全 文 ：过同样生长时间的扦插石牌广藿香，并比生长了１０
个月的扦插广藿香还高０７倍，因此，尽管组培的广
藿香挥发油中的广藿香酮含量没有扦插繁殖的高，
但按每克干重生药计算，还是组培的石牌广藿香中
所含的广藿香酮和醇最高。植物组织培养技术应广
泛应用到药用植物的生产中，有人认为组织培养获
得的再生植株中，次生代谢物的含量可能会减少，而
本研究的结果显示，组织培养技术所提供的石牌广
藿香不仅保留了原植物的形态特点，还提高了其中
的次生代谢物含量，组培石牌广藿香中每克干重生
药中的广藿香酮和广藿香醇的含量约为扦插繁殖的
４倍，从栽培生产上来说，组培苗比传统的扦插苗具
有更高的经济效益。
［参考文献］
［１］ 中国药典［Ｓ］．一部．２０００：３３．
［２］ 罗集鹏，刘玉萍，冯毅凡，等．广藿香的两个化学型及产地与采
收期对其挥发油成分的影响［Ｊ］．药学学报，２００３，３８（４）：３０７．
［３］ 李 薇，潘超美，徐 良，等．不同产地广藿香特征的观察和比
较［Ｊ］．中药材，２００２，２５（７）：４６３．
［４］ 罗集鹏，曾梅华．广藿香的形态组织学鉴别研究［Ｊ］．中药材，
２００２，２５（３）：１６６．
［５］ 张家明，郑学勤，孙雪飘．广藿香体细胞培养植株再生的研究
［Ｊ］．热带作物学报，１９９４，１５（１）：７３．
［６］ 汪小根，邹玉繁，王玉生．ＧＣＭＳ联用技术测定广藿香油中广
藿香酮的含量［Ｊ］．药物分析杂志，２００５，２５（５）：５８２．
［责任编辑 张宁宁］
［收稿日期］ ２００７０９２７
［通讯作者］ 吕爱平，Ｔｅｌ：（０１０）６４０６７６１１，Ｅｍａｉｌ：ｌａｐ６４０６７６１１＠
１２６．ｃｏｍ
灵芝提取物对 Ｈ２２荷瘤小鼠抗肿瘤作用的实验研究
赵宏艳１，张皖东２，吕 诚３，谭 勇３，鞠大宏１，陈士林４，杨大坚４，
陈新滋４，吕爱平３，４
（１．中国中医科学院 中医基础理论研究所，北京 １００７００；
２．安徽中医学院 第一附属医院，安徽 合肥 ２３００３１；
３．中国中医科学院 中医临床基础医学研究所，北京 １００７００；
４．深圳市中药药学及分子药理学研究重点实验室，广东 深圳 ５１８０５７）
近年来，从真菌及其代谢产物中提取了多种有
效成分，其抗肿瘤活性已得到国际公认。灵芝是我
国传统的补益中药，具有扶正固本、延年益寿之功
效。大量临床及实验研究表明，灵芝及其提取物具
有抗肿瘤，抗血栓及免疫调节等作用［１４］。本实验以
Ｈ２２荷瘤小鼠作为研究对象，主要从免疫系统的角
度，初步探讨灵芝提取物（ＧＬＥ）的抗肿瘤机制。
１ 材料
１．１ 动物及细胞株 昆明远交系清洁级小鼠，雄
性，体重为１８～２２ｇ，由中国中医科学院实验动物研
究中心提供。Ｈ２２肝癌细胞株由本院中药研究所王
金华赠送。
１．２ 药物 灵芝粗提取物（ＧＬＣＥ，绿谷制药有限公
司，配成１０２ｍｇ·ｍＬ－１的混悬液。此药物浓度是按
人日用临床剂量，经人小鼠体表面积比值折算成相
当于成人临床剂量的２倍），灵芝细提取物（ＧＬＲＥ，
上海中药现代化研究中心），环磷酰胺（ＣＴＸ，上海华
联制药有限公司）。
１．３ 试剂及仪器 ＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ８抗体（ｅＢｉｏ
ｓｃｉｅｎｃｅ公司），１６４０培养液（ＧＩＢＣＯ公司），胎牛血
清（Ｈｙｃｌｏｎｅ公司），四甲基偶氮唑盐（ＭＴＴ，Ａｍｒｅｓｃｏ
