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Experimental study on the theraputic effect of crescent euphorbia on lewis lung cancer in mice

猫眼草水提物对小鼠Lewis肺癌的抑制作用及机制探讨



全 文 :猫眼草水提物对小鼠 ¨º¬¶肺癌的抑制
作用及机制探讨
肖宝红 o张春玲 3 o武 晓
k青岛市中心医院呼吸内科 o山东 青岛 uyyswul
≈摘要  目的 }探讨中药猫眼草对小鼠 ¨º¬¶肺癌的生长抑制 !免疫调节 !血液系统 !细胞周期的影响 o并对其
抗癌作用机制进行探讨 ∀方法 }选择 ≤xz…ry小鼠移植性 ¨º¬¶肺癌为实验模型进行试验 o观察猫眼草对肺癌的抑
制 !免疫调节以及对小鼠血细胞的影响 o同时采用流式细胞仪检测瘤组织的细胞周期 !凋亡率 o应用 ט‘∞法观察
猫眼草对肺癌细胞凋亡的影响 ∀结果 }≠ 猫眼草 z1x otx ovs oys ª#®ªpt组抑瘤率分别为 s1yt h oty1|v h ovu1{t h和
x{1uy h o与模型组相比 vs oys ª#®ªp t组有显著性差异k Π s1sxl ∀  猫眼草各组对荷瘤小鼠胸腺指数无明显影响 o
ys ª#®ªp t组可显著降低荷瘤小鼠脾指数k Π s1sxl ∀ ≈猫眼草各组对荷瘤小鼠血液系统无影响 ∀ …流式细胞仪检
测猫眼草 vs oys ª#®ªp t组可使 ¨º¬¶肺癌组织肿瘤细胞 ≥ 期细胞比例增高 o凋亡率分别为kty1wv ? t{1y|l h o
kuw1vz ? tx1w{l h o与模型组相比有显著性差异k Π s1sxl ∀   ט‘∞法测定猫眼草 vs oys ª#®ªp t组的凋亡指数
k„Œl分别为kw1ss ? z1txl h okx1|v ? x1|yl h ~ys ª#®ªpt与模型组相比有显著性差异 o有明显诱导细胞凋亡的作用
k Π s1stl ∀结论 }猫眼草可抑制 ¨º¬¶肺癌生长 o对小鼠血液系统无明显毒副作用 o其抗肿瘤作用与诱导细胞凋亡
有关 ∀
≈关键词  猫眼草 ~¨º¬¶肺癌 ~免疫调节 ~细胞周期 ~细胞凋亡
≈中图分类号  • u{x1x ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussyltu2tssu2sw
≈收稿日期  ussx2s|2tu
≈通讯作者  3 张春玲 oר¯ }ksxvul{w|ytzwu o ∞2°¤¬¯}¼¼xyzz ƒ
tyv q¦²°
猫眼草又名泽漆 o是大戟科植物猫眼草的全草 o
性微寒 o味苦 o有毒 o入肺 !肝经 o生长在山坡草地 o价
格低廉 ∀在中国民间 o已经有用猫眼草组方来治疗
癌症 o如纵隔肿瘤 !食道癌及乳腺肿瘤等≈t  o猫眼草
全草化学成分含黄酮类成分 !猫眼草素 !山柰酚 !槲
皮素 !山柰酚2v2单2Λ2鼠李糖苷及槲皮素2v2单2Λ2鼠
李糖苷 o还含有甾醇 !挥发油 !酚类物质 !有机酸及蜡
质等 ∀有祛寒 !镇咳 !平喘 !拔毒止痒 !利尿消肿 !散
结 !杀虫之功 ∀在外用药中 o猫眼草有抗菌 !抗病毒
作用 o用于淋巴结结核 !皮癣 !灭蛆 ∀近年对猫眼草
及其提取物进行抗肿瘤作用研究 ∀本实验旨在研究
