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Study on chemical constituents from Incarvillea arguta and their accelerating PC-12 cell differentiation

毛子草化学成分及其促PC-12细胞的分化作用研究Ⅰ



全 文 :毛子草化学成分及其促 PC12细胞
的分化作用研究Ⅰ
余正文1,2,3,朱海燕1,杨小生1,孙黔云1,郝小江1
(1贵州省中国科学院 天然产物重点实验室,贵州 贵阳 550002;
2贵州大学 精细化工中心,贵州 贵阳 550025;
3贵州师范大学 生物技术与工程学院,贵州 贵阳 550001)
[摘要] 目的:研究毛子草的化学成分及其促PC12细胞的分化作用。方法:利用反复硅胶柱色谱进行分离和
纯化,通过理化方法及光谱分析鉴定其结构。采用PC12细胞株模型对毛子草不同提取部位及各单体化合物进行
了促分化作用研究。结果:从毛子草的正丁醇溶解部分分离得到5个化合物,鉴定为:车前醚苷(Ⅰ),5羟基4′,6,
7三甲氧基黄酮(Ⅱ),4′,5二羟基6,7二甲氧基黄酮(Ⅲ),4′,5二羟基7甲氧基黄酮(Ⅳ),5羟基4′,7二甲氧基黄
酮(Ⅴ)。结论:化合物I为首次从该植物中分离得到;化合物Ⅱ~Ⅴ为首次从角蒿属植物中分离得到。生物活性表
明毛子草正丁醇溶解部位和化合物I对PC12细胞均具有一定的营养活性。
[关键词] 毛子草;化学成分;PC12细胞;分化作用
[中图分类号]R284.1;R2855 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2005)17133504
[收稿日期] 20040405
[基金项目] 贵州省优秀科技人才培养计划项目[黔科合人字
(2002)0205号];中医药留学回国人员科技活动择优资助项目(2003
21)
[通讯作者] 杨小生,Tel:(0851)3805459
彝族常用草药毛子草 Incarvileaarguta为紫威
科角蒿属IncarvileaL植物。该属植物全球共有15
种,我国有11种,多数产西南地区,其他如东北、华
北、西北等地也有分布[1]。毛子草的干燥或新鲜全
草供药用,彝族民间称为“瓦布友”,变称“肝炎草”、
马桶花、毛子草等;主要用于治疗肝炎、菌痢、痈肿、
骨折血肿、风湿劳伤等[2]。贵州苗医实践表明毛子
草有消炎镇痛、溶石、排石的功效,在民间用于治疗
胆囊炎、胆结石、肾结石、肾盂积水、膀胱结石等
病[3],临床上也作为治疗肝炎和菌痢的药物。产于
四川凉山的毛子草主要含有单萜生物碱,大环精胺
类和环烯醚帖苷等成分。药理实验表明其单萜生物
碱具有抗感受伤害活性[4]。经文献调研,黔产毛子
草 Iarguta的化学成分的系统研究尚未见文献报
道。作者在开展药用植物特别是民族药中的具有神
经营养活性物质筛选时发现黔产毛子草的 75%乙
醇提取物,具有一定的促PC12细胞分化作用。
将乙醇提取物加入一定量的水分配后分别用石
油醚,醋酸乙酯和正丁醇水萃取,得石油醚,醋酸乙
酯,正丁醇和水4部分萃取物,经活性测试发现石油
醚,正丁醇及水 3部分对 PC12细胞具有一定促分
化作用,其中正丁醇部分的作用相对来说要强一些,
醋酸乙酯部分未显示出作用。本研究报道正丁醇萃
取部分中的化学成分及其促PC12细胞分化作用。
通过反复硅胶柱色谱和葡聚糖 SephadexLH20
色谱,从正丁醇萃取部分分离得到5个化合物,经光
谱学数据鉴定为:车前醚苷(Ⅰ),5羟基4′,6,7三
甲氧基黄酮(Ⅱ),4′,5二羟基6,7二甲氧基黄酮
(Ⅲ),4′,5二羟基7甲氧基黄酮(Ⅳ),5羟基4′,7
二甲氧基黄酮(Ⅴ)。最后通过大鼠嗜铬细胞瘤 PC
12细胞株对分离到的5个化合物进行跟踪筛选,结
果表明化合物Ⅰ为首次从该植物中分离得到并对该
细胞株具有一定促分化作用;化合物Ⅱ~Ⅴ为首次
从角蒿属植物中分离得到,但没有促分化作用。
1 化学成分研究
11 仪器和材料
熔点用 XT-4显微熔点仪测定(温度计未校
正);红外光谱用德国VECTOR22型傅立叶变换红外
光谱仪测定(KBr压片),核磁共振波谱仪:美国瓦里
安公司 INOVA400MHZ超导核磁共振波谱仪,质谱
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中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
Vol30,Issue 17
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仪:美国惠普公司GCMS5973型气相色谱质谱联用
仪;凝胶为葡聚糖凝胶 SephadexLH20,薄层色谱硅
胶、柱色谱硅胶(200~300目)均为中国青岛海洋化
工集团公司生产。实验药材采于贵州毕节,由贵阳
中医学院陈德媛教授鉴定为紫威科角蒿属植物毛子
草 Iarguta。
12 提取和分离
毛子草地上部分09kg,用75%乙醇加热回流
3次,回收乙醇至无纯味,加入适量水,依次用石油
醚,醋酸乙酯,正丁醇分别萃取3次,得石油醚溶解
部分(13g),醋酸乙酯溶解部分(30g),正丁醇溶解
部分(20g)及水部分(12g);通过硅胶反复柱色谱及
葡聚糖SephadexLH20色谱对正丁醇溶解部分进行
了分离纯化,得到化合物Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ。
13 结构鉴定
化合物Ⅰ 无色油状物,易溶于甲醇。1HNMR
