全 文 ：·专题报道·
杨梅树皮氯仿萃取物抗小鼠 Lewis肺癌的实验研究
童晔玲，戴关海，任泽明，陈 璇，杨 锋
(浙江省中医药研究院·浙江 杭州 310007)
摘 要 目的:观察杨梅树皮氯仿萃取物对 C 57BL /6J 小鼠 Lewis 肺癌的抑制作用及对肿瘤坏死因子
(TNF － α)、基质金属蛋白酶 － 9(MMP －9)、基质金属蛋白酶抑制剂 － 1(TIMP － 1)表达的影响。方法:建
立 C 57BL /6J小鼠 Lewis肺癌模型，分别设杨梅树皮氯仿萃取物高剂量组(13. 2g 生药 /kg)、中剂量组
(6. 6 g生药 /kg)、低剂量组(3. 3 g 生药 /kg)、环磷酰胺(CTX)阳性对照组(30 mg /kg × 3)及模型对照组
(水 30 mL /kg) ，给药 12 天后处死动物，称瘤重，计算抑瘤率(%) ;ELISA 法测定血清 TNF － α、MMP － 9、
TIMP － 1 含量。结果:杨梅树皮氯仿萃取物对 C57BL /6J 小鼠 Lewis 肺癌有一定的抑制作用，抑瘤率在
16. 3% ～ 41. 6%，其中高、中剂量组的瘤重与模型组比较有显著性差异(P ＜ 0. 05 ～ 0. 01) ;同时能明显增
高血清 TNF － α、TIMP － 1 表达，降低 MMP －9 表达。结论:杨梅树皮氯仿萃取物对 C 57BL /6J小鼠 Lewis
肺癌有较好的抑制作用，且能上调 TNF － α、TIMP － 1 表达，下调 MMP －9 表达。
关键词 Lewis肺癌;@杨梅树皮氯仿萃取物;TNF － α;MMP －9;TIMP － 1;小鼠
Inhibition Effect of Chloroform Extracts from Yangmei(Myrica Ｒubra)
Bark on Lewis Lung Cancer of Mice
TONG Yeling，DAI Guanhai，ＲEN Zeming，CHEN Xuan，YANG Feng
(Institute of Traditional Chinese Medicine in Zhejiang Province，Hangzhou，Zhejiang 310007)
ABSTＲACT Objective:To observe the effect of chloroform extracts from Myrica rubra bark on Lewis lung
cancer of mice and impact on TNF － α，MMP －9，TIMP － 1 expressions．Methods:Lewis lung cancer models of
C57BL /6J mice were established． Mice were divided into five groups:high(13． 2 g /kg) ，middle(6． 6 g /kg)
and low(3． 3 g /kg)dose of chloroform extracts from bark of Myrica rubra，CTX group(30 g /kg × 3)and model
group(H2O 30 mL /kg)． Mice were sacrificed after 12 days． According to the final tumor weight，the inhibition
rate was calculated． The expressions of TNF － α，MMP － 9 and TIMP － 1 were inspected by ELISA method．
Ｒesults:Chloroform extracts from bark of Myrica rubra had certain inhibitory effect on Lewis lung cancer in mice
and the inhibition rate was between 16． 3% to 41． 6% ． The tumor weight of high and middle dose groups were
smaller than that of model group (P ＜ 0． 05 ～ 0． 01)． Chloroform extracts can also significantly increase the ex-
pressions of TNF － α and TIMP － 1，decrease the expression of MMP － 9． Conclusion:Chloroform extracts from