中药猫眼草有无抗肺癌作用 o并推测其作用机制 ∀
1 材料和方法
111 药物 !试剂及仪器
猫眼草全草购自青岛同仁堂大药房 o产地江苏 o
批号 sws|st o北京京兴中药饮片厂生产 ∀
猫眼草水提物的制备 }猫眼草生药 xss ª加水
x sss °煮沸 us °¬± u次 ow层纱布过滤后 o浓缩至
xss °o制成口服液 o每 t °含生药 t1s ªo高压蒸
汽杀菌后 o于 w ε 冰箱中贮存备用 ∀
顺铂注射液k⁄⁄° oƒ ‹ ƒ¤∏¯§¬±ª i ≤²1·§1·µ¤§¬±ª
¤¶⁄¤√¬§…∏¯¯ ¤¥o批号 ‘uut{{tl o细胞凋亡测试盒
k•²¦«¨ 公司l oƒ„≤≥²µ·流式细胞仪k美国 …⁄公司l ∀
112 方法
11211 动物 ≤xz…ry纯系小鼠 o雄性 oy ∗ {周龄 o
kus ? ul ªo军事医学科学院实验动物中心提供 ~动
物许可证号 }医动字第 ≥≤÷Ž京 ussw2ssst ∀
11212 瘤株 ¨º¬¶肺癌 o由中国医学科学院基础
医学研究所引进 o青岛海洋大学海洋药物与食品研
究所传代保种 ~¨º¬¶肺癌维持在 ≤xz …ry 小鼠体
内 o每 u周传代 t次 ∀
11213 动物分组 取 ≤xz…ry小鼠 o随机分为空白
对照组 !模型组 !猫眼草 z1x otx ovs oys ª#®ªpt组及顺
铂组k⁄⁄° ot °ª#®ªptl o每组 ts只 ∀
11214 荷瘤动物模型的建立 取传代后 tw §的
¨º¬¶肺癌瘤源小鼠 o颈脱臼处死 o固定于鼠板上 o常
规消毒 o于超净工作台中 o从腋部皮下剥取肿瘤组
#usst#
第 vt卷第 tu期
ussy年 y月
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1vt oŒ¶¶∏¨ tu
∏±¨ oussy
织 o剔除纤维包膜和坏死组织 o在无菌平皿中剪碎 o
置组织研磨器中加 w ε 生理盐水 o轻轻研磨过滤 o制
成瘤细胞悬液 ∀s1w h 台盼蓝计数 o细胞活力大于
|x h o调整细胞为 t ≅ tsz#°pt ∀除空白对照组外 o
其他各组小鼠均于右腋部皮下注射上述瘤细胞悬液
s1u °∀以建立模型 ∀
11215 给药方法 从接种肿瘤次日开始猫眼草水
题物各组灌胃给药 o连续 tu §~顺铂组每日腹腔注射
给药 t次 o连续 z §∀每天观察小鼠饮食及肿瘤生长
情况 ∀末次灌胃给药后 uw «o小鼠称重 o处死 ∀
113 观察指标与测定方法
抑瘤率 }末次给药后 uw «将小鼠称重 o断颈处
死 o剥取瘤块称重 ∀
抑瘤率k h l € k模型组平均瘤重 p治疗组平均瘤重lr模
型组平均瘤重 ≅ tss h
胸腺指数 }全部小鼠处死后 o取小鼠胸腺组织 o
称重 o计算胸腺指数 ∀
胸腺指数 €胸腺重r体重k°ªrªlk体重为小鼠体重减去
瘤重后的差值l
脾指数 }取小鼠脾脏 o称重 o计算脾指数 ∀
脾指数 €脾重r体重k°ªrªlk体重为小鼠体重减去瘤重
后的差值l
静脉血细胞分析 }取小鼠称重后摘去眼球取血 o
用 v1{ h枸橼酸钠 tΒ|抗凝 o充分混匀 o应用血细胞
分析仪进行血细胞分析 ∀记录数据 o分析 ∀
细胞周期分析 }组织固定 }瘤体剥离称重后 o取
少许瘤组织 o用 zx h冷乙醇固定 ~在 uss目不锈网上
