·７Ｈ２Ｏ０７，ＫＨ２ＰＯ４０２，ｐＨ７２～７４）；
阿糖胞苷（法玛西亚普强公司）；神经生长因子
（ＮＧＦ，北京圣日公司）；Ｎ２，Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ）；碱性成纤维
细胞生长因子（ｂＦＧＦ，ＰｅｐｒｏＴｅｃｋ公司）；细胞外液
·１３９·
第３３卷第８期
２００８年４月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
Ｖｏｌ．３３，Ｉｓｓｕｅ ８
Ａｐｒｉｌ，２００８