全 文 :er,inthecontrolgroup,everyexpressionofmarkerproteinwasnegativeorweaklypositive.Expressionofp65wasincytoplasm.
WesternblotmethodshowedIκBαproteinrelativeIAwas1.000beforeinduction.Itwas0.4556±0.1008afterinductioninCiwujia
groupanddecreasedsignificantlythanbeforeinduction(P<0.01).Itwas0.0296±0.0099afterinductionincontrolgroupandde
creasedsignificantlythanbeforeinductionandinCiwujiagroup(P<0.01).Conclusion:ThedatashowedthatMSCscaninducedif
ferentiationintoneuronlikecelsbyCiwujia,andCiwujiacouldinhibitthetranslocationofNFκBfromthecytoplasmtothenucleus,
whichmayberelatetothediferentiationofMSCsintoneuronlikecels.
[Keywords] marowstromalcels;Ciwujiainjection;NFκB;diferentiation;neuron
[责任编辑 古云侠]
[收稿日期] 20070810
[通讯作者] 张洪泉,Tel:(0514)7978821,Email:hqzhangyz
@126.com
雾化吸入银杏叶总黄酮对哮喘小鼠
Th1/Th2失衡的影响
陈莉莉,翁晓静,李 心,张洪泉
(扬州大学 医药研究所,江苏 扬州 225001)
[摘要] 目的:研究银杏叶总黄酮(totalginkgoflavoneglycosides,TFG)对哮喘小鼠辅助性T细胞1/辅助性T
细胞2(Th1/Th2)失衡的影响。方法:48只BALB/c小鼠随机分为正常组、哮喘组、TGF雾化吸入组以及地塞米松
组,以卵蛋白(OVA)、氢氧化铝免疫系统致敏和局部激发的方法建立哮喘模型。自实验第21天起给予TFG治疗组
连续雾化吸入50g·L-1TFG溶液30min,地塞米松组腹腔注射地塞米松1mg·kg-1,连续10d。第32天酶联免
疫吸附实验(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)法测定肺细胞灌洗液(bronchalveolarlavagefluid,BALF)中
细胞因子γ干扰素(interferonγ,IFNγ)、白介素4(interleukin4,IL4)和血清中总免疫球蛋白 E(immunoglobulin
E,IgE)含量,观察各组肺组织的病理变化,免疫组织化学染色技术检测肺组织中GATA连接蛋白3(GATAbinding
protein3,GATA3)的表达情况。结果:与模型组比较,TFG组 BALF中 IL4含量(49.30±795)ng·L-1降低
(P<001)、IFNγ水平升高(4908±546)ng·L-1(P<001)、血浆总 IgE水平降低(947±152)μg·L-1
(P<001);模型组支气管平滑肌肥厚,黏膜充血、水肿,管腔内可见黏液栓,并有大量炎性细胞浸润;而 TFG组和
地塞米松组小鼠的上述炎症性改变明显减轻;模型组GATA3表达显著,TFG治疗组则明显减轻。结论:雾化吸入
TFG对哮喘小鼠有明显的治疗作用,其机制可能与阻断GATA3的表达、恢复Th1/Th2平衡有关。
[关键词] 银杏叶总黄酮;哮喘;Th1/Th2;雾化吸入
[中图分类号]R2855 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)15186504
哮喘发病机制复杂,越来越多的研究表明,T细
胞在哮喘的发生发展中起了重要作用,它们通过释
放Th2型细胞因子如IL4,IL5等触发炎性反应,导
致嗜酸性粒细胞在气道募集并活化;而 Th1细胞则
具有与细胞相反的作用,他们通过释放 Th1型细胞
因子如IFNγ,IL12等拮抗 Th2型细胞因子的功能
而抑制哮喘反应。目前普遍认为,哮喘患者存在
Th2占优势的Th1/Th2失平衡,如何通过调节 Th1/
Th2型细胞之间的平衡己成为哮喘免疫治疗的一个
热点[1]。
银杏叶具敛肺,平喘,活血化瘀,止痛的作用,用
于治疗哮喘在我国已有悠久的历史,自古便是定喘
汤的主要成分之一。20世纪 80年代后的研究表
明,银杏叶提取物对哮喘治疗有一定作用。黄酮类
