全 文 ：钩藤总碱预处理对海马神经元急性缺氧的保护作用
刘 卫t 3 o张兆芹t o赵晓民u o高允生u
kt1 解放军第 {{医院 o山东 泰安 uztsss ~u1 泰山医学院 o山东 泰安 uztsssl
≈摘要  目的 }观察钩藤总碱预处理对急性缺氧后海马神经元电压门控性 ‘¤n电流的影响 ∀方法 }原代培养
大鼠海马神经元 o分为常氧 !急性缺氧和钩藤总碱预处理进行实验 ∀采用膜片钳全细胞记录技术 o检测海马神经元
钠电流kŒ‘¤l的变化 ∀结果 }急性缺氧后 o细胞 Œ‘¤幅度明显降低 oŒ‘¤阈值右移 ~而经钩藤总碱预处理的海马神经元 Œ‘¤
的降低幅度明显减轻 ∀结论 }钩藤总碱预处理提高了海马神经元对急性缺氧的耐受性 o对神经元有显著保护作用 ∀
≈关键词  钩藤 ~缺氧 ~海马神经元 ~膜片钳
≈中图分类号  • u{x1x ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussyls|2szyv2sv
≈收稿日期  ussx2sy2sv
≈通讯作者  3刘卫 oר¯ }ksxv{l{yutx|sx oƒ¤¬}ksxv{l{yus|yty o
∞2°¤¬¯ }¯¬∏·µ∏±®ƒ ¼¤«²²q¦²°
钩藤总碱是钩藤碱和异钩藤碱的混合物 o是中
药钩藤的主要成分 ∀临床上 o钩藤用于对抗惊厥和
治疗高血压 o但钩藤是否能保护惊厥或高血压引起
的靶器官损伤并不明确 ∀已知缺氧是惊厥或高血压
导致靶器官损伤的原因之一 ∀因此 o低氧感受及其
信号转导机制的研究日益受到重视 ∀有研究表明 o
细胞对缺氧环境的适应主要依赖于其内在的低氧信
号传导通路的调控 ∀缺氧诱导因子被证明在这一传
导通路中起关键性的作用≈t  o不仅低氧预适应可以
使其细胞水平增高 o有些化学物质也可以通过激活
细胞中的氧感受器使缺氧诱导因子在细胞内聚集 o
从而增强细胞的抗缺氧能力≈u2w  o可见人为干预这一
通路能改善细胞缺氧状态 ∀已知缺氧导致细胞钠 !
钾通道功能异常 o是造成细胞损伤的重要原因之一 o
采用原代培养的海马神经元 o用膜片钳全细胞记录
的方法 o观察了钩藤总碱预处理对海马神经元急性
缺氧后电压门控性 ‘¤n电流的影响 ∀
1 材料和方法
111 药品和试剂 钩藤总碱k沈阳药科大学l o
⁄∞k高糖型 o≥¬ª°¤l o‹∞°∞≥k≥¬ª°¤l o∞Š×„k≥¬ª2
°¤l o马血清 k ‹¼¦¯²±¨ l o胎牛血清 k ‹¼¦¯²±¨ l o‘2u
kŠ¬¥¦²¯ l o…2uzkŠ¬¥¦²¯ l o胰蛋白酶k新疆生化研究
所l oΛ2多聚赖氨酸k • txs sss ∗ vss sss o≥¬ª°¤l o
谷氨酰胺k≥¬ª°¤l o阿糖胞苷k≥¬ª°¤l ∀
112 海马神经元的培养基 用于接种海马神经元
的培养基k种植液l成分为 }⁄∞ 培养基约 {s h o
马血清 ts h o胎牛血清 ts h o谷氨酰胺微量 ∀用于
饲养海马神经元的培养基k饲养液l成分为 }⁄∞
培养基约 {z h o马血清 ts h o‘2u t h o…2uz u h o谷
氨酰胺微量 ∀
113 海马神经元的分散和培养 取当天新生的
•¬¶·¤µ大鼠 o剥离出海马剪成 t ∗ u °°的组织块 o用
