全 文 :环维黄杨星 2⁄对大鼠局灶性脑缺血
再灌注损伤的影响
俞 浩 tou3 o刘汉珍 t o周国梁 t
ktq安徽科技学院 o安徽 蚌埠 uvvtss~uq广州中医药大学 临床药理研究所 o广东 广州 xtswsxl
≈摘要 目的 }观察环维黄杨星 2⁄k≤∂
2⁄l对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用 o并探讨其作用机制 ∀
方法 }取大鼠 tus只 o随机分为 y组 o即 ≤∂
2⁄高 !中 !低剂量组 kuotosqx °ª# ®ªpt lo尼莫地平组 ku °ª# ®ªpt lo模
型对照组和假手术组 o每组 us只 ∀采用线栓法建立大鼠大脑中动脉阻断再灌注模型 o观察 ≤∂
2⁄对模型大鼠神经
损伤症状 !脑梗死范围 !脑组织超氧化物岐化酶 k≥⁄l活性 !丙二醛 k ⁄l含量 !脑细胞内钙离子 k≤¤u n l浓度及脑
组织病理变化的影响 ∀结果 }≤∂
2⁄高 !中剂量能显著改善局灶性脑缺血大鼠神经症状 o提高脑组织 ≥⁄活性 ~
≤∂
2⁄高剂量能降低脑组织梗死范围 ! ⁄含量及脑细胞内 ≤¤u n浓度 ~≤∂
2⁄各剂量组均能减轻脑组织病理变
化 ∀结论 }≤∂
2⁄对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤具有保护作用 ∀
≈关键词 环维黄杨星 2⁄~脑缺血再灌注 ~脂质过氧化 ~钙离子
≈中图分类号 u{xqx ≈文献标识码 ≈文章编号 tsst2xvsukusszlsz2syuv2sw
≈收稿日期 ussy2s{2us
≈通讯作者 3 俞浩 o ר¯} ksusl vyx{zvtwo∞2°¤¬¯} ¼∏¦«¨ ±ª2
½¬tuvs tyvq¦²°
环维黄杨星 2⁄k≤∂
2⁄l系从黄杨科植物小叶
黄杨 Βυξυσµ ιχροπηψλλα ≥¬¨¥q ·¨∏¦¦q √¤µq σινιχα 2¨
«§q ·¨• ¬¯¶q及其同属植物中提取的一种生物碱 ∀
药理研究表明 o≤∂
2⁄对小鼠急性脑缺血具有保护
作用 ≈t o并能减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损
伤 ≈uov ∀体外实验也证明 o≤∂
2⁄能减轻体外缺氧
培养及兴奋性氨基酸毒性作用所致的神经元损伤 o
对神经元具有保护作用 ≈w ∀本试验主要观察 ≤∂
2
⁄对脑缺血再灌注损伤的作用及作用机制 o为临床
防治脑血管疾病提供理论依据 ∀
1 材料
1q1 动物
雄性 ≥⁄大鼠 o体重 kvts ? usl ªo由河南医科大
学实验动物中心提供 o合格证号 }豫医动字第
wtsttz号 ∀
1q2 药品与试剂
≤∂
2⁄o江苏省东台市神天化工厂 o批号
svtusv∀尼莫地平 o天津市中央药业有限公司生产 o
批号 svtuus∀ uovox2氯化三苯基四氮唑 k××≤ lo分
析纯 o上海医药集团上海化学试剂公司 ∀ ≥⁄o ⁄
试剂盒 o南京建成生物工程研究所 o批号分别为
ussvtuu{oussvtuvs∀ ƒ∏µ¤2ur o≥¬ª°¤公司 ∀
1q3 主要仪器
电子分析天平 o上海精科分析仪器厂 ∀ ÷p
低速大容量离心机 o上海安亭科学仪器厂 ∀ zxw
紫外可见分光光度计 o上海第三分析仪器厂 ∀ ƒ p
usss型荧光分光光度计 o日本 ×≤公司 ∀
2 方法
2q1 动物分组与给药
取大鼠 tus只 o随机分为 y组 o即 ≤∂
2⁄高 !
