全 文 ：ｉｎｔｗｏｓｅｒｉａｌｙｃｏｕｐｌｅｄｄｉｆｅｒｅｎｔｉｏｎｉｃｅｘｃｈａｎｇｅｃｏｌｕｍｎｓ，ｏｎｅｐａｃｋｅｄｃｏｌｕｍｎｗａｓＤ７２ｃａｔｉｏｎｒｅｓｉｎ，ａｎｏｔｈｅｒａｎｉｏｎｒｅｓｉｎ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓ
ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓａｎｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｒｅｓｉｎＤｔｗａｓｔｈｅｂｅｓｔｒｅｓｉｎｔｏｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｏｔａｌｌｅａｖｅｓｓａｐｏｎｉｎｓｏｆｐａｎａｘｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ．
Ｔｈｅｔｏｔａｌｓａｐｏｎｉｎｐｒｏｄｕｃｔｓｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒｐｕｒｉｔｙａｎｄｑｕａｌｉｔｙｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｉｓｗｏｒｋｓｈｏｗｓｔｈａｔｔｈｅｍｅｔｈｏｄｐｒｏｐｏｓｅｄｉｓｃｏｎ
ｖｅｎｉｅｎｔ，ｈｉｇｈｅｆｉｃｃｉｅｎｔａｎｄｓｔｅａｄｙｏｎｅ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｔｏｔａｌｌｅａｖｅｓｓａｐｏｎｉｎｓｏｆｐａｎａｘｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ；ｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎ；ｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｒｅｓｉｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
［责任编辑 鲍 雷］
［收稿日期］ ２００８０３０３
［通讯作者］ 贾天柱，Ｔｅｌ：（０４１１）８７５８６０３８，Ｅｍａｉｌ：ｊｉａｔｚ＠
ｌｎｕｔｃｍ．ｅｄｕ．ｃｎ
单一菌种发酵神曲的质量比较研究
高 慧，贾天柱
（辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 １１６６００）
［摘要］ 目的：将神曲的传统杂菌发酵改进为单一菌种发酵，对不同菌种发酵神曲的质量进行比较，以优选较
佳菌种。方法：从自行发酵神曲中分离菌种，与另２个菌种分别进行单一菌种发酵，以成品神曲的化学成分、酶活
力及对小鼠消化功能影响等为评价指标，进行质量比较。结果：分离得到４菌种，以其中１种毛霉属的霉菌作为发
酵菌种所得神曲质量较优。结论：单一菌种发酵能够解决真菌毒素问题，保证神曲质量和用药安全，新工艺可行。
［关键词］ 神曲；菌种分离；单一菌种发酵；薄层色谱；酶活力；消化功能
［中图分类号］Ｒ２８４．１ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００８）２０２３２３０３
神曲系由面粉、赤小豆、苦杏仁、青蒿、苍耳、辣
蓼按一定比例混匀发酵制成的传统曲剂，健脾和胃、
消食调中，应用广泛。但目前神曲生产为杂菌发酵，
产品质量不稳，差异较大［１］，而且有人从中检出了
有强致癌作用的黄曲霉素［２］，影响了用药安全。有
人曾对神曲的单一菌种发酵工艺进行过初步尝试，
但未见系统研究［３］。
本实验对单一菌种发酵神曲的质量进行比较研
究。按传统工艺发酵制得神曲，从中分离菌种，再
结合其他菌种进行单一菌种发酵，以化学成分、酶
活力及对小鼠消化功能影响等为评价指标，优选发
酵菌种。
１ 材料
苦杏仁、赤小豆 购自沈阳市药材公司，经本院
王冰教授鉴定，分别为蔷薇科植物东北杏 Ｐｒｕｎｕｓ
ｍａｎｄｓｈｕｒｉｃａＫｏｅｈｎｅ的干燥成熟种子、赤小豆Ｐｈａｓｅ
ｏｌｕｓｃａｌｃａｒａｔｕｓＲｏｘｂ．的干燥成熟种子；青蒿、苍耳、
辣蓼 采自辽宁千山，经本院王冰教授鉴定，分别为
菊科植物ＡｒｔｅｍｉｓｉａａｎｎｕａＬ．的全草、菊科植物 Ｘａｎ
ｔｈｉｕｍｓｉｂｉｒｉｃｕｍＰａｔｒ．的地上部分、蓼科植物 Ｐｏｌｙｇｏ
ｎｕｍｆｌａｃｃｉｄｕｍＭｅｉｓｓｎ的全草。
牛肉膏（北京奥博星生物技术责任有限公司，
批号２００２０２０８）；蛋白胨［中国医药（集团）上海化学