化合物为银杏叶中含量最多的有效成分。本研究通
过含量较高的银杏叶黄酮提取物(含量 >60%)对
哮喘小鼠Th1/Th2平衡的影响,探讨银杏叶总黄酮
平喘作用的机制,为银杏叶的进一步开发利用提供
理论依据。
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中 国 中 药 杂 志
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Vol.33,Issue 15
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1 材料
1.1 动物 4周龄清洁级 Balb/c小鼠,体重18~
22g,48只,雌雄各半,由扬州大学实验动物中心提
供,合格证号SYXK(苏)20020045。动物于实验前
适应环境1周,控制室温20~22℃,给予充足的标
准饲料和饮用水,光照充足。
1.2 药物与试剂 银杏叶总黄酮由江苏爱普生生
物科技有限公司提供,为棕黄色粉末,提取工艺为:
原料萃取银杏黄酮除去脂溶性物质树脂吸附高
纯银杏黄酮(黄酮苷含量 >60%,批号20050130)。
卵蛋白干粉(OVAGradeV,美国 Sigma公司,批号
032K7029);氢氧化铝凝胶(美国 Sigma公司,批号
070212);白介素4(IL4)检测试剂盒(美国 BPB公
司,批号0704216)和中细胞因子 γ干扰素(IFNγ)
检测试剂盒(美国 BPB公司,批号 0704217);血清
中总免疫球蛋白 E(IgE)检测试剂盒(美国 RB公
司,批号0704207);GATA连接蛋白3(GATA3)单
克隆抗体(美国 Santacruz公司,批号 0703225);
DAB显色液(武汉博士德,批号070322);地塞米松
磷酸钠注射液(江苏黄海药业有限公司,批号
070428)。
1.3 仪器 YLS-8A型多功能诱咳雾化仪(山东
医学科学院设备站),Bio-Rad550型酶标仪(日本
BioRad公司),RY-2000瑞医病理图文分析系统
(东南大学瑞医科技产品),XDS-1B型生物显微
镜(日本Olympus光学仪器有限公司)。
2 方法
2.1 动物分组、模型制备及给药 将48只 Balb/c
小鼠随机分为4组,每组12只,即正常组、模型组、
阳性药对照组、TFG雾化吸入组。哮喘组采用系统
致敏加局部激发的方法制作哮喘模型[2],除正常组
外,各组小鼠腹腔注射 02mL以磷酸盐缓冲液
(PBS,01mol·L-1,pH74)配制的致敏液[含
OVA10mg+Al(OH)3凝胶20mg],7d后相同剂量
重复致敏1次,14d后以1%OVA溶液超声雾化激
发,每日30min,连续7d。正常组小鼠以 PBS代替
致敏液进行处理,其余操作与哮喘组同。阳性药对
照组模型制备方法同哮喘组,自试验21d起,给予
地塞米松注射液腹腔注射,剂量为 1mg·kg-1。
TFG治疗组将 TFG配制成50g·L-1的溶液,自第
21天起,将给药组小鼠置于4L密闭容器内,雾化
给药30min,每天1次,连续10d。
2.2 支气管肺泡灌洗液中细胞因子含量的测定
各组小鼠最后一次激发24h后颈椎脱臼处死,无菌
分离气管,剪开气管用相应的导管插入气管内1cm
固定,用无菌生理盐水 1mL进行灌洗 3次,回收
BALF>25mL。1500r·min-1,4℃离心10min
后取上清液保存于 -20℃,用于细胞因子 IL4,
IFNγ含量的测定,具体操作方法按照试剂盒内说
明操作。
2.3 血清中总 IgE含量的测定 最后一次给药24
h后摘眼球取血,分离血清,ELISA法测定血清总
IgE含量,严格按照试剂盒内附说明书操作。
2.4 肺组织病理学检查和 GATA3免疫组化染色
小鼠肺组织制备病理切片,经10%甲醛固定24h
后脱水,石蜡包埋,制备厚4μm为标准切片,HE染
色,显微镜下观察并摄影。免疫组织化学法检测
GATA3在肺组织中的表达,出现棕褐色产物为阳
性反应,背景为蓝色。
2.5 统计学方法 实验数据采用 SPSS100软件
进行统计,所得结果均以 珋x±s表示,对各组数据先
进行正态检验和方差分析,若符合正态分布和方差
齐性,则进行单因素方差分析(onewayANOVA),多
重比较采用iSD法;若不符合方差齐性的要求,则进
行多重秩和检验,多重比较用 MannWhiteney法。
P<005为差异有显著性意义。
3 结果
3.1 一般情况观察 经 OVA激发后,模型组小鼠
出现烦躁不安、呼吸增快、咳嗽,腹肌收缩、俯伏不
动,反应迟钝,两便失禁等症状,严重者可见呼吸急
促,呼吸节律不整,口唇紫绀;长期激发发现体重减
轻,毛色失去光泽,精神状态差。TFG治疗组和地塞
米松组,上述症状可获得不同程度的减轻。