中 !低剂量组 kuotosqx °ª# ®ªpt lo尼莫地平组 ku
°ª# ®ªpt lo模型对照组和假手术组 o每组 us只 ∀
其中 ts只大鼠用于测定脑组织梗死范围和病理组
织学检查 o另外 ts只用于测定脑组织 ≥⁄活性 !
⁄含量及脑细胞内钙离子浓度 ∀灌胃给药 o每日
t次 o连续 x §o灌胃容量均为 ts °# ®ªpt体重 ∀模
型对照组和假手术组给等容量的生理盐水 ∀
2q2 模型制作
末次给药后 o参照文献方法 ≈xoy o并加以改进制
备大鼠大脑中动脉阻断再灌注模型 ∀用 tsh水合氯
醛 kvxs °ª# ®ªpt l腹腔注射麻醉大鼠 o仰卧固定 o常
规消毒皮肤 o颈部正中切开 o钝性分离右侧颈总动脉 !
颈外动脉和颈内动脉 ∀沿颈内动脉向下分离出翼腭
动脉 o并结扎 ∀用动脉夹夹闭颈总动脉 o于颈外动脉
上 k近颈总动脉分叉处 l剪一切口 o将一端烫圆的鱼线
#vuy#
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ussz年 w月
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Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯qvuo ¶¶∏¨ z
³µ¬¯o ussz
沿颈外动脉缓慢插入至大脑中动脉起始端 o略感阻力
时停止 o插入长度约 kt{ ? s1xl °°o结扎固定鱼线 ∀
阻断中动脉后 u «o轻轻拔出鱼线至颈外动脉处 o使大
脑中动脉恢复供血 o再灌注 uw «∀缝合肌肉皮肤 o回
笼饲养 ∀整个手术过程要避免损伤迷走神经 ∀假手
术组大鼠分离右侧颈外动脉 !颈内动脉及翼腭动脉 o
结扎颈内动脉及翼腭动脉 o但不插鱼线阻断大脑中动
脉 ∀手术及再灌注期间死亡大鼠不计入实验 ∀
2q3 观察指标
2q3q1 神经损伤症状评分 参照文献方法 ≈zo{ o
按受损程度拟定神经损伤症状评分等级 ∀ ´级 }无
神经损伤症状 ~µ级 }不能完全伸展左侧前爪 ~¶级 }
不能完全伸展左侧前爪 o向左侧转圈 ~·级 }不能完
全伸展左侧前爪 o向左侧倾倒 ~∏级 }不能自发行走 o
意识丧失 ∀按上述标准 o分别于再灌注后 xouw «采
用单盲法对各组大鼠进行神经损伤症状评分 ∀
2q3q2 脑梗死范围测定及病理组织学检查 末次评分
后断头取脑 o剔除软脑膜及脑表面血管 o生理盐水洗
净 o滤纸吸去水分 o放 pus ε 冰箱预冻 ts °¬±o然后将
大脑沿冠状面切成厚约 x °°的组织片 ∀留取第二组
织片 o以 tsh的甲醛固定 o石蜡包埋切片 o乙醇逐级脱
水 o∞染色 o光镜观察大鼠缺血侧脑组织病理变化 ∀
将其余组织片置 th ××≤磷酸盐染色液中 vz ε 避光
温孵 ts °¬±o洗去染色液 o再用 tsh甲醛溶液固定 uw
«o切取梗死区称重 o以 /重量求面积法 0计算梗死范围 ∀
梗死范围 kh l 梗死区重 r全脑重 ≅ tssh
2q3q3 脑组织 ≥⁄活性及 ⁄含量测定 末次
评分后 o大鼠断头取脑 o剔除软脑膜及脑表面血管 o
生理盐水洗净 o滤纸吸去水分 o称取缺血侧脑组织 o
加 tsh的生理盐水匀浆 ov yss µ# °¬±pt离心 ts
°¬±o取上清 k所有操作均在冰浴中进行 o生理盐水
使用前于 w ε 冰箱中预冷 l∀按试剂盒说明书操作
方法 o比色法测定脑组织 ≥⁄活性及 ⁄含量 ∀
