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Effect of Suanzaoren decoction on acute hepatic failure in mice

酸枣仁汤对小鼠试验性急性肝衰竭的影响



全 文 :nalysis(ESIMS,1HNMRand13CNMR)respectively.DPPHradicalscavengingassayandMTTassaywereusedtoobservethean
tioxidativeandantitumorabilities.Result:Sixcompoundswereisolatedfromthetheethylacetateextractoftheaerialpart.Their
structureswereidentifiedasicarin(Ⅰ),luteolin(Ⅱ),baohuosideI(Ⅲ),hyperoside(Ⅳ),epimedokoreaninB(Ⅴ)andbao
huosideI(Ⅵ).Theresultsindicatedthatatconcentrationsof3125~200μmol·L-1,compoundⅠ,Ⅲ andⅥ hadnoabilityto
scavengetheDPPHradical,butthescavengingabilityofcompoundsⅡ,Ⅳ andⅤ werestrongerthanthatofVitcindosedependant
mannerCompoundsⅠ,Ⅱ,Ⅴ andⅥ couldinhibittheproliferationofMCF7andHepG2indosedependantmanner,butcompounds
Ⅲ andⅣ hadnoefectontheproliferation.Conclusion:TheantitumoractivityofE.koreanummaybepartialyrelatedtotheantioxi
dantiveactivityofflavonoids.
[Keywords] Epimediumkoreanum;flavonoid;antioxidation;antitumor
[责任编辑 古云侠]
酸枣仁汤对小鼠试验性急性肝衰竭的影响
朱海鹏1,高志良1,谭德明2,钟艳丹2
(1.中山大学 附属第三医院 感染病科,广东 广州 510630;
2.中南大学 湘雅医院 感染病科,湖南 长沙 410008)
[摘要] 目的:研究酸枣仁汤对小鼠试验性急性肝衰竭的影响。方法:雄性昆明小鼠,给予 D半乳糖胺(D
GalN)和脂多糖(LPS)同时腹腔注射,制备小鼠急性肝衰竭模型;并于造模前2h,治疗组分别给予相应药物灌胃,
正常、模型组给予蒸馏水灌胃。比较各组小鼠的24h存活率,血清转氨酶水平,肝脏组织病理学改变,血清中肿瘤
坏死因子α(TNFα)、白介素1β(IL1β)的水平,肝脏组织中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘
肽(GSH)、谷胱甘肽还原酶(GR)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶[NOS包括总一氧化氮(TNOS)和诱生型一氧化
氮(iNOS)]的水平。结果:DGalN/LPS可以导致小鼠急性肝衰竭;酸枣仁汤可以提高小鼠存活率,减轻肝脏病变
程度,降低血清转氨酶活性及TNFα,IL1β的浓度,增加肝脏组织中SOD,GR的活性,降低NOS的活性及MDA,NO
的浓度。结论:酸枣仁汤可减轻DGalN/LPS所致的急性肝衰竭,提高小鼠的存活率,其作用机制可能与它影响睡
眠从而影响炎性细胞因子(如TNFα,IL1)的释放和机体氧化能力的改变有关。
[关键词] 酸枣仁汤;肝衰竭;睡眠
[中图分类号]R285.5 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2007)08071804
[收稿日期] 20060524
[通讯作者] 谭德明,Tel:(0731)4327012,Email:dmt2008@
yahoo.com.cn
  临床上发现,有一部分急慢性肝病患者存在睡
眠障碍的现象,有的甚至出现长期失眠,在重症、重
型肝炎患者中尤为明显。又因为睡眠与细胞因子、
激素、机体氧化反应及免疫机制有着密切的关系,基