公司）；酶标仪（芬兰Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ公司），ＥＰＩＣＳＸＬ流
式细胞仪（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ公司）。
２ 方法
２．１ ＧＬＲＥ对 Ｈ２２细胞体外增殖的影响 调整
Ｈ２２细胞２×１０６个／ｍＬ，以０２ｍＬ接种于小鼠腹腔
接种传代。６～８ｄ后无菌抽取小鼠腹水，ＰＢＳ洗涤
后转入培养瓶培养，每２ｄ更换新培养基，取第２代
细胞用于实验。调整为３×１０４个／ｍＬ，以１００μＬ／孔
接种于９６孔培养板，加入１００μＬ不同质量浓度的
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ＧＬＲＥ，使终浓度分别为 ５００，２５０，１２５，６２５μｇ·
ｍＬ－１，每个药物浓度设 ８个复孔，另设不加 ＧＬＲＥ
的细胞悬液对照组和只加培养液的空白对照组（调
零孔），置于３７℃，５％ＣＯ２饱和湿度培养箱中培养
２４，４８，７２ｈ后，加入ＭＴＴ（５ｍｇ·ｍＬ－１）２０μＬ，继续
避光培养４ｈ。弃上清，再加入ＤＭＳＯ溶液１５０μＬ，
于酶标仪上测定波长为５７０ｎｍ时的吸光度。
２．２ ＧＬＣＥ对肿瘤生长的影响 按常规方法接种
肿瘤细胞：取腹腔传代６～８ｄ生长良好的乳白色腹
水，用生理盐水稀释至２×１０６个／ｍＬ，以０２ｍＬ接
种于小鼠右腋皮下。实验分为５组，每组８只，即空
白组、模型组、ＧＬＣＥ组，ＣＴＸ组、ＧＬＣＥ＋ＣＴＸ组。
空白、模型组以蒸馏水灌胃；ＧＬＣＥ组及 ＧＬＣＥ＋
ＣＴＸ组于造模后第２天灌胃（１０２ｇ·ｋｇ－１·ｄ－１），
每天１次，连续１２ｄ。ＣＴＸ组及 ＧＬＣＥ＋ＣＴＸ组按
１００ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１腹腔注射，分别于第１，６天给药
２次。于造模后第１４天，乙醚麻醉处死动物。剥离
肿瘤组织，用滤纸吸干后称重。计算肿瘤抑制率
（％）＝［（模型组平均瘤重 －治疗组平均瘤重）／模
型组平均瘤重］×１００％。
２．３ ＧＬＣＥ对外周血 Ｔ淋巴细胞亚群的变化 样
品测定管中各加入１００μＬ抗凝血，参照产品说明书
配好三色标记的抗小鼠单抗，然后每管中加入相应
的抗体１０μＬ，振荡混匀，室温避光孵育３０ｍｉｎ，加
入２ｍＬ溶红素，振荡混匀，室温避光放置２ｍｉｎ，１
０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ弃上清液，加入５ｍＬＤ
Ｈａｎｋ’ｓ，１０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ弃上清液，加入
５００μＬＤＨａｎｋ’ｓ，混匀后上机检测。收集４０００个
细胞用于数据分析。
２．４ 小鼠外周血血清中 ＩＬ２与 ＩＬ１０活性的测定
采用双夹心酶联免疫检测法（ＥＬＩＳＡ）检测外周血
ＩＬ２与 ＩＬ１０的活性，于酶标仪上测定波长为 ４５０
ｎｍ时的吸光度Ａ。
２．５ 统计分析 所有实验数据均以珋ｘ±ｓ，采用两样
本的 ｔ检验和单因素方差分析处理数据，Ｐ＜００５
为差异有显著性。
３ 结果
３．１ ＧＬＲＥ对肿瘤细胞生长的影响 ＭＴＴ结果显
示：不同浓度 ＧＬＲＥ对体外培养的 Ｈ２２细胞均有明
显的抑制作用，并与时间和剂量呈正相关，提示 ＧＬ
ＲＥ有较强的细胞毒作用，可直接杀伤体外培养的肿
瘤细胞（表１）。