试剂公司，批号２００１０７２５］；硅胶 Ｇ（青岛海洋化工
厂）；试剂均为分析纯。
枯草芽孢杆菌（ＡＳ１８９２Ｂａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）；枯
草芽孢杆菌（ＡＳ１１５Ｂａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）购自中国微
生物研究所菌种保藏中心；４种自行从神曲中分离
出的菌种。
小白鼠昆明种，体重１８～２２ｇ，雌雄不拘，由辽
宁中医药大学动物室提供，合格证号辽实动（质）字
２００４００１８。
电热恒温培养箱 ＨＨＢ１１５００；超声波清洗器
ＡＳ３１２０Ａ；高压蒸气灭菌锅ＹＸ２８０Ｂ；无菌箱。
２ 方法与结果
２．１ 菌种的分离
按传统工艺［４］自行发酵神曲，取停止发酵２４ｈ
内的新鲜神曲，粉碎，过２０目筛，称取１ｇ在无菌条
件下加到９９ｍＬ无菌水中，振摇，得１０－２稀释度的
菌悬液，从中吸取１ｍＬ加到９ｍＬ无菌水中，混匀，
依此法依次制成１０－３，１０－４，１０－５，１０－６，１０－７，１０－８
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第３３卷第２０期
２００８年１０月
中 国 中 药 杂 志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ
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Ｏｃｔｏｂｅｒ，２００８
各种稀释度的菌悬液。用无菌吸管分别吸取１滴不
同稀释度的菌液，滴入普通培养基平板中（每个稀
释度重复做三皿），涂布，培养。挑取单个菌落纯化
培养，镜检。若不纯，再依法反复稀释，直至获得纯
培养［５］。结果得到４种纯菌落，经检查均为单一微
生物，分别标为１～４号。经作者根据菌落形态、显
微形态及革兰氏染色实验结果初步鉴定为：１号为
细菌，革兰氏阳性，芽孢杆菌；２号为细菌，革兰氏阴
性，杆菌；３号为毛霉属霉菌；４号为曲霉属霉菌。
２．２ 神曲的单一菌种发酵
按传统工艺拌好曲料置玻璃瓶中（每瓶约２００ｇ
曲料），流通蒸气灭菌。将６种菌（自行分离４种，
外购２种）分别转液体培养，各取约２ｍＬ培养液分
别接入上述已灭菌放凉的曲料中，３０℃左右培养７
ｄ或至长满菌丝，停止发酵。所得样品分别标为 １
号（接种１号菌种）、２号（接种２号菌种）、３号（接
种３号菌种）、４号（接种４号菌种）、５号（接种枯草
芽孢杆菌 ＡＳ１１５）、６号（接种枯草芽孢杆菌 ＡＳ
１８９２）。另取按传统工艺自行发酵的神曲作为对
照，标为７号。
２．３ 不同神曲样品薄层色谱图比较
供试液制备 取１～７号样品粉末（过３号筛）各
２０ｇ，用石油醚（沸程３０～６０℃）超声提取０５ｈ，提取
液浓缩至２～３ｍＬ，置量瓶中，作为供试品溶液。
薄层色谱条件 按《中国药典》２００５年版薄层
色谱法（附录ⅥＢ）进行试验，吸取上述供试品溶液
各５μＬ，点于同一硅胶 Ｇ板上，以石油醚（沸程
３０～６０℃）醋酸乙酯（８５∶１５）为展开剂，上行展
开，取出，晾干，喷以２％香草醛浓硫酸溶液，在
１０５℃下加热约５ｍｉｎ至斑点清晰。薄层色谱图结
果显示，各样品斑点均得到较好的分离，每个样品均
有清楚的６个斑点。但３，４号样品与对照样品斑点
比较相近，均在 Ｒｆ值约０１处有一明显蓝色斑点
（１，２，５，６号样品无此斑点）；１，２，５，６号样品彼此
相似，均在Ｒｆ值约０２处有一明显粉红色斑点（３，
４，７号样品无此斑点）。
２．４ 不同神曲样品的酶活力测定比较
２．４．１ 淀粉酶活力测定［６］ 按比色法测定（表１）。
２．４．２ 蛋白酶活力测定［７］ 按福林法测定（表１）。
２．５ 不同神曲样品对小鼠消化功能的影响［８］
２．５．１ 对小鼠胃肠推进功能的影响 将以上各样
品粉末（过８号筛），加水配制成２０％的混悬液，每
表１ 神曲样品的酶活力测定（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）Ｕ·ｇ－１
Ｎｏ 淀粉酶活力 蛋白酶活力
１ ０ ０
２ ０ ０
３ ５８８２±５２７ １１２８±１０１
４ ３０９７±４０８１） ８３５±９７６１）
５ ８７２７±８７１１） ０
６ ０ ０
７（对照） ５５２６±４４９ １１０６±９７８
注：与对照样品相比１）Ｐ＜００１
９ｍＬ混悬液加１ｍＬ碳素墨水，混匀，即得。
方法：取健康小白鼠８０只，随机分成８组，每组
１０只。禁食２４ｈ后，用１～７号样品的２０％混悬液及
生理盐水以００２ｍＬ·ｇ－１剂量灌胃，２０ｍｉｎ后断颈处