于这些原因,笔者观察了养心安神药酸枣仁汤对试
验性急性肝衰竭小鼠的影响。
1 材料
1.1 试剂 DGalN由重庆医科大学化学教研室
提供。LPS:Sigma公司。TNFα及 IL1β放免检测
试剂盒:北京北免东雅生物制品研究所。SOD,
MDA,GSH,GR,NO,NOS试剂盒:南京建成生物工
程研究所。
1.2 药物 酸枣仁、川芎、茯苓、知母、甘草从湘雅
医院中药药剂科购得,经湖南中医药大学第一附属
医院药剂科鉴定为地道药材。酸枣仁汤按原方剂量
为:酸枣仁18g,甘草5g,知母10g,茯苓10g,川芎
10g,折算成小鼠每克剂量为酸枣仁27mg·g-1,
甘草075mg·g-1,知母15mg·g-1,茯苓15mg
·g-1,川芎 15mg·g-1。将酸枣仁汤(酸枣仁
162g,知母9g,茯苓9g,川芎9g,甘草45g)加相
当于药材量7倍的冷水浸泡1~2h,煮沸30min,过
滤,药渣加3倍水煮沸20min,过滤,合并两次滤液,
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水浴上浓缩成50mL,05mL药液/小鼠(20g)的剂
量相当于酸枣仁汤成人剂量的3倍。然后用蒸馏水
稀释成原浓度的1,1/3,1/9,4℃保存。
2 方法
2.1 动物模型的建立 DGalN和 LPS均用无菌
生理盐水溶解,DGalN浓度为24mg·L-1,LPS浓
度为50mg·L-1。6~8周龄雄性昆明小鼠(18~
22)g。DGalN12mg/只,LPS05μg/只,同时腹
腔注射,制备小鼠急性肝衰竭模型。
2.2 动物分组及处理 小鼠随机分为3组,每组10
只,治疗组于造模前2h给予最佳剂量(预试验得出)
的酸枣仁汤灌胃,正常组和模型组给予蒸馏水05
mL灌胃。造模后2h,每组随机取5只小鼠,去眼球
采血,分离血清待测TNFα,IL1β;另外5只小鼠于造
模后8h处死,采血分离血清待测ALT,AST;取肝组
织05g制成10%的组织匀浆;另取肝脏以3%多聚
甲醛固定后,HE染色。小鼠肝组织切片肝损伤程度
参照KobayashiS等[1]的肝损伤4级分法,即:0级,无
坏死;1级,坏死面积小于25%;2级,坏死面积介于
25%~5%之间;3级,坏死面积超过5%。
2.3 检测指标及方法 ALT,AST检测使用 HITA
CHI717A型全自动生化分析仪自动完成。TNFα
和 IL1β采用放免法。SOD,MDA,GSH,GR,NO,
NOS测定按试剂盒说明书进行。
2.4 统计学分析 结果用 珋x±s表示,率的比较用
χ2检验,两组之间比较用t检验,多组与对照组的两
两比较用Dunnett检验,分级资料的比较采用秩和
检验。以上统计处理用SPSS110软件自动完成。
3 结果
3.1 对急性肝衰竭小鼠存活率的影响 DGalN/
LPS处理后,模型组小鼠在8h后开始出现死亡,24
h存活率40%;以不同剂量的酸枣仁汤于造模前2h
灌胃,酸枣仁汤剂量为09mg·kg-1(为君药酸枣
仁的生药剂量)时,24h存活率和模型组无显著差
异;剂量27mg·kg-1时,24h存活率 75%,与模
  
型组比有显著性差异(P<005);剂量为81mg·
kg-1时,24h存活率和模型组相比无显著差异;故一
定剂量的酸枣仁汤可提高急性肝衰竭小鼠的存活
率,其较佳剂量为27mg·kg-1(表1)。
表1 不同剂量的酸枣仁汤对急性肝衰竭
小鼠24h存活率的影响(n=20)
组别
剂量
/mg·kg-1
存活
/只
死亡
/只
存活率
/%
模型   - 8 12 40
酸枣仁汤 09 12 8 60
  27 15 5 751)
  81 11 9 55
  注:与模型组相比1)P<005(表2同)
3.2 对小鼠ALT,AST的影响 造模后8h,对照组
小鼠血清ALT,AST显著高于正常组;酸枣仁汤组的
ALT,AST较对照组显著降低(表2)。
表2 造模后8h小鼠ALT,AST的变化(珋x±s,n=5)
组别
剂量
/mg·kg-1
ALT
/U·L-1
AST
/U·L-1
正常   -  452±14271)  1298±1061)
模型   - 11714±2875 15328±5270
酸枣仁汤 2.7  2296±3561)  2620±3081)
3.3 对小鼠 TNFα,TL1β的影响 造模后2h,模
型组小鼠血清 TNFα较正常组升高;酸枣仁汤组
TNFα较模型组显著降低;模型组血清 IL1β较正