bark of Myrica rubra had good inhibitory effect on Lewis lung cancer in C57BL /6J mice，and can also increase
the expression of TNF － α and TIMP － 1，lower the expression of MMP － 9．
Key words:Lewis cancer;@ chloroform extract from Myrica rubra bark;TNF － α;MMP －9;TIMP － 1;mouse
基金项目:浙江省科技厅项目(2011F20009，2013F50020)
通信作者:杨锋，E － mail:88082214@ 163． com
杨梅(Myrica rubra Sieb. et Zucc)系杨梅科杨梅属植物，
有较好的药用和食用价值。杨梅树皮味苦、性温，含有黄酮
类、环状二芳基庚烷类、单宁类、三萜类等多种化合物［1］，具
有抗病毒、抗菌、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等活性［2 － 3］。前期研
究发现，各杨梅树皮提取物对 A549细胞均有较好的抑制作
用，其中杨梅树皮醇提物和氯仿萃取层部位对人肺腺癌 A549
的抑制作用最明显，抑制率分别为 3. 5% ～ 97. 0%、38. 7% ～
99. 4%，并且具有较好的量效关系［2］。本研究将观察杨梅树
皮氯仿萃取物对 C 57BL /6J小鼠 Lewis肺癌的抑制作用。
1 材料
1. 1 药物 杨梅树皮:浙江省永嘉县潘坑森森农业开发场
提供;杨梅树皮氯仿萃取物的制备:取干燥清洁的杨梅树皮
药材 1 000g，剪碎，置于蒸馏烧瓶中，加 3 000 mL80%乙醇，
80 ℃水浴回流提取 2 次，每次 2 小时，合并 2 次提取液，过
滤，滤液减压浓缩，回收乙醇，干燥，得醇提物。醇提物加水
热溶后用 1. 6 倍量氯仿萃取 2 次，合并萃取液，分别于旋转
蒸发仪上 80 ℃回收溶剂，真空减压干燥至恒重，得氯仿萃取
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物。1 000g杨梅树皮中氯仿萃取物的量为 26. 6 g，即杨梅树
皮氯仿萃取物的得率为 2. 66%。注射用环磷酰胺(CTX) :
山西普德药业股份有限公司生产，0. 2 g /支，批号:04121001。
1. 2 动物及瘤株 C 57BL /6J 小鼠，清洁级，雌性，体质量
18 ～ 22 g，由上海斯莱克实验动物中心提供，动物合格证号:
2007 － 000539595，饲养于浙江省中医药研究院实验动物房
内，实验动物使用许可证:SYXK(浙)2009 － 0122。小鼠
Lewis肺癌瘤株:中科院上海药物所引进，本实验室液氮
保存。
1. 3 试剂 无水乙醇、氯仿:均为分析纯，由成都市科龙化
工试剂厂生产;小鼠 TNF － αELISA 试剂盒、小鼠 MMP － 9
ELISA试剂盒、小鼠 TIMP － 1 ELISA 试剂盒:均由武汉博士
德生物工程有限公司生产。
2 方法
2. 1 模型制备及分组给药 取生长良好的 Lewis 肺癌小鼠
2 只，剥取瘤块，匀浆制成 1 × 107·mL －1浓度的细胞悬液，分
别接种于 50 只雌性 C 57BL /6J 小鼠的右腋皮下，0. 2 mL /
只。次日随机分组、称重。设杨梅树皮氯仿萃取物高剂量组
(13. 2 g生药 /kg)、杨梅树皮氯仿萃取物中剂量组(6. 6 g 生
药 /kg)、杨梅树皮氯仿萃取物低剂量组(3. 3 g 生药 /kg)、环
磷酰胺(CTX)阳性对照组(30 mg /kg × 3)及模型对照组(30
mL /kg) ，除 CTX阳性对照组在实验第 3、6、9 天腹腔注射外，
其余各组动物每天 1 次，连续灌胃 12 天。
2. 2 观察指标测定
2. 2. 1 瘤重及抑瘤率测定 停药次日处死动物，剥取实体
瘤称瘤重，计算抑瘤率(%)。
2. 2. 2 血清 TNF － α、MMP －9、TIMP － 1 含量测定
停药次日，股动脉取血，分离血清，用 ELISA法测定 TNF
－ α、MMP －9、TIMP － 1 含量。具体操作如下:稀释血清及
标准品分别加入到酶标板中，37 ℃反应 90min;弃去酶标板
中液体，加入生物素标记抗体，37 ℃反应 60min，0. 01M TBS
洗涤 3 次;加 ABC，37 ℃反应 30min，0. 01M TBS 洗涤 5 次;
加入 TMB，37 ℃反应 20 ～ 30min;加入 TMB 终止液，用酶标
仪在 450 nm测定 OD值，根据标准曲线求得 TNF － α、MMP
－9、TIMP － 1 含量。