3.2 对 BALF中 IL4,IFNγ和血清中 IgE含量的
影响 模型组BALF中IFNγ含量较正常组明显降
低(P<001),IL4含量显著上升(P<001),血清
中 IgE含量也相应增加,差异具有显著性(P<
001)。TFG组和地塞米松组上述现象得到改善,
TFG可以抑制 IL4和 IgE的产生,促进 IFNγ的产
生,调节IFNγ/IL4平衡。见表1。
3.3 小鼠肺组织病理改变 正常组小鼠支气管、伴
行小动脉及肺泡结构清晰,气道纤毛上皮排列整齐,
血管周围无明显炎性细胞的浸润、无充血水肿;与之
相比较,哮喘组小鼠支气管管壁可见明显炎性细胞
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表1 TFG对BALF中IL4,IFNγ的及血清中IgE含量的影响(珋x±s,n=12)
组别
剂量
/mg·kg-1
细胞因子/ng·L-1
IFNγ IL4
IFNγ/IL4
IgE
/μg·L-1
正常 - 6538±322 3732±14 1187±009 235±071
模型 - 1500±3291) 7075±6481) 021±0051) 2523±2721)
TFG 50 4908±5462) 4930±7952) 102±0202) 947±1522)
地塞米松 1 2235±386 4959±188 045±005 1216±109
注:与正常组比较1)P<005;与模型组比较2)P<005
浸润,气管平滑肌肥大增厚,黏膜层增厚,气道部分
上皮细胞脱落,管腔内渗出物增加,可见有黏液栓形
成。TFG雾化治疗组可见支气管和伴行小血管周围
炎症细胞浸润程度减轻,充血水肿情况有所改善,气
道上皮结构趋于正常;地塞米松组炎性渗出减少,炎
性病变明显减轻。见图1。
A.正常组;B.模型组;C.TFG治疗组;D.地塞米松组
图1 各组小鼠肺组织病理改变(HE,×200)
3.4 对肺组织 GATA3表达的影响 结果显示正
常组小鼠肺组织中支气管管壁光滑、免疫组化背景
为蓝色,GATA3几乎不表达。哮喘组小鼠肺组织
中支气管壁增厚、管腔内有大量黏性分泌物,支气管
黏膜周围棕褐色颗粒为GATA3阳性表达。与哮喘
组比较,TFG组支气管黏膜周围棕色颗粒减少,GA
TA3的表达显著减少。地塞米松组较哮喘组支气
管管壁光滑、管腔内无黏性分泌物,气管壁上 GA
TA3表达明显减少。见图2。
上述结果表明,哮喘小鼠的肺组织中GATA3
A.正常组;B.模型组;C.TFG治疗组;D.地塞米松组
图2 各组小鼠肺组织GATA3的表达情况(×200)
的表达增强,TFG可抑制其表达。
4 讨论
支气管哮喘的发病机制与 Th1/Th2平衡失调,
Th2细胞活化亢进密切相关。研究显示,Th2优势
分化及Th2型炎性细胞因子通过促进 IgE的合成,
嗜酸细胞在气道内募集、活化并释放细胞因子,介导
气道炎症和气道高反应性的发生在哮喘发病机制中
扮演了炎症组织者的角色[34]。因此,抑制过度的
Th2型反应、调节 Th1/Th2反应平衡在哮喘的防治
中起重要作用。IFNγ和IL4分别是Th1和Th2效
应细胞具有代表性的细胞因子,在哮喘发病机制中,
两者之间的不平衡,即 Th2细胞占优势的反应是引
起IgE产生异常和哮喘发病的重要因素。
转录因子GATA3是具有锌指结构的 GATA家
族中的一员,是Th2细胞的特异性转录因子,在 Th2
淋巴细胞分化及Th2类细胞因子基因转录中具有关
键性的作用,它可以调控幼稚 CD4+细胞向 Th2类
细胞分化,使发育中的 Th1细胞反转为 Th2表型。
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研究表明[56],GATA3基因缺失可减少 Th2细胞的
分化,抑制Th2细胞的分泌;哮喘患者GATA3表达
增加,抑制GATA3的活性就可抑制Th2型反应,因
此,抑制GATA3的活性,就可抑制过度亢进的Th2
反应,对哮喘起到一定的预防和治疗作用。糖皮质
激素是目前治疗哮喘最有效的药物,能有效地减轻
炎症反应,改善支气管狭窄,作为轻、中度哮喘患者
的第一线用药已得到公认。但是,吸入激素并不能
从根本上逆转哮喘的自然病程,不能纠正潜在的免
疫失调,长期使用还会减弱机体的保护性免疫力,而
且全身性的副作用近来也有报道,如肾上腺皮质轴
功能下调,骨代谢异常。因此,寻求一种疗效好,成
本低,副作用小的药物显得尤为重要。本研究表明,
TFG可能是通过抑制过度表达的 Th2型反应,调节
Th1/Th2平衡来达到治疗哮喘的目的;与激素疗法
相比,可以维持机体正常的免疫功能。同时,雾化吸
入具有局部浓度高、起效快、操作方便,全身毒副作
用小等优点,为中药的开发提供了良好的应用前景。
[参考文献]