常组显著升高(表3)。
表3 造模后2h小鼠TNFα,IL1β的变化(珋x±s,n=5)
组别
剂量
/mg·kg-1
TNFα
/ng·mL-1
IL1β
/ng·mL-1
正常   - 073±0161) 027±0042)
模型   - 107±018 062±010
酸枣仁汤 27 073±0082) 036±0112)
  注:与模型组比较1)P<005,2)P<001(表4同)
3.4 对小鼠氧化作用的影响 造模后8h,与正常
组比较,模型组小鼠肝组织匀浆的GSH,GR,SOD均
降低;MDA升高;NO,TNOS和 iNOS均升高。与模
型组比较,酸枣仁汤组小鼠的 GSH,GR,SOD升高;
MDA降低;NO降低及TNOS和iNOS降低(表4)。
表4 造模后8h小鼠自由基的变化(珋x±s,n=5)
组别
剂量
/mg·kg-1
GSH
/mg·g-1
GR
/U·g-1
MDA
/nmol·mg-1
SOD
/U·mg-1
NO
/μmol·g-1
TNOS
/U·mg-1
iNOS
/U·mg-1
正常   - 3688±6072) 987±2652) 405±1132) 19830±23472) 046±0162) 051±0112) 019±0042)
模型   - 1700±270 423±058 761±179 12649±1824 163±040 103±023 054±013
酸枣仁汤 27 2416±2142) 714±1642) 530±0941) 16783±13112) 100±0231) 063±0062) 033±0032)
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3.5 对小鼠肝脏病理变化的影响 造模后8h,模
型组可见大面积肝坏死,失去正常肝小叶结构;而酸
枣仁汤组小鼠肝损伤以肝细胞肿胀、变性为主,坏死
较少(图1)。模型组5只小鼠中,2只为2级肝损
伤,3只为3级肝损伤;酸枣仁汤组5只小鼠中,2只
为0级肝损伤,3只为1级肝损伤。酸枣仁汤组肝
损伤程度较模型组明显减轻(P<005)。
图1 各组肝脏病理变化(×400)
A.正常组;B.模型组;C.酸枣仁汤组
4 讨论
酸枣仁汤源于《金匮要略·血痹虚劳病脉证并
治第六》,原名酸枣汤,《医门法律》卷6始称之为酸
枣仁汤。主治虚劳病不得眠,方证病机虽与心、肝二
脏有关,但病变核心在肝。该方具有养血安神,清热
除烦之效。酸枣仁重用,养肝血,安心神,为君药;茯
苓与酸枣仁相配,以加强宁心安神之效,为臣药;川
芎疏达肝气,知母滋阴降火,共为佐药;甘草和缓肝
急,并防川芎的疏肝泄气,为佐使之用。目前有人对
酸枣仁汤进行了深入的研究,发现酸枣仁汤具有镇
静催眠作用,能够提高健康成人的入睡度、熟睡度和
觉醒爽快感等[24]。
作者在试验中发现,对 DGalN/LPS所致的急
性肝衰竭小鼠,预先给用酸枣仁汤,可以减轻血清中
TNFα,TL1β的升高;减少肝组织匀浆中 GSH,GR
和SOD的降低,并减少MDA,NO,TNOS和iNOS升
高。同时它可以减少血清中ALT,AST的升高,减轻
肝组织病理损伤,提高小鼠24h的存活率。可见,
酸枣仁汤能够减少DGalN/LPS所致的急性肝衰竭
小鼠炎性细胞因子 TNFα,TL1β的产生,减轻机体
的氧化损伤,减少肝组织的损伤。
考虑到酸枣仁汤具有促进睡眠的作用,故推测
它对小鼠急性肝衰竭的影响可能与睡眠有关。其机
制可能如下。①睡眠与TNFα和IL1β等细胞因子
的具有密切的关系,两者可以相互影响。Uthgenannt
等人发现:在健康成人中,睡眠可以影响丝分裂素刺
激导致的细胞因子的释放,与睡眠相比,在警醒状态
下,TNFα和IL1β释放增多,而这种增多可以被睡
眠抑制,且在睡眠的最后阶段,两者的含量明显下
降,但是 IL2在睡眠阶段升高[5]。另外,Manfridi,
KRUEGER,Krueger等人各自在试验中发现 TNFα,
IL1β等能够促进睡眠[68]。由以上资料可以推测,
当机体内 TNFα和 IL1β增多时,会促进睡眠,同
时,机体可以通过睡眠来减少 TNFα和 IL1β等细
胞因子。TNFα被认为是介导肝损伤的主要和终末
介质,且与肝损伤程度呈明显正相关。IL1β本身对
肝脏有损伤作用,但是与 TNFα共同作用时,可以
大大增强 TNFα的肝损伤和致死作用。因为酸枣
仁汤能够促进睡眠,使TNFα和IL1β减少,所以可