2. 3 统计方法 采用 SPSS17. 0 版统计软件进行单因素方
差分析。
3 结果
3. 1 各组小鼠瘤重及抑瘤率测定 结果见表 1。
表 1 各组小鼠体质量、瘤重和抑瘤率的测定(x ± s)
组别
动物数
(只)
初始体质量
(g)
终末体质量
(g)
瘤重
(g)
抑制率
(%)
模型组 10 18. 7 ± 0. 39 21. 5 ± 1. 09 2. 552 ± 0. 478 －
CTX 10 18. 7 ± 0. 76 20. 4 ± 1. 41* 0. 305 ± 0. 192＊＊ 88. 0
萃取物低剂量 10 18. 9 ± 0. 58 21. 6 ± 1. 44 2. 135 ± 0. 546 16. 3
萃取物中剂量 10 18. 9 ± 0. 59 22. 2 ± 1. 54 1. 893 ± 0. 845* 25. 8
萃取物高剂量 10 18. 8 ± 0. 40 21. 2 ± 1. 14 1. 489 ± 0. 771＊＊ 41. 6
与模型组比较* P ＜0. 05，＊＊P ＜0. 01
3. 2 各组小鼠血清 TNF － α、MMP －9、TIMP － 1 含量测定
结果见表 2。
表 2 各组小鼠 TNF － α、MMP －9、TIMP － 1 表达测定(x ± s，n = 10)
组别
动物数
(只)
TNF － α
(ng /L)
MMP －9
(μg /L)
TIMP － 1
(ng /L)
模型组 10 15. 4 ± 5. 40 16. 6 ± 1. 41 105. 7 ± 30. 23
CTX 10 8. 2 ± 4. 79* 15. 0 ± 1. 47 113. 4 ± 28. 75
萃取物低剂量 10 14. 9 ± 7. 61 15. 5 ± 2. 26 101. 0 ± 36. 53
萃取物中剂量 10 19. 0 ± 4. 01 14. 7 ± 2. 19* 113. 1 ± 26. 12
萃取物高剂量 10 23. 8 ± 6. 50＊＊ 14. 3 ± 1. 75* 111. 0 ± 24. 54
与模型组比较* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01
4 讨论 杨梅树皮资源在我国极为丰富，经过修剪丢弃的
杨梅树枝可做为长期大量的植物来源。杨梅树皮味苦、性
温，具有散瘀止血、止痛之功效，民间用于治疗跌打损伤、骨
折、痢疾、胃和十二指肠溃疡、牙痛等［4］。现在药理研究证
实，杨梅树皮提取物具有多种生物学活性，其中抗肿瘤活性
是一大亮点。徐容容等［5］发现杨梅素、杨梅苷对人肝癌细
胞(HepG2)、人膀胱癌细胞(YTS － 1)、小鼠黑色素瘤细胞
(B16)、人前列腺癌细胞(PC － 3)等均有良好的抑制作用和
诱导肿瘤细胞凋亡作用。张莉静等［6］报道杨梅树皮提取物
及其大孔吸附树脂洗脱物、杨梅素单体化合物体外对人宫颈
癌 HeLa细胞、人黑色素瘤 A375 － S2 细胞、人乳腺癌 MCF －
7细胞和人肝癌 HepG2 细胞均具有明显的细胞毒作用，杨梅
素明显抑制 HeLa 细胞的增殖，通过激活 Caspase 途径诱导
HeLa细胞调亡。
本研究结果表明杨梅树皮氯仿萃取物对 C 57BL /6J 小
鼠 Lewis肺癌有较好的抑制作用，且能明显增高血清 TNF －
α、TIMP － 1 表达，降低 MMP － 9 表达。TNF － α、MMP － 9、
TIMP － 1 是与肿瘤生长密切相关的蛋白。TNF － α有广泛的
生物学活性，其抗肿瘤作用显著，能使血管丰富的肿瘤发生
明显坏死和生长抑制，对癌细胞有增殖抑制和细胞毒作
用［7 － 8］。MMPs是降解细胞外基质(ECM)最重要的酶类，
MMP －9 是 MMPs中分子量最大的酶，可降解 ECM 及基底
膜的主要结构蛋白 IV 型胶原，还能降解Ⅰ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ型
胶原以及纤连蛋白和层粘连蛋白，因而被认为几乎可降解
ECM的所有成分，从而促进癌细胞浸润血管基底膜并向周
围正常组织侵袭，与肿瘤的扩散和转移密切相关，MMP － 9
增高可促进肿瘤转移［9 － 10］。TIMP － 1 作为 MMP － 9 抑制剂
则与肿瘤转移负相关。本实验结果表明杨梅树皮氯仿萃取
物有较好的抗肺癌活性，可能通过上调 TNF － α、TIMP － 1 表
达，下调 MMP －9 表达来延缓肺癌细胞的生长和转移。该研
究结果将为杨梅树皮抗肺癌的临床应用提供实验依据，亦为
杨梅树皮资源的可持续开发利用提供新途径。
参考文献
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2013，16(11) :567 － 571．