2q3q4 脑细胞悬液的制备及细胞内游离 ≤¤u n的测
定 参考文献方法 ≈y o末次评分后 o大鼠断头取
脑 o剔除软脑膜及表面血管 o称取缺血侧脑组织 o
¤±®¶液冲洗 o剪碎后加入胰蛋白酶消化 ovz ε 轻
摇振荡 us °¬±o冰 ⁄ ∞ k含 tsh小牛血清 l培养液
中止消化 o过 uss目筛网 o滤液 t xss µ# °¬±pt离心
x °¬±o再用 ¤±®¶液洗 t次 o最后用 ⁄ ∞ k含 tsh
小牛血清 l培养液调整细胞数为 u ≅ ts|个 ro台盼
蓝染色 o细胞成活率在 |xh以上 ∀将上述调整细胞
数后的细胞悬液 o加入终浓度为 x Λ°²¯# pt的 ƒ∏2
µ¤2ur ovz ε 恒温振荡 ws °¬±ot sss µ# °¬±pt离
心 x °¬±o最后调整细胞数 u ≅ ts|个 ro将悬液分数
管 ∀调节激发光光栅 x ±°o发射光光栅 ts ±°o在
vss ∗ wus ±°扫描激发光光谱 o峰值在 vwx ±°o说明
ƒ∏µ¤2u已负载入细胞 ∀加入终浓度为 s1th 的
×µ¬·²±2tss测得最大荧光强度 kΦ°¤¬l~加入终浓度为
v倍 ≤¤u n浓度的乙二醇四乙酸 k³ {1xl测得最小
荧光强度 kΦ°¬± l∀测定未负载 ƒ∏µ¤2ur脑细胞的
荧光值 o消除细胞自发荧光的影响 ∀根据公式计算
细胞内游离 ≤¤u n浓度 ∀
≈≤¤u n §≅ kΦ p Φ°¬± l rkΦ°¤¬ p Φl
2q4 结果统计与处理
数据采用 cξ ? σ表示 o多组间均数比较采用单因
素方差分析 o等级资料统计采用 ¬§¬·检验 o数据统
计采用 ≥°≥≥ tt1s软件处理 ∀
3 结果
3q1 对神经损伤症状的影响
由表 t可知 o再灌后 x «o≤∂
2⁄高 !中剂量组
大鼠神经损伤症状显著减轻 o与模型对照组比较有
显著性差异 kΠ s1sxl∀再灌后 uw «o≤∂
2⁄高剂
量组大鼠神经损伤症状显著减轻 o与模型对照组比
较有显著性差异 kΠ s1sxl∀
表 t 不同剂量 ≤∂
2⁄对神经损伤症状的影响 kν usl
时间
r« 组别
剂量
r°ª# ®ªpt
神经损伤症状等级
´ µ ¶ · ∏
Πtl
x 假手术 p us s s s s s1st
模型 p s | y v u
≤∂
2⁄ u w tu u u s s1st
t u tw v t s s1sx
s1x t { x x t
尼莫地平 u x ts v u s s1st
uw 假手术 p us s s s s s1st
模型 p s { x x u
≤∂
2⁄ u y ts u t t s1st
t w | w t u
s1x v { y u t
尼莫地平 u { | t t t s1st
注 }tl各组分别与模型对照组比较
3q2 对梗死范围的影响
由表 u可知 o≤∂
2⁄高剂量组大鼠脑组织梗死
重量及梗死范围明显减小 o与模型对照组比较有显
著性差异 kΠ sqsxl∀ ≤∂
2⁄中 !低剂量组大鼠脑
组织梗死重量及梗死范围亦有下降趋势 o但与模型
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∂ ²¯qvuo ¶¶∏¨ z
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表 u ≤∂
2⁄对脑梗死范围的影响 kcξ ? σ, ν tsl
组别
剂量
r°ª# ®ªpt
梗死质量