以达到减轻肝损伤的结果。②睡眠对机体氧化反应
影响明显。Shustanova等人在试验中发现:腹膜外
注射外源性d睡眠诱导肽(DSIP)剂量为12mg/100
g,可以改变大鼠组织和红细胞中自由基处理过程中
促氧化剂和抗氧化剂的平衡。其中,抗氧化物酶
(SOD、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽
还原酶)的活性增加,抗氧化剂还原型谷胱甘肽的
浓度上升[9]。另外,Ramanathan,Christou等人在试
验中发现,睡眠剥夺能够促进机体的氧化损
伤[10,11]。KimuraM等人在试验中发现,粒细胞巨
噬细胞集落刺激因子(GMCSF)可以通过 NO系统
的激活来刺激丘脑下部释放生长抑素(SRIF),从而
促进REM睡眠[12]。酸枣仁汤能够促进睡眠,从而
可能促进 SOD,GR的活性,增加机体的抗氧化能
力,减少脂质的过氧化反应,使 MDA的生成减少。
另外,睡眠也可能使 NOS的活性降低,减少 NO的
生成,从而减少大量产生的NO对肝脏的损伤。
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EfectofSuanzaorendecoctiononacutehepaticfailureinmice
ZHUHaipeng1,GAOZhiliang1,TANDeming2,ZHONGYandan2
(1.DepartmentofInfectiousDiseases,ThirdAfiliatedHospital,SUNYATSENUniversity,Guangzhou510630,China;
2.DepartmentofInfectiousDiseases,XiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410008,China)
[Abstract] Objective:ToinvestigatetheefectofSuanzaonacutehepaticfailureinmice.Method:Acuteliverfailurewasin
ducedinmaleKunmingstrainmicebyenterocoeliainjectingtheanimalswithDGalNandLPS.Themiceintreatmentgroupswere
givencorespondingdrug2hbeforeadministrationofDGalNandLPS,andthemiceincontrolgroupweregiventhesamedoseofdis
tiledwater.The24hsurvivalrate,serumalanineaminotransferase(ALT),aspartateaminotransferase(AST)levelswerecompared.
SerumthelevelsofTNFαandIL1andthelevelsofSOD,MDA,GR,GSH,NOandNOSintheliverweredetermined.Result:
TreatmentwithSuanzaorendecoctioncouldincreasethesurvivalrateandimprovetheliverhistologicalfeather.Suanzaorendecoction
inhibitedtheserumthelevelsofALT,AST,TNFαandIL1,andreducedthelevelsofMDA,NOandNOSandincreasedthelevels
ofGRandSODintheliver.Conclusion:TreatmentwithSuanzaorendecoctioncansuppresstheDGalN/LPSinducedacutehepatic
failure.ItmaybethemechanismthatSuanzaorendecocotionregulatetheproductionofinflammatorycytokinesandfreeradicals.
[Keywords] Suanzaorendecoction;hepaticfailure;sleep
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