搓成单细胞悬液 ~低速离心k{ss µ#°¬±pt ov °¬±l°…≥
洗涤 u ∗ v遍 o取碎片 ~调细胞数在 t ≅ tsy左右 ~离心
kt sss µ#°¬±pt ox °¬±l ~细胞沉淀中加入 °Œkxss Λª#
°ptluss ˏow ε 避光染色 vs °¬±~wss目不锈网过
滤 ~上机测定 ∀
瘤组织肿瘤细胞凋亡的测定 }瘤体剥离称重后 o
用 ts h中性福尔马林固定 w{ «~将固定的瘤体于自
动脱水机中脱水 uw «~将载玻片置于 ts h硝酸中浸
泡uw «o用清水及 |x h 乙醇冲洗 !擦干 o浸入 u h
„°∞≥丙酮溶液 vs ¶o然后在纯丙酮中涮一下晾干备
用 ~用石蜡包埋剂将脱水后的标本制成蜡块 ~组织切
片机将制成标本的蜡块切成 w Λ°的切片 o室验前 tu
«置于恒温培养箱中烘烤代用 ~石蜡切片脱蜡 ~v h
‹u’u室温孵育 ts °¬±o去除内源性过氧化物酶 ∀ °…≥
冲洗 u °¬±ov 次 ~滴加 s1t h ×µ¬·²± ÷2tss ow ε ou
°¬±o°…≥冲洗 u °¬±ov次 ~滴加 xs ˏ×∏±¨ ¯反应液 o
vz ε 孵育 t «o°…≥冲洗 u °¬±ov次 ~滴加 °’⁄xs ˏo
vz ε 孵育 t «o°…≥冲洗 u °¬±ov次 ~显色 }滴加 xs ˏ
⁄„…显色 o镜下控制显色时间 o待阳性部位着色而
背景无着色时终止反应 o蒸馏水冲洗 ~苏木素复染 !
脱水 !透明 !封片 ∀
结果判断 }凋亡细胞胞核被染成棕黄色 ∀随机
选取 ts个高倍镜视野 o计数 t sss个肿瘤细胞中的
阳性细胞数 ∀由 u名病理科医师双盲计数 ∀
114 统计学处理
所有数据均以 cξ ? σ表示 o采用 ≥°≥≥tt1x软件 o
组内差异用方差分析 o组间差异用配对 τ检验 ∀
2 结果
211 猫眼草对小鼠 ¨º¬¶肺癌的抑瘤作用
猫眼草在 z1x otx ovs oys ª#®ªpt的剂量下连续灌
胃给药 tu §o结果显示对小鼠体内 ¨º¬¶肺癌生长具
有不同程度的抑制作用 o并随剂量的增加而增高 o生
长 抑 制 率 分 别 为 s1yt h o ty1|v h o vu1{t h
k Π s1sxl ox{1uy h k Π s1sstl ∀阳性药k顺铂组 ot
°ª#®ªptl腹腔内连续注射 z §后对小鼠体内 ¨º¬¶
肺癌生长抑制率为 ys1|| h k Π s1sstl o猫眼草 ys ª
#®ªpt组抑瘤率与顺铂组相比无显著性差异k表 tl ∀
表 t 猫眼草体内对小鼠体内 ¨º¬¶肺癌生长
的影响kcξ ? σ, ν € tsl
组别 剂量rª#®ªpt 瘤重rª 抑瘤率r h
模型 p t1{{x ? s1xxx p
猫眼草 z1x t1{|y ? s1xzu s1yt
tx t1xyy ? s1vyx ty1|v
vs t1uyz ? s1y{|tl vu1{t
ys s1z{y | ? s1wuv wul x{1uy
顺铂 s1sst s1zvx v ? s1u|z {ul ys1||
注 }与模型组比较tl Π s1sx oul Π s1sst
212 猫眼草对小鼠免疫器官的影响
小鼠连续灌胃给药 tu §后 o处死 o取胸腺及脾
脏称重 o计算脾指数及胸腺指数 ∀结果显示模型组
较空白对照组脾指数增大k Π s1sxl o猫眼草各组
