全 文 ：EDIBLEFUNGI食用菌 2007(4)
美味牛肝菌的菌种分离
培养试验初探
刘琼波 苏开美 白永顺 段福文
(云南省楚雄州林科所,675005)
摘 要 以美味牛肝菌的子实体、菌根作为分离材料,采
用多种分离方法,在不同配方的培养基上反复培养,获得
美味牛肝菌试管母种,分离成功率达60%以上。并将母种
扩大培养成为液体菌种、固体菌种,实现了规模化生产美
味牛肝菌菌丝体。
关键词 美味牛肝菌 菌种分离 培养基
文章编号 1000-8357(2007)04-0025-01
美味牛肝菌属牛肝菌科 (Boletaceae)牛肝菌属(Boletus
edulisBul.:Fr)真菌,是云南省分布最广、产量最高、出口量最
大的著名野生食用菌。开展美味牛肝菌的菌种分离培养试验
主要目的是为合成美味牛肝菌菌根化苗木提供菌种,以实现
半人工模拟栽培;另一方面为美味牛肝菌菌丝体的工业发酵
提供技术基础,以提取菌丝体的有效成分和芳香物质,促进保
健药品和特色产业的开发。
1 材料与方法
1.1 分离材料 ①子实体分离材料:分离用的子实体采自
禄丰县中村乡棠海村萝卜地山,取幼嫩的无病虫无破损的新
鲜子实体(40g左右)。萝卜地山海拔1900m。树种主要是云
南松(P.yunnanensisFranch),毛杨梅(MyricaesculentaBuch.-
Ham.exD.Don)、滇油杉 (KeteleeriaevelynianaMast)、麻栎
(QuercusacutissimaCar.)、青刚栎 C.glauca(Thunb.)Oersted、杜
鹃(Rhododendronssp.)、厚皮香 Ternstroemiagymnanthera(Wight
etArn.)Sprague、南烛(Lyoniaozifozia)、野坝子(Elsholtziarugu-
losa)。土壤类型主要是红壤。②菌根分离材料:菌根采自上述
植被下,距美味牛肝菌子实体 15cm,深 5～15cm的土壤层
内。
1.2 母种及扩大再生母种培养基配方 Ⅰ.马铃薯 200g,葡
萄糖 20g,琼脂粉 20g,二次蒸馏水 1000mL,pH6;Ⅱ.葡
萄糖 20g,酵母粉 5g,琼脂粉 20g,二次蒸馏水 1000mL,
pH6;Ⅲ.磷酸二氢钾 1.0g,硫酸镁 0.5g,麦芽糖 5g,葡萄糖
20g,维生素B1 mL(40ug/L),酒石酸铵2g,琼脂粉20g,蒸馏
水1000mL,pH6;Ⅳ.松针汁200mL,松根汁200mL,马铃薯
200g,葡萄糖20g,琼脂粉20g,蒸馏水600mL,pH6。
1.3 液体菌种营养液配方 液体菌种营养液是用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、
Ⅳ4种培养基不加琼脂粉,分别为Ⅰ′、Ⅱ′、Ⅲ′、Ⅳ′培养液。
1.4 固体菌种培养料配方 固体菌种培养料基质配方为蛭
石∶草煤=1∶1。a.基质2000g,加Ⅱ′培养液1000mL,pH6;b.基
质2000g,加 Ⅳ′培养液1000mL,pH6;c.基质2000g,加Ⅲ′
培养液1000mL,pH6;d.基质2000g,加蒸馏水 1000mL,
pH6。
1981年3月 1984年1月
菌株 活性 菌株 活性 菌株 活性 菌株 活性 菌株 活性
1504 - 7985 + Au53 - 57 + Au53 +
LM - -17 - 8153 - 1504 + Au86 +
D-1 - 806 - 5.183 - 806 - Au31b +
5lg021 - Au26 - Au86 + 8101 - D-2 -
7925 - Au31 - 590 - Au26 +
D-2 - -1 - Au31a +
803 - 1503 - 801 +
表1 黑木耳保藏菌种成活情况
注:+表示成活,-表示未成活。
菌株