(CD3OD)δ:924(1H,s,CHO),741(1H,s),585
(1H,s),363~585(葡萄糖质子),093~094(3H,
d)。13CNMR(CD3OD)δ:1927,1644,1262,998,
968,784,773,743,733,716,628,525,388,
351,329,164。以上光谱数据与文献[5]报道的车
前醚苷的光谱数据基本一致。故化合物Ⅰ鉴定为车
前醚苷。
化合物Ⅱ 黄色簇晶(氯仿),mp190~1915
℃。EIMSm/z:328[M]+,313,299,285,153,81。1H
NMR(C6D5N)δ:1275(1H,s,5OH),779(2H,d,J=
88Hz,H2′,6′),697(2H,d,J=88Hz,H3′,5′),
654(1H,s,H3),650(1H,s,H8),393(3H,s,
OCH3),389(3H,s,OCH3),386(3H,s,OCH3)。13C
NMR(C6D5N)δ:826(C=O),1639(C2),1625(C
4′),1586(C7),1531(C5),1529(C9),1325(C
6),1279(C2′,C6′),1234(C1′),1145(C3′,C
5′),1061(C10),1040(C3),905(C8),608
(OCH3),562(OCH3),555(OCH3)。以上光谱数据
与文献[6]报道的5羟基4′,6,7三甲氧基黄酮的基
本一致。故化合物Ⅱ鉴定为 5羟基4′,6,7三甲氧
基黄酮。
化合物Ⅲ 白色晶体(丙酮)。FAB+m/z:314
[M]+,298,283;1HNMR(C6D5N)δ:1366(1H,s,5
OH),796(2H,d,J=88Hz,H2′,6′),727(2H,d,
J=88Hz,H3′,5′),695(1H,s,H3),680(1H,s,
H8),388(3H,s,OCH3),377(3H,s,OCH3)。13C
NMR(C6D5N)δ:1832(C=O),1649(C2),1629(C
4′),1594(C7),1537(C5),1535(C9),1335(C
6),1290(C2′,C6′),1222(C1′),1169(C3′,C
5′),1064(C10),1038(C3),916(C8),606
(OCH3),564(OCH3)。以上光谱数据与文献[7]报
道4′,5二羟基6,7二甲氧基黄酮的基本一致。故
化合物Ⅲ鉴定为4′,5二羟基6,7二甲氧基黄酮。
化合物Ⅳ 黄色晶体(丙酮),mp285~287℃。
EIMSm/z:284[M]+,255,240。1HNMR(CDCl3)δ:
1366(1H,s,5OH),794(2H,d,J=88Hz,H2′,
6′),727(2H,d,J=88Hz,H3′,5′),693(1H,s,H
3),670(1H,s,H8),660(1H,s,H6),377(3H,s,
OCH3)。13CNMR(CDCl3)δ:1829(C=O),1659(C
7),1649(C2),1629(C4′),1627(C5),1581(C
9),1291(C2′,C6′),1222(C1′),1169(C3′,C
5′),1059(C10),1040(C3),987(C6),929(C
8),560(OCH3)。以上光谱数据与文献[8]报道 4′,
5二羟基7甲氧基黄酮的基本一致。故化合物Ⅳ鉴
定为4′,5二羟基7甲氧基黄酮。
化合物Ⅴ 黄色针晶(氯仿),mp174~176℃。
EIMSm/z:298[M]+,269,255,135,69。1HNMR(CD
Cl3)δ:1281(1H,s,5OH),784(2H,d,J=92Hz,
H2′,6′),702(2H,d,J=92Hz,H3′,5′),657
(1H,s,H3),648(1H,d,J=24Hz,H6),636~
635(1H,d,J=24Hz,H8),389(3H,s,OCH3),
387(3H,s,OCH3)。13CNMR(CDCl3)δ:1824(C=
O),1654(C7),1640(C2),1625(C5),1621(C
4′),1576(C9),1280(C2′,C6′),1234(C1′),
1144(C3′,C5′),1055(C10),1042(C3),980(C
6),925(C8),557(OCH3),555(OCH3)。EIMS图
检索谱库检索得化合物Ⅴ结构可能是 5羟基4′,7
二甲氧基黄酮,1HNMR,13CNMR的测定结果支持
这个结构,故化合物Ⅴ鉴定为5羟基4′,7二甲氧基
黄酮。
2 神经营养活性研究
21 材料
大鼠嗜铬细胞瘤 PC12细胞株(中国典型培养
物中心提供);神经生长因子(购于美国 Sigma公
司);马血清和小牛血清(购于美国Hyclone公司)。
22 方法
取适量生长良好的大鼠嗜铬细胞瘤 PC12细
胞,接种于盛有 10mL的定性培养液(85% RPMI
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1640,10%马血清+5%的胎牛血清)的培养瓶中,分
别加入样品或对照的生理盐水,37℃培养,3~4d
换1次培养液10d后对照组细胞仍呈球形,有活性
的实验组PC12细胞分化出神经样的突触。
23 结果
结果(见表1)表明,毛子草75%乙醇提取物,石
油醚萃取部分,正丁醇萃取部分和水溶解部分及化
合物Ⅰ对大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞分化具有促进
作用。
表1 毛子草不同提取部位及各单体化合物对大鼠
嗜铬细胞瘤PC12