表１ 不同浓度和不同作用时间ＧＬＲＥ对Ｈ２２细胞生长
的影响（Ａ，珋ｘ±ｓ，ｎ＝８）
ＧＬＲＥ
／μｇ·ｍＬ－１
培养时间／ｈ
２４ ４８ ７２
０ １０６９±００６８ １２６３±００５６ ２０５３±０１８２
６２５ １００８±０１０８ １１９７±００９９ １５０８±０１９３２）
１２５ ０９９６±００４９ １１７４±００７７１） １４２９±０２１７２）
２５０ ０９４３±００６３２） １０３１±００６６２） １０７７±０１７９２）
５００ ０８９１±００５９２） １００６±００５０２） １０６８±０１０２２）
注：与０μｇ·ｍＬ－１ＧＬＲＥ比较１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１
３．２ ＧＬＣＥ对昆明小鼠 Ｈ２２实体瘤的抑制作用
与模型组相比，ＣＴＸ，ＧＬＣＥ，ＣＴＸ＋ＧＬＣＥ各组肿瘤
显著减小。进一步分析发现，ＣＴＸ＋ＧＬＣＥ组与ＣＴＸ
组比较无统计学意义，说明 ＧＬＣＥ虽然可以抑制荷
瘤小鼠的肿瘤的生长，但是对于ＣＴＸ并没有协同增
效的作用（表２）。
表２ ＧＬＣＥ对昆明小鼠Ｈ２２实体瘤瘤重的影响
（珋ｘ±ｓ，ｎ＝８）
组别 瘤重／ｇ 抑瘤率／％
模型 １７９±０４９ －
ＣＴＸ ０３９±０１５１） ７８１２
ＧＬＣＥ １１０±０２４１） ３８６４
ＣＴＸ＋ＧＬＣＥ ０３８±０１８１） ７８５３
注：与模型组比较１）Ｐ＜００１
３．３ ＧＬＣＥ对荷瘤小鼠外周血 Ｔ细胞亚群的影响
与正常组比较，模型组外周血总 Ｔ淋巴细胞
（ＣＤ３＋Ｔ淋巴细胞）比例有下降趋势，ＣＤ４＋Ｔ淋巴
细胞亚群显著下降，而ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞亚群变化无
显著性差异，导致ＣＤ４／ＣＤ８明显下降。
与模型组相比，ＣＴＸ可使外周血中总 Ｔ淋巴
细胞、ＣＤ４＋和 ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞亚群比例均显著降
低，其中 ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞亚群比例下降明显，使
ＣＤ４／ＣＤ８显著上升；与模型组相比，ＧＬＣＥ对肿瘤
小鼠外周血中总 Ｔ淋巴细胞有上升的趋势，并使
外周血中 ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞亚群明显升高，而
ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞的比例显著下降，导致 ＣＤ４／ＣＤ８
显著升高；与 ＣＴＸ和 ＣＴＸ＋ＧＬＣＥ比较，ＧＬＣＥ瘤
小鼠外周血中总Ｔ淋巴细胞、ＣＤ４＋和ＣＤ８＋Ｔ淋巴
细胞亚群比例均显著升高，ＣＤ４／ＣＤ８显著下降。
与模型组比较，ＣＴＸ＋ＧＬＣＥ外周血总 Ｔ淋巴细胞
与 ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞亚群的比例显著降低，ＣＤ４＋Ｔ
淋巴细胞亚群变化无显著性差异，导致 ＣＤ４／ＣＤ８
显著升高；而与 ＣＴＸ组相比较，其外周血总 Ｔ淋巴
细胞和 ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞亚群比例均显著升高，