(收稿日期:2014 － 09 － 12)
杨梅醇对 A549、HL － 60 和 HepG2 细胞增殖
抑制作用的实验研究
戴关海1，2，童晔玲1，任泽明1，陈 璇1，杨 锋1
(1 浙江省中医药研究院基础实验研究所·杭州 310007;2 浙江省中西医结合肿瘤诊治重点实验室·杭州 310012)
摘 要 目的:观察杨梅醇体外对人肺腺癌 A549、人早幼粒白血病 HL － 60 及人肝癌 HepG2 细胞的抑制作
用。方法:用3H － TdＲ掺入法观察杨梅醇体外对 A549、HL － 60 及 HepG2 细胞的抑制作用，用倒置显微镜
观察细胞形态学改变。结果:杨梅醇对 A549、HL － 60 及 HepG2 细胞均有很好的抑制作用，并且具有较好
的量效关系。结论:杨梅醇具有很强的抗肿瘤作用。
关键词 杨梅醇;A549细胞;HL － 60 细胞;HepG2 细胞;体外研究
Inhibition Effects of Myricanol on A549，HL － 60 and HepG2 Proliferation
DAI Guanhai1，2，TONG Yeling1，ＲEN Zeming1，CHEN Xuan，YANG Feng1
(1 Institute of Basic Medicine，Zhejiang Academy of TCM，Hangzhou 310007;2Key Laboratory of Traditional
Chinese and Western Medicine in Cancer Prevention and Treatment Technology Ｒesearch，Hangzhou 310007)
ABSTＲACT Objective:To observe the inhibition effects of Myricanol on proliferation of human lung adenocar-
cinoma A549 cells，human acute myeloid leukemia HL － 60 cells and human Hepatic carcinoma HepG2 cells in
vitro． Methods:Sensitivity test of 3H － TdＲ incorporation assay was used to detect the inhibition effects of Myri-
canolon on A549 cells，HL － 60 cell and HepG2 cell in vitro． The cell morphology was observed using an inverted
microscope． Ｒesults:Myricanol had good inhibition effect on proliferation of A549 cell，HL － 60 cell，and HepG2
cell． and also had a dose － dependent manner． Conclusion:Myricanol had good effect on resisting tumor．
Key words:Myricanol;A549 cell;HL － 60 cell;HepG2 cell;in vitro
基金项目:浙江省科技厅项目计划资助(2011F20009，2013F50020)
杨梅［Myrica ruba(Lour．)Sieb． et Zucc．］系杨梅科
(Myricae)杨梅属(Myrica)植物，常绿乔本，为我国特产水
果，栽培面积占全球的 99%以上，地理大致分布在北纬18°
～ 33°之间，但经济栽培主要集中在东南沿海的浙江、江苏、
福建、广东、江西等省。杨梅树皮味苦、性温，具有抗病毒、抗
炎、抗氧化、清除自由基、免疫调节及抗雄激素活性及抗过敏
等功能［1 － 2］。笔者在进行抗肿瘤药物筛选时，发现杨梅醇具
有很好的抗肿瘤作用［3］，现将杨梅醇对不同肿瘤细胞的抑
制作用结果报道如下。
1 实验材料
1. 1 实验药物 杨梅醇:纯度 98. 2%，由浙江省中医药研
究院中药研究中心制备。
1. 2 实验试剂 IMDM培养液(批号:13062502，用于 HL －
60 细胞株的培养)、ＲPMI － 1640 培养液(批号:12091204，用
于 A549 及 HepG2 细胞株的培养)、PBS 缓冲液(批号:
13022001)、0. 25%胰蛋白酶(批号:11090901) :均购于吉诺
·25· 中国中医药科技 2016 年 1 月第 23 卷第 1 期 Jan. 2016 Vol. 23 No. 1