细胞株的神经营养活性影响

样品 生物活性 样品 生物活性
NGF +1) Ⅰ ±2

75%乙醇提取物 ±2) Ⅱ 死4

石油醚溶解部分 ±2) Ⅲ -3

醋酸乙酯溶解部分 -3) Ⅳ -3

正丁醇溶解部分 ±2) Ⅴ 死4

水溶解部分 ±2)
注:NGF为阳性对照,含量为 50ng·mL-1,样品含量为 20μg·
mL;1)表示为有强活性;2)表示为有一定活性;3)表示无活性或微弱活
性;4)表示样品有细胞毒性,细胞死亡
3 讨论
31 从角蒿属植物中发现黄酮类化合物,尚未见文
献报道,本研究为角蒿属植物的进一步研究提供了
新的科学依据。毛子草作为一多来源,多品种的中
药材。来源不同,其化学成分往往差异较大。角蒿
属植物中的其他种是否含有黄酮类化合物,尚待作
进一步的研究。
32 黄酮类化合物通常具有消炎及抑菌作用[9],此
类化合物是否为该植物的活性成分,有待进一步研
究。
33 继LIPing等[10]首次发现环烯醚萜苷类化合物
增强神经生长因子诱导PC12神经细胞轴突生长的
作用后,陶移文等[11]又发现胡黄连苷Ⅱ对PC12神
经细胞损伤具有明显的保护作用;本研究报道毛子
草正丁醇溶解部位分到的化合物Ⅰ对大鼠嗜铬细胞
瘤PC12细胞株有一定的神经营养活性,不仅为环
烯醚萜苷类化合物的神经营养活性提供了科学依
据,也为该药的进一步研究开发提供了理论依据。
34 其余部分的化学成分及相关生物活性正在进
一步研究中。
[致谢] 1HNMR,13CNMR和 FAB+,MS数据由本室张
建新、王道平测定。
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StudyonchemicalconstituentsfromIncarvileaargutaand
theiracceleratingPC12celdiferentiation
YUZhengwen1,2,3,ZHUHaiyan,YANGXiaosheng1,SUNQianyun1,HAOXiaojiang1
(1TheKeyLaboratoryofChemistryforNaturalProductsofGuizhouProvinceandChineseAcademyofSciences,Guiyang550002,China;
2ResearchandDevelopmentCenterofFineChemicals,GuizhouUniverisity,Guiyang550025,China;
3BiologyTechnologyandEngineerColege,GuizhouNormalUniverisity,Guiyang550001,China)
[Abstract] Objective:TostudychemicalconstituentsofIncarvileaargutaandtheiracceleratingPC12celdiferentiationMethod:
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Theconstituentswereisolatedandrepeatedlypurifiedonsilicagelcolumnchromatography,andwereidentifiedonthebasisofphysicochemical
andspectroscopicanalysisTheneurotrophicactivityofdiferentportionandalpurifiedcompoundsfromIargutawasdeterminedonthe
modelofPC12celResult:FivecompoundswereisolatedfromBuOHportionofalcoholextractionofIarguta,Theirstructurswereidenti
fiedasplantarenaloside(Ⅰ),5hydroxy4′,67trimethoxyflavone(Ⅱ),4′,5dihydroxy6,7dimethoxyflavone(Ⅲ),4′,5dihydroxy7