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ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞亚群比例明显升高，ＣＤ４／ＣＤ８显 著降低（表３）。
表３ ＧＬＣＥ对荷瘤小鼠外周血Ｔ细胞亚群的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝８）
组别 ＣＤ３ ＣＤ４ ＣＤ８ ＣＤ４／ＣＤ８
正常 ３９７９±４４２ ２５１３±２９５ １４３３±１５４ １７６±０１１
模型 ３７１９±１８５ ２１７３±２３２２） １５１３±１２３ １４５±０２７１）
ＣＴＸ ２１９５±１１０１，４，６） １７０５±０９３２，４，６） ４６４±０４１２，４，６） ３７０±０３５２，４，６）
ＧＬＣＥ ３７７４±２０６ ２４１４±２２５３） １３２１±１０８１，４） １８４±０２８４）
ＣＴＸ＋ＧＬＣＥ ２６４６±３１１２，４，６） １９８４±２３０２，６） ６４４±０８４２，４，６） ３０９±０２３２，４，６）
注：与正常组比较１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１；与模型组比较３）Ｐ＜００５，４）Ｐ＜００１；与ＧＬＣＥ组比较５）Ｐ＜００５，６）Ｐ＜００１
３．４ 灵芝提取物对小鼠外周血 ＩＬ１０与 ＩＬ２活性
的影响 模型组血清中 ＩＬ１０活性显著高于正常对
照组，ＩＬ２活性显著低于正常对照组。ＣＴＸ可以提
高ＩＬ２含量，抑制ＩＬ１０的活性。ＧＬＣＥ同样具有抑
制ＩＬ１０活性，提高ＩＬ２活性的趋势，并能促进ＣＴＸ
对ＩＬ２的分泌（表４）。
表４ ＧＬＣＥ对荷瘤小鼠外周血中ＩＬ１０与ＩＬ２的影响
（Ａ４５０ｎｍ，珋ｘ±ｓ，ｎ＝８）
组别 ＩＬ１０ ＩＬ２
正常 ０３０１±００２７ ０３７１±００１９
模型 ０３５４±００２６２） ０３１５±００３５２）
ＣＴＸ ０３１６±００２７４） ０３４３±００２４１，３）
ＧＬＣＥ ０３３±００２１１） ０３３４±００２２２）
ＣＴＸ＋ＧＬＣＥ ０３１２±００２６４） ０３５５±００３４）
注：与正常组比较１）Ｐ＜００５，２）Ｐ＜００１；与模型组比较
３）Ｐ＜００５，４）Ｐ＜００１
４ 讨论
大量临床及实验研究表明，灵芝及其提取物具
有抗肿瘤，抗血栓，降血糖，降血压及免疫调节等作
用［１４］。本研究通过体外及体内实验观察灵芝提取
物的抗肿瘤机制。随着对肿瘤学的深入研究，肿瘤
与免疫的关系越来越引起重视。机体的免疫功能及
状态与肿瘤的发生、发展及预后密切相关［５］。机体
的抗肿瘤免疫以细胞免疫为主，特别是 Ｔ淋巴细
胞，其细胞表面不同的白细胞分化抗原是反映其功
能的重要标志，并随着疾病的转归发生变化。在外
周血中，ＣＤ４／ＣＤ８是反映机体免疫功能紊乱的敏感
指标，只有当两者在适当的比例，才能发挥正常的抗
肿瘤作用 ［６，７］。通常认为恶性肿瘤进行期和复发
时免疫功能下降，可见ＣＤ４／ＣＤ８下降［８，９］。
本研究体外实验发现 ＧＬＲＥ对 Ｈ２２细胞有抑
制作用，且随ＧＬＲＥ浓度的升高、作用时间延长，抑
制作用增强。体内实验也显示出ＧＬＣＥ具有较强的
抑瘤活性。本研究结果显示，应用 ＣＴＸ后，Ｔ淋巴
细胞、ＣＤ４＋和ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞亚群比例均显著降
低，其中 ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞亚群比例下降明显，使