r≅ tspu ª
梗死范围
rh
假手术 p p p
模型 p uy1{y ? y1|x us1wy ? w1{v
≤∂
2⁄ u t{1sv ? x1sxul tw1tx ? w1vstl
t uu1yv ? y1yv tx1uz ? x1z|
s1x uw1z| ? {1zs ty1zy ? z1tt
尼莫地平 u tz1yv ? x1u{ul tv1|s ? w1y|tl
注 }与模型对照组比较 tl Π s1sxoul Π s1stk表 u同 l
对照组比较无统计学差异 ∀
3q3 对脑组织 ≥⁄活性 ! ⁄含量及细胞内 ≤¤u n
浓度的影响
由表 v可知 o≤∂
2⁄高 !中剂量组大鼠脑组织
≥⁄活性明显升高 o与模型对照组比较有显著性差
异 kΠ s1sxl∀ ≤∂
2⁄高剂量组大鼠脑组织 ⁄
含量及脑细胞内游离 ≤¤u n浓度明显降低 o与模型对
照组比较有显著性差异 kΠ s1sxl∀
3q4 病理组织学结果
假手术组大鼠脑组织灰 !白质界限清楚 o灰质区
神经细胞及胶质细胞丰富 o白质区可见色深 !界限清
楚的神经纤维束及胶质细胞 ~海马结构正常 o神经细
胞排列整齐紧密 ∀模型对照组大鼠脑组织灰质区局
部神经细胞及胶质细胞坏死 !消失 o白质区局部神经
纤维束液化坏死 ~海马神经细胞排列紊乱 o数量减
少 o细胞变形 ∀ ≤∂
2⁄高 !中 !低剂量组大鼠脑组织
白质局部神经纤维束轻度液化坏死 o灰质区少数神
经细胞及胶质细胞坏死 ~海马神经细胞排列较整齐 o
数量轻度减少 ∀ ≤∂
2⁄各剂量组脑组织病变均比
模型对照组轻 o其中高剂量组病变最轻 o见图 t∀
表 v 对脑组织 ≥⁄活性 ! ⁄含量及脑细胞内游离 ≤¤u n浓度的影响 kcξ ? σ, ν tsl
组别 剂量 r°ª# ®ªpt ≥⁄r∏# °pt ⁄ r±°²¯# °pt ≤¤u n r±°²¯# pt
假手术 p u{y1|w ? vw1vzul y1tu ? t1tuul w{1zt ? tw1{wul
模型 p uuu1|| ? vs1s| {1|t ? t1tw twt1x| ? uy1xx
≤∂
2⁄ u uy{1|v ? vx1tttl z1ws ? s1|wtl tsx1vz ? uu1txtl
t uyt1vw ? ut1vxtl z1yx ? t1sw ttt1sx ? vu1{z
s1x uvy1vt ? v{1tv z1xx ? t1zu tuu1xx ? vw1yy
尼莫地平 u uzv1uz ? vt1{uul z1ws ? s1{ytl |t1zw ? uy1ysul
图 t 各组大鼠脑组织病理变化 k ≅ wssl
q假手术组 ~
q模型组 ~≤q≤∂
2⁄高剂量组 ~⁄q ≤∂
2⁄中剂量组 ~∞q ≤∂
2⁄低剂量组 ~ƒq尼莫地平组
3 讨论
缺血性脑血管疾病是严重危害人类健康的脑血
管疾病之一 ∀脑缺血可导致严重的迟发性神经元损
伤 o影响患者的预后和功能恢复 ∀有研究表明 o
≤∂
2⁄能明显延长结扎迷走神经及两侧颈总动脉
造成急性脑缺血模型小鼠的存活时间 o减轻大鼠实
验性血栓的湿重和干重 ≈t ~减轻大鼠局灶性脑缺血
再灌注损伤神经运动功能障碍 o缩小脑梗死范围 o并
可减轻缺氧时所致的神经元损伤 o对神经元具有保
护作用 ≈uov ~同时 o≤∂
2⁄能降低易卒中型肾血管性
高血压脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织含水量及脑梗