methoxyflavone(Ⅳ),5dydroxy4′,7dimethoxyflavone(Ⅴ)Conclusion:CompoundⅠ isisolatedfromtheplantforthefirsttimeandit
hasneurotrophicactivityforPC12celCompoundsⅡ~Ⅴ areisolatedfromthegenusIncarvileaforthefirsttime
[Keywords] Incarvileaarguta;chemicalconstituents;PC12cel;diferentiation [责任编辑 李 禾]
党参果聚糖的化学结构
叶 冠1,李 晨2,黄成钢1,李志孝2,王新亮1,陈耀祖2
(1中国科学院 上海药物研究所,上海 201203;
2兰州大学 应用有机化学国家重点实验室,甘肃 兰州 730000)
[摘要] 目的:对中药党参中多糖进行研究。方法:DE52纤维素和 SephadexG200凝胶柱色谱分离纯化一多
糖CPP1。凝胶色谱法测定其纯度和分子质量。酸全水解,甲基化反应,高碘酸盐氧化及降解,IR,1HNMR和13C
NMR分析其结构。结果:CPP1分子质量约为 75×104,化学结构为呋喃果糖以β(2→1)连接而成的果聚糖。结
论:该多糖为一中性的均一多糖。
[关键词] 党参;多糖;果聚糖;化学结构
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2005)17133803
[收稿日期] 20040922
[通讯作者] 黄成钢,Tel:(021)50806716,Email:ygsimm@
sinacomcn
党参 Condonopsispilosula(Franch)Nannf是中医
重要的传统补益药,主治脾胃虚弱,气血两亏,体倦
无力[1]。对它的化学成分已有较多的研究,主要含
有挥发油、生物碱、苷类、糖类[2],在已有的糖类成
分研究中,除了菊糖的主链结构已经鉴定为呋喃果
糖以β(2→1)连接而成的果聚糖外,其余多糖均无
糖链结构分析的报道。本研究对党参多糖中一个具
有一定抗肿瘤和免疫活性组分的分离纯化及其化学
结构进行了研究。
1 实验部分
11 仪器与试剂 J-20C圆二色散旋光仪,UV-
240紫外光谱仪,170SX红外光谱仪,ShimadzuGC-
9A气相色谱仪,AC-225石英毛细管柱(022mm×
25m),糖组分分析温度 235℃,甲基化产物分析温
度180℃,高碘酸盐氧化及降解产物分析温度 170
℃,核磁分析使用 Varian公司的 DP-300型超导核
磁共振波谱仪,气质联用分析用 QP-1000A,PEG∶
OV11=1∶1填充柱(035mm×5m),程序升温80℃,
20℃·min-1,至250℃,保持15min。
DEAE纤维素(DE52),SephadexG200及标准
多糖系列 DextranT110,T70,T40和 T10为 Phar
macia产品,标准单糖为 EMerck产品,其他试剂均
为国产AR级。
12 分离纯化 1kg粉末状党参根先用乙醇回流,
药渣用沸水提取,水提液减压浓缩,离心,上清液加
3倍量乙醇,沉淀用水溶解,经 Sevag法除蛋白,透析
2d,加 3倍量乙醇,离心,沉淀相继用乙醇、丙酮和
乙醚洗涤,真空干燥,得 234g灰白色党参多糖粗
品。取 50g粗品溶于水,进行 DEAE纤维素(DE
52)柱色谱,先用水洗至无糖检出,再用0~20mol·
L-1NaCl梯度洗脱,硫酸蒽酮法跟踪检测。将水洗
脱部分收集,减压浓缩后用 SephadexG200柱色谱
纯化,得1900mg白色粉末状党参多糖CPP1。
13 纯度鉴定 凝胶色谱法:采用 SephadexG200
色谱柱,按文献[3]的方法进行。
14 分子质量测定 采用SephadexG200凝胶过滤
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