均可降低荷瘤小鼠的脾指数 o其中 ys ª#®ªpt组与模
型组相比有显著性差异k Π  s1sxl ~荷瘤小鼠胸腺
指数较空白对照组下降 o但无显著性差异 o猫眼草
z1x ª#®ªpt组胸腺指数较模型组升高 o其余猫眼草各
组胸腺指数均降低 o但无显著性差异 ∀顺铂组可显
著降低荷瘤小鼠脾指数及胸腺指数k Π s1sstlk表
ul ∀
#vsst#
第 vt卷第 tu期
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1vt oŒ¶¶∏¨ tu
∏±¨ oussy
表 u 猫眼草灌胃给药对小鼠免疫器官重量的影响kcξ ? σl
组别
剂量
rª#®ªpt
脾脏指数
r°ª#ªpt
胸腺指数
r°ª#ªpt
空白 p v1x{z ? u1t|w t1wtt ? s1{y{
模型 p tv1wvx ? t1{x|tl t1tsz ? s1v|v
猫眼草 z1x tu1u|t ? u1vy| t1uv{ ? s1xut
tx tu1wsz ? u1xuu t1syv ? s1{ut
vs tt1{vw ? u1vwzw s1{zs | ? s1vys y
ys {1|ts || ? v1||v v{ul s1{{s zw ? s1wut tz
顺铂 s1sst w1wts | ? s1ztxuvl s1xts { ? s1uy| xvl
注 }与空白组比tl Π s1sst ~与模型组比ul Π s1sx ovl Π s1sst
213 猫眼草对小鼠血液系统的影响
小鼠连续灌胃给药 tu §后 o取小鼠称重后摘取
眼球取血行血细胞分析 o结果荷瘤小鼠 • …≤较空白
组增高 o相比有显著性差异k Π s1sxl o顺铂组 • …≤
与空白组相比无显著性差异 ∀各荷瘤小鼠组 • …≤ o
°·o‹¥均较空白组减低 o统计有显著性差异 ~各猫
眼草组与模型组小鼠的 • …≤ o• …≤ o°·o‹¥比较无
显著性差异 ~顺铂组 • …≤ 较模型组明显降低 o统计
有显著性差异k Π s1stlk表 vl ∀
表 v 猫眼草灌胃给药对小鼠血液系统的影响kcξ ? σ, ν € tsl
组别 剂量rª#®ªpt • …≤r ≅ tstu#pt • …≤r ≅ ts|#pt °·r ≅ ts|#pt ‹¥rª#pt
空白 p z1vx ? s1wu x1yx ? t1u{ z{x quu ? tzs1sw tvs1tt ? y1|x
模型 p w1ss ? s1z{ tw1sv ? y1yt v|w1vz ? tsu1|y zy1{| ? tu1uu
猫眼草 z1x v1z{ ? s1vs tv1sy ? w1|s v{{1{s ? |z1ys zx1us ? w1yy
tx w1t{ ? t1t{ ts1|v ? v1|{ vz{1{ ? txy1|| {s1ss ? t{1sz
vs w1v| ? t1wy ts1zz ? u1{t xvz1{ ? ttu1xx {y1ys ? uy1xx
ys w1yv ? t1ty tw1ts ? x1yy vzs1{z ? t{w1xs {x1z{ ? t{1tw
顺铂 s1sst w1xu ? t1ts z1sx ? u1vttl wz{1|s ? ttz1yv {u1ws ? us1sz
注 }与模型组比较tl Π s1stk表 x同l