死范围 ∀体外实验也证明 o≤∂
2⁄能减轻体外缺氧
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培养及兴奋性氨基酸毒性作用所致的神经元损伤 o
对神经元具有保护作用 o并对兔体外血栓形成有明
显的抑制作用 ≈w ∀本实验结果亦表明 o≤∂
2⁄能明
显减轻大鼠神经损伤症状 o降低脑组织梗死范围 o对
脑缺血再灌注损伤具有保护作用 ∀
脑缺血再灌注损伤与自由基大量生成和细胞内
≤¤u n超载有关 ≈| ∀正常生物体内自由基生成与清
除处于动态平衡 o脑缺血时 o大量的自由基生成 o使
脑内脂质过氧化作用加强 o导致细胞及细胞屏障损
害 o神经元坏死或凋亡 o引起和加重缺血脑组织水
肿 ∀ ≥⁄为抗氧化酶 o是体内主要的自由基清除
剂 o能催化超氧自由基发生歧化反应 o生成过氧化氢
和氧 o而超氧自由基的产生是其他自由基产生和增
殖的关键步骤 o≥⁄活性可以间接反映机体清除自
由基的能力 ∀ ⁄是脂质过氧化反应的最终产物 o
反映组织中自由基含量及细胞的损伤程度 ≈ts ∀脑
缺血时 o大量 ≤¤u n内流导致细胞内 ≤¤u n超载 ∀过量
的 ≤¤u n沉积于线粒体 o干扰氧化磷酸化过程 o能量
产生障碍 ~胞内 ≤¤u n超载还可致胞浆内或溶酶体内
≤¤u n依赖性酶类和磷脂酶类大量激活 o特别是 ≤¤u n
激活的中性蛋白酶活性的病理性增加 o可使细胞膜
结构分解 o神经元骨架破坏 o导致细胞死亡 ~另外 o胞
内 ≤¤u n超载可激活磷脂酶 u和磷脂酶 ≤等代谢调
节的重要酶类 o使膜磷脂降解 o产生大量游离脂肪
酸 o加重缺血引起的细胞损伤 ∀本实验研究显示 o
≤∂
2⁄能降低模型大鼠脑组织 ⁄含量 o提高脑
组织 ≥⁄活性 o减轻脑细胞内 ≤¤u n超载 o提示其对
抗脑缺血再灌注损伤作用的机制可能与抑制脂质过
氧化和减轻脑细胞内 ≤¤u n超载有关 ∀
≈参考文献
≈t 方泰惠 o许惠琴 o徐 立 o等 q黄杨宁对急性实验性脑缺血的
保护作用 ≈ q中草药 ot||zou{kzl}wtvq
≈u 陶欣艺 o沈祥春 o方泰惠 o等 q环维黄杨星 2⁄对实验性脑缺血
的保护作用 ≈ q中药药理与临床 oussvot|kxl}tvq
≈v 谭 峰 o顾 卫 o吴海科 o等 q环维黄杨星 2⁄对高血压大鼠脑
缺血损伤的保护作用 ≈ q中国中西医结合急救杂志 oussxo
tukul}|zq
≈w 袁冬平 o龙 军 o方泰惠 q环维黄杨星 2⁄对 °≤tu谷氨酸损伤
的保护作用的实验研究 ≈ q中西医结合心脑血管病杂志 o
usswouktl}vzq
≈x ²±ª¤∞ o • ¬¨±¶·¨¬± ° o ≤¤µ¬¶²± ≥o ·¨¤¯q √¨ µ¨¶¬¥¯¨°¬§§¯¨
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≈y 徐叔云 o卞如濂 o陈 修 q药理实验方法学 ≈ qv版 q北京 }人
民卫生出版社 oussu}tsyyowv|q
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∏´¤±·¬©¬¦¤·¬²± ²© ¬¨³¨ µ¬° ±¨·¤¯ ¦¨µ¨¥µ¤¯ ¬±©¤µ¦·¬²± ¬± µ¤·¶≈ q
≥·µ²®¨ o t|{yotzkyl}tvswq
≈| 王 洁 o吴俊芳 o张均田 q总丹酚酸的抗脑缺血研究 ≈ q中国