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[6] ZhengWP,FlavelRA.ThetranscriptionfactorGATA3isnec
essarysuficientforTh2cytokinegeneexpressioninCD4+Tcels
[J].Cel,1997,89:587.
EfectofnebulizedTFGonTh1/Th2imbalanceinmousemodelwithasthma
CHENLili,WENGXiaojing,LIXin,ZHANGHongquan
(MedicalandPharmaceuticalInstituteofYangzhouUniversity,Yangzhou225001,China)
[Abstract] Objective:Toinvestigatetheefectofnebulizedtotalginkgoflavoneglycosides(TFG)onTh1/Th2imbalancein
micewithathma.Method:FortyeightBALB/Cmicewererandomlydividedintofourgroups:groupA(controlgroup,n=12);
groupB(asthmaticmodelgroup,n=12);groupC(TFGnebulizedtreatedgroup,n=12);groupD(dexamethasoneintraperitoneal
treatedgroup,n=12).TheasthmaticmodelwasestablishedbysensitivityandlocalactivationwithOvalbumin(OVA)andaluminum
hydroxideAl(OH)3.TFG(50g·L-1,peraerosolpersixmice,30minutes)wasnebulized20daysaftermodeling,whiledexam
ethasone(1g·L-1)wasintraperitonealoncedailyfor10days.Perfusateofbronchoalveolarlavagefluid(BALF)wascolectedonday
32.ThelevelofIL4,IFNγinBALF,andtheleveloftotalIgEinserumwasdeterminedTheairwayinflammationpathologychange
andtheexpressionofGATA3proteininlungswasdetectedbyimmunohistochemicalstaining.Result:Comparedwithmodelgroup,
thedecreasedcontentofIL4(49.30±7.95)ng·L-1andincreasedlevelofIFNγ(49.08±5.46)ng·L-1werefoundinBALF,
andtheleveloftotalIgE(9.47±1.52)μg·L-1inserumalsodecreasedinTFGtreatedgroupInmodelgroup,smoothmusclehy
pertrophing,mucoushyperemia,mucouslayerthickening,andinflammatorycelinfiltrationwereobserved.Phlegmasiawasappeared
inthebronchi,whichwasfiledwithlotsofmucus.Incontrast,theinflammatoryreactioninTFGandDexamethasonetreatedgroup
waslessobviousExpressionofGATA3wasmarklyincreasedinmodelgroupwithdecreasedexpressioninTFGtreatedgroup.Con
clution:NebulizedTFGshowedatherapeuticefectforasthmaticmice,themechanismmaybeexplainedbyblockingnnnnGATA3ex
pressionandregulatingthedisorderTh1/Th2imbalance.
[Keywords] totalginkgoflavoneglycosides;asthma;Th1/Th2;nebulization
[责任编辑 古云侠]
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