ＣＤ４／ＣＤ８上升到一种异常的状态，其原因可能与
ＣＴＸ的用药剂量有关，对于这个结果有待于进一步
探讨。实验中发现 ＧＬＥ能升高外周血中 Ｔ淋巴细
胞水平，并能使外周血中ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞亚群明显
升高，而 ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞的比例显著下降，导致
ＣＤ４／ＣＤ８显著升高，说明 ＧＬＣＥ可以增强机体的免
疫功能。ＣＴＸ＋ＧＬＣＥ与 ＣＴＸ组相比较，其 Ｔ淋巴
细胞的比例明显升高，说明 ＧＬＣＥ对机体的免疫系
统具有正向调节作用。通过对小鼠瘤重及活动状态
的观察，发现 ＧＬＣＥ组及 ＣＴＸ＋ＧＬＣＥ组小鼠精神
状态较ＣＴＸ组好，说明ＧＬＣＥ对肿瘤的生长有抑制
作用，同时能抑制ＣＴＸ产生的副作用。
ＩＬ２及其受体系统在机体抗肿瘤中起重要作
用，是反映机体免疫功能的重要指标［１０］。ＩＬ１０具
有多种抑制抗肿瘤免疫应答的作用［１１］。包括巨噬
细胞炎症反应、抗原提呈功能的降低、Ｔ细胞增殖能
力的下降等。本研究结果显示，Ｈ２２荷瘤小鼠血清
中ＩＬ１０活性明显高于正常组，ＩＬ２活性明显低于
正常组。ＧＬＣＲ具有抑制 ＩＬ１０活性，提高 ＩＬ２活
性的趋势，并能促进ＣＴＸ对ＩＬ２的分泌。
本研究显示，ＧＬＥ能显著抑制 Ｈ２２细胞的生
长，体内体外实验均表现出了较强的抗肿瘤作用，同
时其能增强 Ｔ淋巴细胞功能，升高 ＣＤ４／ＣＤ８，提高
ＩＬ２，抑制ＩＬ１０的活性，从而提高机体的免疫力而
发挥抗肿瘤作用。这为进一步研究 ＧＬＥ的抑瘤机
制提供了初步的实验依据。
［参考文献］
［１］ ＨｏＹＷ，ＹｅｕｎｇＪＳ，ＣｈｉｕＰＫ，ｅｔａｌ．Ｇａｎｏｄｅｒｍａｌｕｃｉｄｕｍｐｏｌｙ
ｓａｃｃｈａｒｉｄｅｐｅｐｔｉｄｅｒｅｄｕｃｅｄｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｙ
ｔｏｋｉｎｅｓｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｒｈｅｕｍａｔｏｉｄｓｙｎｏｖｉａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ［Ｊ］．ＭｏｌＣｅｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００７，３０１（１２）：１７３．
［２］ ＣａｏＱＺ，ＬｉｎＺＢ．ＡｎｔｉｔｕｍｏｒａｎｄａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＧａｎ
ｏｄｅｒｍａｌｕｃｉｄｕｍｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｐｅｐｔｉｄｅ［Ｊ］．ＡｃｔａＰｈａｒｍａｃｏｌ
Ｓｉｎ，２００４，２５（６）：８３３．
［３］ 张晓云，杨春清．灵芝的化学成分和药理作用［Ｊ］．国外医药
·植物药分册，２００６，２１（４）：１５２．
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第３３卷第７期
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