214 流式细胞仪检测 ¨º¬¶肺癌组织的细胞周期及
凋亡率
猫眼草 vs oys ª#®ªpt组和顺铂组的细胞在 ≥期
的比例增高 oŠs2Št期的比例降低 o猫眼草 Šu2 期的
比例变化不大 o而顺铂组 Šu2 期比例增高 o猫眼草
对 ¨º¬¶肺癌细胞周期的影响是使肿瘤细胞 Šs2Št
期细胞减少 o细胞阻滞在 ≥期 o并诱导部分肿瘤细胞
凋亡k表 wl ∀
表 w ¨º¬¶肺癌组织的细胞周期变化及凋亡率k ν € tsl
组别
剂量
rª#®ªpt
Šs2Št ≥ Šu2
凋亡率
r h
模型 p xy quz vs q{z tu q{x t qt|
猫眼草 z qx uz qv{ tw qvw x{ qu{ | qww
tx u{ q{z ut qvw w| qz| tx qw|
vs vv qwu x{ qsx { qxw ty qwv
ys u| q|| xy qst tw uw qvz
顺铂 s qsst uu qsw wx q{u vu qtw tx qx{
215 猫眼草对小鼠 ¨º¬¶肺癌的细胞凋亡的影响
用 ט‘∞法检测不同剂量的猫眼草在体内诱
导细胞凋亡的作用发现 o猫眼草 ys ª#®ªpt组与顺铂
组有明显的诱导细胞凋亡的作用k Π s1stlk表 xl ∀
3 讨论
有报道有用大剂量猫眼草治疗早期弥漫性肝癌
取得了满意的疗效≈u  o而对泽漆根水提物进行体外
及体内抗肿瘤作用研究 o发现泽漆根水提物体外有
直接细胞毒作用 o并与时间 !剂量呈正相关≈v  ~在体
表 x 猫眼草体内对小鼠 ¨º¬¶肺癌细胞
凋亡的影响kcξ ? σ, ν € tsl
组别 剂量rª#®ªpt 凋亡指数r h
模型 p s qz| ? t qys
猫眼草 vs w qss ? z qtx
ys x q|v ? x q|ytl
顺铂 s qsst z qsz ? ts qtxtl
内不仅能抑制体内肿瘤生长 o还发现其降低荷瘤小
鼠的脾指数使其接近正常组 o升高荷瘤小鼠的胸腺
指数 o但仍低于正常组 o有提高机体免疫能力的作
用≈w  o说明泽漆根能抑制肿瘤生长 o且其中有调节机
体免疫力的成分 ∀本研究发现 o不同剂量的猫眼草
可不同程度地降低荷瘤小鼠的脾脏指数 o并随剂量
的增加而逐渐降低 o逐渐接近空白对照组脾脏指数 ~
低剂量猫眼草可升高荷瘤小鼠胸腺指数 o但剂量加
大后胸腺指数降低 o考虑可能与猫眼草毒性作用有
关 o与蔡鹰的试验结果基本相符 ∀但本实验样本量
较小 o且未对小鼠细胞免疫功能进行进一步的研究 o
所以不能确定猫眼草对免疫的调节是完全的抑制 o
也可能是双向 !整体的调节 o需行进一步探讨 ∀
猫眼草对荷瘤小鼠血液系统的影响未见有文献
报道 ∀本研究发现 o各荷瘤小鼠组的 • …≤较空白组
升高 o除顺铂组与空白组相比无显著性差异外 o其余
各组统计均有显著性差异k Π s1sxl ~而 • …≤ o°·o
‹¥均较空白组降低 k Π  s1stl o猫眼草各组的
• …≤ o• …≤ o°·及 ‹¥与模型组相比无显著性差异 o
#wsst#
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顺铂组 • …≤较模型组 • …≤ 有明显下降 o两组相比
有显著性差异k Π s1stl o符合应用杀伤性药物顺