含 s1ux h胰蛋白酶的解剖液在 vz ε 下消化 vs °¬±o
吹打 o使之均匀分散 o制成细胞悬液 ∀加入适量种植
液 o将细胞按 t ≅ tsx#°pt接种在事先涂有多聚赖
氨酸的 vx °°培养皿中 o置于 vy ε ts h ≤’u的培养
箱中 ouw «后将种植液换为 u °饲养液k空白l ∀以
后每 zu «半量换液 t次 o培养细胞在 tu ∗ tx §期间
用于膜片钳实验 ∀用于实验前 uw «换钩藤总碱剂
量为 t1s ≅ tsp y ots1s ≅ tsp y的饲养液作为预处理
实验组 ∀为抑制非神经元过度增殖 o在培养的第 v
天向培养基中加入阿糖胞苷 v Λª#°pt ∀
114 细胞急性缺氧 将培养的神经元置 vy ε 含
ts h ≤’u和 |s h ‘u的密封容器中急性缺氧 w «后置
vy ε ts h ≤’u的培养箱中复氧 w «∀
115 全细胞记录和电压门控性 ‘¤n oŽn电流≈x 
膜片钳记录装置由放大器k„¬²³¤·¦«t p ⁄o„¬²± Œ±2
¶·µ∏°¨ ±·o美国l !示波器k× ®¨·µ²±¬¬oxttt„ o荷兰l !„⁄
转换板ktuss ¶¨µ¬¨¶o„¬²± Œ±¶·µ∏°¨ ±·l !电极探头k≤∂
p w o„¬²± Œ±¶·µ∏°¨ ±·l !微操纵仪k²p usv o‘¤µ¬¶«¬ª¨ o
日本l !倒置相差显微镜k’¯ ¼°³∏¶Œ× p u o日本l !计
算机和 ³≤¯ ¤°³软件kz1s 版 o„¬²± Œ±¶·µ∏°¨ ±·l等组
成 ∀将细胞浸入人工细胞外液中 o在倒置相差显微
#vyz#
第 vt卷第 |期
ussy年 x月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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镜下用充满人工细胞内液的玻璃微电极轻轻压向细
胞表面 o形成紧密封接 o建立细胞贴附式记录 o在此
基础上继续施加负压或用 t1x ∂ x ∗ ts °¶的短时脉
冲击破细胞膜 o使细胞内环境与电极相通 o形成全细
胞记录 ∀把细胞膜电位钳制在 p zs °∂ o用脉冲去极
化刺激诱发电压门控性 ‘¤n oŽn电流 ∀
116 数据分析 以海马神经元 ‘¤n电流幅度为指
标 o用 ≤¯ ¤°³¨ ¬z1s软件记录电信号 o用 ≤¯ ¤°³©¬·z1s
测量电流幅度 o数据以 „≥≤ŒŒ码输出到 ’µ¬ª¬± y1s进
行作图k图 tl ∀统计资料以 cξ ? σ表示 o用单因素方
差分析比较各实验组间电流幅度的差异 ∀
图 t 海马神经元 ‘¤n oŽn电流的全细胞记录
„1 阶刺激 ~…1 空白对照 ~≤1急性缺氧 ~
⁄1 钩藤总碱预处理后经急性缺氧
2 结果
211 细胞急性缺氧对海马神经元 ‘¤n oŽn电流的
影响 把细胞膜钳制在 p zs °∂ o给细胞膜一系列步
阶为 ts °∂ 的脉冲去极化刺激 o直到 n ws °∂ o由图
t可见 o海马神经元缺氧前有明显的 ‘¤n oŽn电流 o
其中 oŽn电流有 u种成分 o分别为瞬时外向 Žn电流
kΙ·²l和外向整流 Žn电流k Ɏl ∀经急性缺氧后 o海