死，立即解剖，将消化道自胃贲门直至肠末端完整摘
出，测其全长，并记录碳素墨水前沿至贲门的距离，计
算其占胃肠道全长的百分比，为“推进比”（表２）。
表２ 神曲各样品混悬液对小鼠消化功能影响的测定
（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）
样品 推进比／％ 总酸分泌量／ｍＬ
样品１ ０４５±００８ ０４４±０１３
样品２ ０４６±０１９ ０４６±０１２
样品３ ０６８±０２０１） １０５±０５３２，３）
样品４ ０６２±０１４１） ０６５±０３３１）
样品５ ０４８±０１１ ０４５±０１４
样品６ ０４６±０１５ ０４８±００８
样品７（对照样品） ０５９±０１７１） ０５９±０３８１）
生理盐水组 ０４５±０１２ ０４８±０１８
注：与生理盐水组比较１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１；与对照样品组比
较３）Ｐ＜００５
２．５．２ 对小鼠胃中总酸分泌的影响 样液制备：除
不加碳素墨水外，其他同２．５．１中样液制备。
方法 取健康小白鼠８０只，随机分成８组，每组
１０只。禁食２４ｈ后，用１～７号样品的２０％混悬液
及生理盐水以００２ｍＬ·ｇ－１剂量灌胃，６０ｍｉｎ后拉
颈椎处死，立即取胃，充分剪开，置小三角瓶中，加入
蒸馏水５ｍＬ，振荡，滴入酚酞指示剂，混匀，用微量
滴定管徐徐滴入００１ｍｏｌ·Ｌ－１ＮａＯＨ溶液，至出现
红色为止，记其量即为总酸分泌量（表２）。
３ 讨论与结论
３．１ 关于神曲中发酵菌种的分离与初步鉴定
由于市售神曲均系干燥后的成品，其中微生物
多已死亡，故本研究选择自行发酵的新鲜神曲进行
发酵菌种分离，故未能与其他产地样品进行比较；由
于精力有限，只对发酵终点的神曲样品进行菌种分
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离，并未对其发酵全过程进行考察。经反复分离纯
化，得到稳定的 ４种菌种：两种细菌分别为芽孢杆
菌、革兰阳性，杆菌、革兰阴性；二种霉菌分属毛霉
属、曲霉属。
３．２ 关于单一菌种发酵神曲的质量比较
从薄层色谱图上可以看出，３，４号样品与７号
对照样品斑点比较相近，均在Ｒｆ值约０１处有一明
显蓝色斑点；１，２，５，６号样品彼此相似，均在 Ｒｆ值
约０２处有一明显红色斑点。
酶活力测定结果表明，１，２，６号样品淀粉酶、蛋
白酶活力均几乎为零，５号样品淀粉酶活力很高，但
蛋白酶活力几乎为零。３号与７号对照样品相比二
酶活力均无显著性差异，４号二酶活力均低于７号
对照样品（Ｐ＜００５）。
同空白组相比，３，４，７号样品对小鼠小肠推进
率均有明显增加（Ｐ＜００５）；３，４样品（纯种发酵）
与７号样品（传统发酵）无显著性差异。
同空白组相比，４，７号样品对小鼠胃中总酸分
泌有明显增加（Ｐ＜００５），３组有极显著差异（Ｐ＜
００１）；且３号样品同７号对照样品相比，促胃酸分
泌功能亦有明显增强（Ｐ＜００５）。
因１，２，５，６号样品（接种细菌）与３，４号样品
（接种霉菌）及７号对照样品（传统发酵）相比，无论
薄层斑点，还是酶活力和药理实验结果均有明显差
别，初步推断，单纯细菌不能达到神曲发酵产生新成
分及酶活力的目的，霉菌是其发酵的主要菌种。
３．３ 小结
综合以上各指标，初步认为３号菌种为较佳发
酵菌种；单一菌种发酵因为菌种固定，能够保证发
酵生产的稳定性及产品质量，亦能方便对发酵生产
进行科学化管理，适应中药现代化的要求。实验表
明，优选出的发酵菌种制得神曲质量优于传统发酵
神曲，且能杜绝黄曲霉素问题，单一菌种发酵工艺
可行；本实验仅对单一菌种发酵进行了比较研究，
未考虑不同菌种间的协同作用，在以后的研究中将
对多菌种发酵进行研究，以期获得更好更全面的研
究成果。
［参考文献］
［１］ 张荣藻，芦艳卿，王丽华，等．含神曲中成药染菌限度的研究
［Ｊ］．中国中药杂志，１９９８，２３（８）：４７４．
［２］ 黄国能．神曲等药曲中消化酶的检测与质量标准的探讨［Ｊ］．
中成药研究，１９８１（５）：１８．
［３］ 刘湛文，张志明．关于改革神曲生产工艺的初步探讨［Ｊ］．中药
通报，１９８７，１２（２）：２７．
［４］ 叶定江．中药炮制学［Ｍ］．上海：上海科学技术出版社，２００２：
２６１．
［５］ 范秀容，李广武，沈 萍．微生物学实验［Ｍ］．北京：高等教育
出版社，１９９５：１０７．
［６］ 中山大学生物系生化微生物教研室．生化技术导论［Ｍ］．北
京：人民教育出版社，１９７９：５４．
［７］ 周德庆．微生物学实验手册［Ｍ］．上海：上海科学技术出版社，