铂的毒副作用 ∀由此可见 o荷瘤小鼠血液系统的变
化与接种肿瘤的外来刺激有关 o与猫眼草的应用无
关 o即猫眼草对小鼠的血液系统无明显杀伤作用 ∀
近年的研究表明≈x  o细胞周期失控是细胞增殖
失控而导致癌变的重要原因 ∀细胞周期调控与细胞
周期不同时相kŠt o≥ oŠu ol间存在的关键调控点
k¦«¨¦®³²¬±·l密切相关≈y  o其中最重要的调控点是
Štr≥调控点 ∀细胞在该点分析细胞内 !外的各种复
杂信号以及 ⁄‘„损伤情况 o以决定细胞是进入分裂
程序 !处于静止的 Šs期或诱发细胞凋亡 ∀本实验流
式细胞仪研究显示 o猫眼草 vs oys ª#®ªpt组对肿瘤
细胞的细胞周期有影响 o使 Šs2Št期细胞比例减少 o
≥期增多 o与模型组相比有显著性差异k Π s1sxl o
被称此为增殖性凋亡≈z o{  ∀作者在实验中将瘤块固
定石蜡包埋切片 o采用 vχ2’‹末端 ט‘∞标记法观
察猫眼草在体内对小鼠肺癌的细胞凋亡的影响 ∀结
果发现 o猫眼草 ys ª#®ªpt组小鼠肿瘤的凋亡指数较
荷瘤对照组有显著性差异k Π s1stl o提示猫眼草
可通过诱导细胞凋亡而发挥其抗癌作用 ∀虽然诱发
凋亡的分子机制还不十分清楚 o但诱导肿瘤细胞凋
亡已成为治疗肿瘤的新靶点 ∀
总之 o本实验发现猫眼草对 ¨º¬¶肺癌有明显
的抑制作用 o且提示猫眼草抑制肺癌的作用随剂量
的增加而增高 o有一定的免疫调节作用 o并对小鼠血
液系统无明显毒副作用 o且有诱导细胞凋亡的作用 o
为其应用于临床提供了实验基础 ∀
≈参考文献 
≈t  宋洪恩 o张秀贞 o周艳丽 q三子三仁汤及华蟾猫眼草治疗纵隔
肿瘤 vv例疗效观察 q中国综合医学杂志 oussv otykz2{l }yw1
≈u  高志良 q大剂量泽漆为主治疗早期肝癌 q江苏中医 ot||z ot{
kul }u{1
≈v  蔡 鹰 o王 晶 o梁秉文 q泽漆根体外抗肿瘤实验研究 q中药
材 ot||| ouukul }{x1
≈w  蔡 鹰 o陆 瑜 o梁秉文 q泽漆根体内抗肿瘤作用研究 q中药
材 ot||| ouukttl }xz|1
≈x  ‹¤µµ¬¶„ • o…²§µ∏ª≥ ∞o• ¤µ±¨ µ…oετ αλ. ≤¼¦¯¬± ⁄t ¤¶·«¨ ³∏·¤·¬√¨
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≈z  邹 跃 o周云峰 o刘开均 o等 q放射线诱导肺腺癌细胞增殖凋
亡 q肿瘤防治研究 ot||| ouykyl }wyx q
≈{  季宇彬 o张广美 q中药抗肿瘤有效成分药理与应用 q哈尔滨 }
黑龙江科学技术出版社 ot||{1vvt q
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°¬¦¨ ¥¯²²§¶¼¶·¨° ¤±§·«¨ ©¨©¨¦·°¬ª«·¥¨ ¤¶¶²¦¬¤·¨§º¬·«¬±§∏¦·¬²± ²©¤³²³·²¶¬¶²± ¦¤±¦¨µ¦¨¯¯¶q
[ Κεψ ωορδσ] ¦µ¨¶¦¨±·¨ ∏³«²µ¥¬¤~¨º¬¶ ∏¯±ª¦¤±¦¨µ~¬°°∏±²µ¨ª∏¯¤·¬²±~¦¨¯¯ ¦¼¦¯¨~¤³²³·²¶¬¶ ≈责任编辑 刘  
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