马神经元的 ‘¤n电流k Ι‘¤l急剧减小甚至消失 ∀分
别观察 v个培养皿中的 tu例细胞 o取电流幅度的平
均值作 Ι2ς曲线 ∀结果表明 o急性缺氧后 Ɏ的激活
阈值由 p ws °∂ 变为 p us °∂ o但幅度变化不显著 ∀
Ι‘¤的激活阈值由缺氧前的 p ws °∂ 变为急性缺氧后
的 p vs °∂ o并且 Ι‘¤幅度的减小有极显著意义k Π
s1stlk图 ul ∀
212 钩藤总碱预处理对急性缺氧海马神经元 Ι‘¤的
保护作用 取钩藤总碱预处理的海马神经元 o把细
胞膜钳制在 p zs °∂ o给细胞膜一系列步阶为 ts °∂
的脉冲去极化刺激 o直到 n ws °∂ o观察其 ‘¤n电流 o
结果表明 o不管是否用钩藤总碱预处理 o在急性缺氧
前k对照组l o海马神经元 Ι‘¤在阈值处的幅度都很接
近 o无显著性差异k表 tl ~经急性缺氧处理 o用相同

图 u 钩藤总碱预处理处理对海马神经元 Ι‘¤的作用
方法观察 ‘¤n oŽn电流 o结果表明 o用钩藤总碱预处
理的海马神经元的 Ι‘¤在阈值处幅度与急性缺氧前
k对照组l比较无显著性差异 ~与急性缺氧后的空白
海马神经元k钩藤总碱零剂量组l比较 o钩藤总碱预
处理的海马神经元的 Ι‘¤在阈值处幅度的增加有显
著意义k Π s1sxl o并且随着剂量增加 oΙ‘¤的增加幅
度也更加明显 o呈量效依赖关系k表 tl ∀但 Ι‘¤的激
活阈值仍为 p vs °∂ ∀
表 t 钩藤总碱对海马神经元 ‘¤n电流
幅度的影响kcξ ? σ, ν € tul ±„
组别 钩藤总碱预处理s t qs ≅ tsp y ts qs ≅ tsp y
对照 p z q| ? s qw p z qu ? s qz p { qt ? s qy
急性缺氧 p v qux ? t qstl p w qt ? t qt p z qz ? s q|ul
注 }与对照组比较tl Π s1st ;与 p v .ux ? t .s比较u) Π s1sx
结果表明 o缺氧后 ‘¤n电流阈值提高 o可见海马
神经元钠钾通道激活阈值因缺氧向超级化方向移
动 o致使细胞兴奋性降低 ∀并且 o细胞 Ι‘¤幅度明显
降低 o表明细胞活性降低 ∀钩藤总碱预处理可抑制
因缺氧导致的 Ι‘¤电流幅度降低 o说明钩藤总碱预处
理对海马神经元钠通道具有保护作用 ∀
3 讨论
对单个细胞而言 o能量消耗的大部分被用于维
持细胞内外的离子平衡和电活动 o‘¤n电流是兴奋
细胞去极化的主要离子流 o它激活快 !失活快 o易受
多种因素影响 o如缺血 !缺氧 ∀钠离子通道电导与能
量的消耗密切相关 ∀常氧下 o能量消耗主要用于蛋
白质合成与降解 !钠泵 !尿素和葡萄糖生物合成 ∀缺
氧条件下 o其他耗能大幅度降低 o钠泵成为细胞的主
要能耗 o占细胞 „×°需求的 zx h ≈x  ∀实验中观察
到 o急性缺氧后 o与对照组相比 o钠电流阈电位升高 o
幅度降低 o表明细胞兴奋性和活性降低 o而经钩藤总
碱预处理的神经元 o其钠电流降低幅度明显低于急
性缺氧组 o说明钩藤总碱预处理具有维持钠通道活
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性的作用 ∀
器官的功能依赖于组成器官的细胞的活性 o钠 !