１９８６：３５３．
［８］ 徐叔云，卞如濂，陈 修．药理实验方法学［Ｍ］．北京：人民卫
生出版社，１９８２：８４７．
Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｑｕａｌｉｔｙｏｆｖａｒｉｏｕｓｓｈｅｎｑｕｆｅｒｍｅｎｔａｔｅｄｗｉｔｈ
ｄｉｆｅｒｅｎｔｐｕｒｅｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
ＧＡＯＨｕｉ，ＪＩＡＴｉａｎｚｈｕ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＬｉａｏｎｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｄａｌｉａｎ１１６６００，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｂｙｓｏｍｅｕｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｓｔｒａｉｎｓｉｎｔｏｔｈｅｍｏｄｅｒｎｐｕｒｅｉｎ
ｏｃｕｌａｔｉｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｆｏｒｓｅｌｅｃｔｉｎｇｂｅｔｅｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓｔｒａｉｎｓ，ｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｏｆｖａｒｉｏｕｓＳｈｅｎｑｕｆｅｒｍｅｎｔａｔｅｄｗｉｔｈｄｉｆｅｒｅｎｔ
ｐｕｒｅｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｂｅｃｏｍｐａｒｅｄ．Ｍｅｔｈｏｄ：ＩｓｏｌａｔｉｎｇｔｈｅｓｔｒａｉｎｓｆｒｏｍｓｅｌｆｆｅｒｍｅｎｔｅｄＳｈｅｎｑｕ，ｔｈｅｎｗｉｔｈｏｔｈｅｒ２ｃｅｒｔａｉｎｓｔｒａｉｎｓ，ｔｏｃｏｎｄｕｃｔ
ｔｈｅｐｕｒｅｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｎｃｏｍｐａｒｅｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｏｆｔｈｅｍａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｄｉｆｅｒｅｎｃｅｉｎｔｈｅｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，ａｃｔｉｖｉｔｙｏｆ
ｅｎｚｙｍｅａｎｄｔｈｅｉｍｐａｃｔｔｏｔｈｅｄｉｇｅｓｔｉｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｍｉｃｅｏｆｔｈｅｆｉｎｉｓｈｅｄＳｈｅｎｑｕ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｆｏｕｒｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄ．Ｏｎｅｏｆｔｈｅｍ，ａ
ｍｕｃｏｒｇｅｎｕｓｏｆｍｏｌｄｉｓｂｅｔｅｒｔｈａｎｏｔｈｅｒｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｍｏｄｅｒｎｐｕｒｅｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃａｎｅｎｓｕｒｅｔｈｅｑｕａｌｉｔｙａｎｄｔｈｅｍｅｄｉｃａ
ｔｉｏｎｓａｆｅｔｙｏｆＳｈｅｎｑｕ．Ｎｅｗｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｓｆｅａｓｉｂｌｅ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｓｈｅｎｑｕ；ｓｔｒａｉｎｉｓｏｌａｔｉｎｇ；ｐｕｒｅｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ＴＬＣ；ａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｅｎｚｙｍｅ；ｄｉｇｅｓｔｉｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎ
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