1981年 1984年
7985Au8657 79851504Au26Au31aAu53Au86Au31b
萌发时间/d 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
7d生长量/cm 5.2 5.2 5.2 6.1 5.9 6.0 6.0 4.9 4.9 5.1
9d生长量/cm 8.4 8.0 8.2 8.7 8.4 8.9 8.0 7.7 8.0 7.3
13d生长量/cm 满 满 满 满 满 满 9.6 满 9.9 9.7
菌丝长势 ++ ++++++ ++ ++ ++ + +++ +++ +
表2 成活菌种转接后生长情况
注:+长势弱,++长势旺盛,+++长势较旺盛。
长势稍弱,菌丝相对稀疏。菌丝形态的差异与菌株本身的特性
有关。
2.3 菌丝镜检情况 各菌株活化后经显微镜检测,均符合黑
木耳的菌丝形态特征,各菌株均有锁状联合,说明具有结实能
力。
3 小结与讨论
3.1 采用麦粒于低温 (4～6℃)相结合的方法保藏黑木耳菌
种,在 21～25年后能够保持活性,不仅证明黑木耳菌种生
命力的顽强,也证明了该保藏方法的可靠性。值得一提的
是:两次保藏的 7985和 Au86l菌株均恢复了活性,而保藏
25年的其它菌株则没有成活,说明各菌株对于环境的适应
能力存在差异。由于采用棉塞封口,试管内麦粒已经严重
脱水处于松散、干燥状态,菌丝长期处于休眠状态,在活化
时菌丝萌发较慢。因此,采用固体培养基保藏菌种时,应注
意保持水分,水分的散失容易引起菌种的死亡,或活性的
降低。
3.2 试验只验证了菌种的活性,至于各菌株的遗传性状、
农艺性状还有待进一步研究。由于菌丝长期处于休眠状
态,菌种活化后不可直接用作生产种,应经过 2～3次转接
恢复菌丝活力。生产用菌种不易长时间保藏,应定期测活,
并进行必要的出耳试验,证明结实能力和遗传性状的稳定
性。
参 考 文 献
[1] 张树庭,林芳灿.蕈菌遗传与育种[M].北京:中国农业出版社,
1997,260.
[2] 陈士瑜.菇菌生产技术全书 [M].北京:中国农业出版社,
1999,275.
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EDIBLEFUNGI食用菌 2007(4)
1.5 试验方法
1.5.1 分离方法 采用菌盖、菌柄、菌根分离等几种分离方
法。以上每种分离方法,各分离25支斜面培养基试管,须严格
无菌操作。将分离好的试管置于20℃恒温或常温下培养。从
第4天起,每隔3d检查1次,及时刷除污染管。
1.5.2 美味牛肝菌菌丝体的扩大培养方法 ①原母种扩大为
再生母种:将分离获得的纯菌丝体无菌操接入已做好的Ⅰ、
Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4种培养基斜面上贴紧。各接25只,置于常温下培
养,每隔 5d观察 1次。②液体菌种培养:培养液做好后分装
在 250mL三角烧瓶中,每瓶装 100mL,塞上棉塞(9.8×104～
1.47×104)Pa压力下灭菌 25min,无菌操作接入再生母种,每
瓶接入母种米粒大一块。每种营养液准备 20瓶,置于常温
下培养,每隔 5d观察 1次。③固体菌种培养:分别将 a、b、
c、d4种培养料混合后分装在 250mL三角烧瓶中,每瓶装入
培养料375g(含水)压紧,塞上棉塞,(9.8×104～1.47×104)Pa压
力下灭菌 2h,无菌操作接入大小相当再生母种或液体菌种 3
块,采用三角形接法,每种培养料准备 16瓶。置于常温下培
养,定期观察长满瓶的时间。
2 结果与分析
2.1 美味牛肝菌菌种的分离情况 从表 1可看出,几种分离
方法中,菌柄、菌柄与菌盖连接处都能分离成功,10d左右萌
发出纯白色的绒毛状菌丝,30d左右长成直径 3cm的菌落,