钾离子电流是衡量细胞活性的电生理学指标 o钩藤
总碱能维持缺氧时神经元的钠电流表明钩藤总碱能
保护缺氧靶器官免于损伤 ∀有研究表明 o钩藤总碱
有钙拮抗作用 o在低氧发生时 o灭活钠通道 !降低神
经元的兴奋性 o激活 „×°钾kŽ„×°l通道及一些细胞
保护蛋白的表达都是机体的适应性反应≈y  ∀ ≤¤u n是
多种生理过程的参与者 o细胞耗氧的增加与 ≤¤u n内
流增加有关 ∀本实验中 o钩藤总碱预处理使海马神
经元事先发生适应性反应 o对随后严重的急性缺氧
损伤产生有效的保护作用 o但是否源于钩藤总碱所
具有钙拮抗机制 o尚不清楚 ∀此外 o一些钾通道 o如
Ž„×°通道属于内向整流性钾通道家族 o生理情况下
处于关闭状态 o只有在缺血r缺氧 !„×°耗竭情况下
才开放≈z  ∀缺氧早期 oŽ„×°通道的开放 o可以引起细
胞超极化和兴奋性降低 o减少细胞外 ≤¤u n大量内流
和 „×° 消耗 o有利于防止细胞兴奋性损伤 o提示
Ž„×°的开放在缺血r缺氧预适应中具有重要作用≈{  ∀
有研究称 o钩藤碱对心肌细胞 Ι·²和 Ɏ都有抑制作
用 o这被认为是钩藤碱抗心律失常的作用机制 ∀细
胞兴奋产生 Ι·²和 Ɏ是耗能过程 o因而推测钩藤碱
的这一作用也可降低细胞耗氧 o对缺氧靶器官产生
有利作用 ∀
≈参考文献 
≈t  ≥ ±¨° ±¨½¤ Š o • ¤±ªŠ q„ ±∏¦¯ ¤¨µ©¤¦·²µ¬±§∏¦¨§¥¼ «¼³²¬¬¤√¬¤§¨
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≈u  Ž«¤¯¨´ ∏½ ¤°¤±o ‹²²± •¼∏o⁄¤√¬§ ‹¤¯¯o ετ αλ. °µ²·¨¦·¬²± ©µ²° ²¬2
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¬¨³µ¨¶¶¬²± ¤±§«¼³²¬¬¤2¬±§∏¦¬¥¯¨©¤¦·²µ2t ⁄‘„ ¥¬±§¬±ª¤¦·¬√¬·¼}¬°³¯¬2
¦¤·¬²±¶©²µ°²§¨ ¶¯²© «¼³²¬¬¤ ¶¬ª±¤¯ ·µ¤±¶§∏¦·¬²±q Βλοοδ , t||v o{u }
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≈w  ≥ °¨ ±¨½¤ Š o•²·«° ‹ o…∏±± ‹ ƒ oετ αλ. ×µ¤±¶¦µ¬³·¬²±¤¯ µ¨ª∏¯¤·¬²±²©
ª¨ ±¨ ¶ ±¨¦²§¬±ªª¯¼¦²¯¼·¬¦ ±¨½¼° ¶¨¥¼ «¼³²¬¬¤2¬±§∏¦¬¥¯¨©¤¦·²µ2t q ϑ Βι2
ολ Χηεµ , t||w ouy| }uvzxz q
≈x  吴丽颖 o刘 卫 o范 明 o等 q • ¨¯¤·¬²±¶«¬³ ¥¨·º¨¨ ± ±¨«¤±¦¨§
¤±²¬¬¦·²¯ µ¨¤±¦¨ ¬±§∏¦¨§¥¼ «¼³²¬¬¦³µ¨¦²±§¬·¬²±¬±ª¤±§‘¤n oŽn ¦∏µ2
µ¨±·¶¬± ¦∏¯·∏µ¨§«¼³²·«¤¯¤°¬¦¦¨¯¯¶q中国应用生理学杂志 oussu o
t{ktl }vs q
≈y  „°²µ²¶² ≥ o≥¦«°¬§„±·²°¤µ¦«¬‹ oƒ²¶¶¨· o ετ αλq Š¯ ∏¦²¶¨ o¶∏¯©²±¼2