药理学通报 ot|||otxkul}tywq
≈ts 禹志岭 o张广钦 o赵红旗 q葛根总黄酮对脑缺血的保护作用
≈ q中国药科大学学报 ot||zou{ktl}vtsq
Εφφεχτ οφ χψχλοϖιροβυξινυµ 2∆ ον χερεβραλισχηεµ ια2ρεπερφυσιον ινϕυρψ ιν ρατσ
≠ ¤²tou o ¤±2½«¨ ±t o ∏²2¯¬¤±ªt
(t. Ανηυι Σχιενχε ανδ Τεχηνολογψ Υνιϖερσιτψ, Βενγβυ uvvtss, Χηινα;
u. Ιστιτυτε οφ ΧλινιχαλΠηαρµ αχολογψ, Γυανγζηου Υνιϖερσιτψ οφ ΤραδιτιοναλΧηινεσε Μεδιχινε, Γυανγζηου xtswsx, Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ײ ²¥¶¨µ√¨·«¨ ©¨©¨¦·²©¦¼¦¯²√¬µ²¥∏¬¬±∏°2⁄ k≤∂
2⁄l ²± ¦¨µ¨¥µ¤¯ ¬¶¦«¨ °¬¤2µ¨³¨ µ©∏¶¬²± ¬±∏µ¼ ¬± µ¤·¶
¤±§ ¬¨³¯²µ¨ ¬·¶° ¦¨«¤±¬¶°¶q Μετηοδ : ±¨«∏±§µ¨§¤±§·º ±¨·¼ µ¤·¶º µ¨¨ µ¤±§²° ¼¯ §¬√¬§¨ §¬±·²·«µ¨¨≤∂
2⁄ ªµ²∏³¶kuo to s1x °ª#
®ªpt lo ¬°²§¬³¬±¨ªµ²∏³ku °ª# ®ªpt lo °²§¨ ¯ªµ²∏³¤±§¶«¤° ²³¨ µ¤·¨§ªµ²∏³o us µ¤·¶ ¤¨¦«ªµ²∏³q ¤·¦¨µ¨¥µ¤¯ ¬¶¦«¨ °¬¤2µ¨³¨ µ©∏2
¶¬²± ¬±∏µ¼ °²§¨ ¯º¤¶¬±§∏¦¨§¥¼ °¬§§¯¨ ¦¨µ¨¥µ¤¯ ¤µ·¨µ¼ ²¦¦¯∏¶¬²±o ·«¨ ± µ¨√¨¬±∏µ¼ ¶¼°³·²°¶º¤¶ √¨¤¯∏¤·¨§o ·«¨ ¯¨ √¨¯ ²©≥⁄ ¤±§
⁄ ¬± ¥µ¤¬± ·¬¶¶∏¨ º µ¨¨ §¨ ·¨µ°¬± §¨o ·«¨ ¦²±¦¨±·µ¤·¬²± ²©¬±·µ¤¦¨¯¯¤µ≤¤u n ²©¥µ¤¬± º¤¶° ¤¨¶∏µ¨§o ¤±§·«¨ ³¤·«²¯²ª¬¦¤¯ ¦«¤±ª¨ ²©¥µ¤¬±
º¤¶¤¯¶² ²¥¶¨µ√ §¨q Ρ εσυλτ: ≤∂
2⁄ ¦²∏¯§¬°³µ²√¨·«¨ ± µ¨√¨¬±∏µ¼ ¶¼°³·²°¶o µ¨§∏¦¨ ·«¨ ¬±©¤µ¦·¬²± ¤µ¨¤²©¥µ¤¬±o ·«¨ ¦²±¦¨±·µ¤·¬²± ²©
¬±·µ¤¦¨¯¯¤µ≤¤u n ¤±§·«¨ ¯¨ √¨¯ ²© ⁄o ¬±¦µ¨¤¶¨ ·«¨ ¤¦·¬√¬·¼ ²©≥⁄o ¤±§§¨ ¦µ¨¤¶¨ ·«¨ ³¤·«²¯²ª¬¦¤¯ ¦«¤±ª¨ ²©¥µ¤¬±q Χονχλυσιον: ≤∂
2
⁄ «¤¶³µ²·¨¦·¬√¨ ©¨©¨¦·²± ¦¨µ¨¥µ¤¯ ¬¶¦«¨ °¬¤2µ¨³¨ µ©∏¶¬²± ¬±∏µ¼ ¬± µ¤·¶q
[ Κεψ ωορδσ] ¦¼¦¯²√¬µ²¥∏¬¬±∏°2⁄~ ¦¨µ¨¥µ¤¯ ¬¶¦«¨ °¬¤2µ¨³¨ µ©∏¶¬²± ¬±∏µ¼~ ¬¯³¬§³µ¨²¬¬§¤·¬²±~ ≤¤u n ≈责任编辑 古云侠
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