菌管、菌根和饱子分离容易被细菌污染,没有萌发出菌丝。作
分离用的Ⅲ培养基效果最好,成功率在 70%以上;Ⅱ培养基
萌发率低,仅有 5%;Ⅱ培养基上菌丝黄白色。在Ⅲ培养基菌
丝体纯白色,菌落直径比Ⅱ培养基大。Ⅰ、Ⅳ培养基上不能萌
发菌丝。21℃恒温培养与常温培养无多大差别。
2.2 美味牛肝菌的扩大菌种培养结果 从表 2可看出:Ⅱ、
Ⅲ培养基上美味牛肝菌菌丝体均能生长,Ⅲ培养基上生长最
快,40d左右菌落直径可达55mm。
从表3可看出:Ⅰ′,Ⅳ′培养液菌丝体不能生长,Ⅱ′,Ⅲ营
养液菌丝均能生长,Ⅱ′营养液 30d菌落直径能长到 58mm,
菌落黄白色。Ⅲ′营养液最适合菌丝体生长,40d菌落直径长
至75mm,菌丝体纯白色。振荡与静置培养菌落直径差不多,
只是振荡培养菌丝体更旺盛一些。
从表 4可看出:在 4种培养料中 b、c菌丝体均能生长。
其中 c生长最快,用液体菌种接种 30d满瓶,b其次 60d
满瓶。 说明几种营养液中,Ⅲ′培养液最适合美味牛肝菌
生长;而且用液体菌种接种要比直接用试管种接种效果要
好。
3 小结与讨论
综合以上实验证明,分离美味牛肝菌用菌盖与菌柄连接
处的菌肉组织成功率最高,而且不易污染;营养液的成分对美
味牛肝菌菌丝体的生长起着关键的作用,碳源为葡萄糖、麦芽
糖,氮源为酒石酸铵、磷酸二氢钾,适当加维生素 B1,对菌丝
体生长有促进作用。培养基
分离材料
菌柄基部 菌盖与菌柄之间 菌管 孢子 菌根
Ⅰ 0 0 0 0 0
Ⅱ 5 60 0 0 0
Ⅲ 10 70 0 0 0
Ⅳ 0 0 0 0 0
表1 美味牛肝菌菌种的分离成功率/%
表2 原母种扩大培养为再生母种菌丝体生长情况
培养基
平均菌落直径/mm
5d 10d 15d 20d 25d 30d 40d
Ⅰ 0 0 0 0 0 0 0
Ⅱ 1 5 10 15 20 25 30
Ⅲ 2 8 15 20 25 40 50
Ⅳ 0 0 0 0 0 0 0
营养液
配方
平均菌落直径/mm
5d 10d 15d 20d 25d 30d 40d
Ⅰ′ 0 0 0 0 0 0 0
Ⅱ′ 10 20 30 42 51 55 58
Ⅲ′ 12 25 38 45 58 65 75
Ⅳ′ 0 0 0 0 0 0 0
表3 液体菌种生长情况
表4 培养固体菌种长满培养料时间/d
培养料配方 用试管菌种接种 用液体菌种接种
a 不能生长 不能生长
b 80 60
c 40 30
d 不能生长 不能生长
“鬼伞”的综合预防措施
预防草菇的鬼伞发生,必须抓好以下措施:
1 搞好菇场(房)的环境卫生,在菇房可用甲醛和敌敌畏等
药剂熏蒸,也可用石灰水或其它杀菌剂喷洒消毒。
2 采用当年新鲜稻草作栽培原料,使用前先翻暴晒1~2d。
3 草堆添加辅助氮源最好用氨态氮和有机氮。禽畜粪以3%
~5%为宜,并充分发酵,一定要让氨彻底散发后再播种。
4 调节酸碱度 用 1%石灰水浸泡稻草 6~10h,再堆积发
酵。堆温达50℃以上并维持2d。这样既可杀死杂菌,又可调
节酸碱度。
5 草菇喜欢微碱性环境,而碱性环境不利鬼伞发生。因此,
在料中适当加入火烧土。
6 草菇菌丝生长温度要维持 28~32℃,子实体发育温度 25~
30℃。控制温度可促使草菇生长发育,抑制鬼伞的发生。
7 草堆湿度在 60%~65%,菇场湿度 85%~90%,最适合草菇
菌丝生长,控制培养料的湿度可抑制鬼伞的发生。
8 适当加大播种量,让草菇菌丝尽快满菌床,抑制鬼伞发
生。
9 如鬼伞发生,要及时摘除,可用石灰进行局部消毒,也可
用其它杀菌剂消毒。
10 出菇过程中为调节草堆酸碱度,可喷洒0.5%石灰水,产
菇后期适量喷洒0.1%~0.2%的尿素作追肥,既可防止鬼伞发
生,又可延长出菇期,提高产量。 (张兴长)
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