∏¯µ¨¤¶o¤±§ ±¨ ∏µ²·µ¤±¶°¬·¨µµ¨¯¨ ¤¶¨ }µ²¯¨ ²© „×°2¶¨±¶¬·¬√¨ Žn ¦«¤±2
±¨ ¶¯q Σχιενχε , t||s ouwzkw|wwl }{xu q
≈z  彭 军 o李元建 q„×°敏感钾通道与缺血预适应 1 中国药理学
通报 ousss oty kul }twt
≈{  吕国蔚 q„×°敏感的钾通道及其在缺氧预适应中的作用 q中国
神经解剖学杂志 ot||| otxkul }ust q
Προτεχτιϖε εφφεχτ οφ Υνχαρια ρηψνχηοπηψλλα τοταλ αλκαλοιδσ πρετρεατµεντ ον
ηιπποχαµ παλ νευρονσ αφτερ αχυτε ηψποξια
Œ˜ • ¬¨t o‹„‘Š «¤²2 ¬´±t o‹„’ ÷¬¤²2°¬±u oŠ„’ ≠∏±2¶«¨ ±ªu
(t . Τηε {{τη Ηοσπιταλ οφ ΠΛΑ, Ται. αν uztsss , Χηινα ; u . Ταισηαν Μεδιχαλ Χολλεγε , Ται. αν uztsss , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ײ¬±√ ¶¨·¬ª¤·¨·«¨ ©¨©¨¦·²© Υνχαριαρηψνχηοπηψλλα·²·¤¯ ¤¯®¤¯²¬§¶k• ׄl ³µ¨·µ¨¤·° ±¨·²±·«¨ √²¯·¤ª¨2ª¤·¨§¶²§¬2
∏° ¦∏µµ¨±·¶²©·«¨ µ¤·«¬³³²¦¤°³¤¯ ±¨ ∏µ²±¶¤©·¨µ¤¦∏·¨ «¼³²¬¬¤q Μετηοδ : °µ¬°¤µ¼ ¦∏¯·∏µ¨§«¬³³²¦¤°³¤¯ ±¨ ∏µ²±¶º µ¨¨ §¬√¬§¨§¬±·² • ׄ ³µ¨2
·µ¨¤·¨§¤±§ ±²±2³µ¨·µ¨¤·¨§ªµ²∏³¶q °¤·¦« ¦¯¤°³ º«²¯ 2¨¦¨¯¯ µ¨¦²µ§¬±ª º¤¶∏¶¨§·² ¦²°³¤µ¨ ·«¨ √²¯·¤ª¨2ª¤·¨§¶²§¬∏° ¦∏µµ¨±·¤°³¯¬·∏§¨ ¤±§
·«µ¨¶«²¯§º¬·«·«²¶¨ ¥¨©²µ¨ «¼³²¬¬¤q Ρεσυλτ : „©·¨µ¤¦∏·¨ «¼³²¬¬¤o¶²§¬∏° ¦∏µµ¨±·¤°³¯¬·∏§¨ º¤¶¶¬ª±¬©¬¦¤±·¯¼ §¨¦µ¨¤¶¨§¤±§¬·¶·«µ¨¶«²¯§ º¤¶
∏³¶¬§¨ q• ׄ ³µ¨·µ¨¤·° ±¨·¦²∏¯§¬±«¬¥¬··«¨ µ¨§∏¦·¬²± ²©¶²§¬∏° ¦∏µµ¨±·¤°³¯¬·∏§¨ qΧονχλυσιον : • ׄ ³µ¨·µ¨¤·° ±¨·¤¯¯¨ √¬¤·¨¶·«¨ ¤¦∏·¨ «¼³²¬¬¤2
¬±§∏¦¨§¦«¤±ª¨ ²©¶²§¬∏° ¦∏µµ¨±·¶oº«¬¦« °¤¼ ¥¨ ²±¨ ²©·«¨ ° ¦¨«¤±¬¶°¶©²µ³µ²·¨¦·¬√¨ ©¨©¨¦·²© • ׄ ²± ¦¨¯¯¶q
[ Κεψ ωορδσ] Υνχαρια ρηψνχηοπηψλλα ~«¼³²¬¬¤~«¬³³²¦¤°³¤¯ ±¨ ∏µ²±¶~³¤·¦«¦¯¤°³
≈责任编辑 方文贤 
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