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The effect of Baicalin on gene expression profile in rat brain of focal cerebral ischemia

黄芩苷对局灶性脑缺血大鼠脑组织基因表达谱的影响



全 文 :²© „2Œ²± ¤³²³·²¶¬¶o¶¨¦µ¨·¬²± ²©ƒ‘¤±§×Šƒ2Βt º µ¨¨ ¤¯¯ º ¤¨®¨ µ·«¤± „„2ŒqΧονχλυσιον }„2Œ¤¶²±¨ ° ·¨¤¥²¯¬·¨ ²©„„2Œ¬± √¬√²¬±§∏¦¨¶§¬2
µ¨¦·¬±­∏µ¼¬± µ¨±¤¯ ³µ²¬¬°¤¯ ·∏¥∏¯¤µ¦¨¯¯¶qŒ·¶ ©¨©¨¦·¶¤µ¨ ¶¬°¬¯¤µ·²·«²¶¨ ²© „„2Œq„2Œ °¤¼ ¥¨ ²±¨ ²©·²¬¬¦° ·¨¤¥²¯¬·¨¶¬± ≤«¬±¨ ¶¨ «¨µ¥¶¦²±2
·¤¬±¬±ª „„ º«¬¦«³¤µ·¬¦¬³¤·¨¬± µ¨±¤¯ §¤°¤ª¨ ¤±§©¬¥µ²¶¬¶q
≈Κεψ ωορδσ  ¤µ¬¶·²¯²¯¤¦·¤° Œ~¤µ¬¶·²¯²¦«¬¦¤¦¬§Œ~µ¨±¤¯ ·∏¥∏¯¤µ ³¨¬·«¨ ¬¯¤¯ ¦¨¯¯ ~¤³²³·²¶¬¶~©¬¥µ²¶¬¶
≈责任编辑 古云侠 
黄芩苷对局灶性脑缺血
大鼠脑组织基因表达谱的影响
王 忠t 3 o应 康u 3 o张占军v o刘建勋t o
张小燕w o徐 立t o魏翠娥t o黄 燕u o王永炎x
kt q中国中医研究院 西苑医院 o北京 tsss|t ~
u q联合基因集团 上海研究院 o上海 usss{x ~v q北京中医药大学 临床医学院 o北京 tsss{y ~
w q北京师范大学 生命科学院 o北京 tss{zx ~x q中国中医研究院 o北京 tsszssl
≈摘要  目的 }研究黄芩苷对局灶性脑缺血大鼠脑组织基因表达谱的影响 o探索黄芩苷治疗脑缺血的药理作用
机制 ∀方法 }分别从假手术组 !局灶性脑缺血组 !黄芩苷治疗组 ≥⁄大鼠的脑组织中抽提总 • ‘„ o≤¼v o≤¼x荧光标记 o反
转录分别合成 ¦⁄‘„探针后 o与含有 w s|y条大鼠基因的 …¬²≥·¤µ基因表达谱芯片杂交 o„¬²± Š¨ ±¨ ³¬¬wsss…扫描仪扫描 o
Š¨ ±¨ °¬¬°µ²v qs软件分析表达信号 ∀结果 }大鼠局灶性脑缺血组差异表达的基因有 utt条 o其中 tu条基因上调 ot||条
基因下调 ∀黄芩苷治疗后差异表达的基因有 tzz条 o其中有 {|条基因上调 o而 {{条基因下调 ∀进一步分析发现 ot个
在模型组下调的基因经黄芩苷治疗后上调 ov个在模型组上调的基因经黄芩苷治疗后下调 ov个在模型组上调的基因
经黄芩苷治疗后表达进一步增强 ∀结论 }在基因组水平上黄芩苷可能通过多基因 o多途径调节大鼠脑缺血基因表达
谱而发挥药理作用 ∀
≈关键词  黄芩苷 ~基因表达谱 ~局灶性脑缺血 ~¦⁄‘„微矩阵
≈中图分类号  • u{x qx ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukusswlst2ss{v2sw
缺血性脑血管病严重危害人类健康 o由于脑供
血不足 o神经功能受到严重影响 ∀缺血性脑损伤机
制相当复杂 ∀无论哪种情况 o脑缺血时 o由于缺氧 o
„×°生成减少 o³‹值降低 o细胞内 ≤¤un增加 o谷氨酸
释放 o花生四烯酸增加 o导致细胞合成的基因激活 o
自由基合成酶增加 o白细胞聚集 o涉及信号传导 !基
质变化 !细胞因子等多个方面 o分子机制十分复杂 ∀
黄芩苷k≤ut ‹t{ ’ttl是临床常用药物清开灵注射液的
≈收稿日期  ussv2s|2ts
≈基金项目  国家 |zv重点基础研究发展规划项目2方剂关键科
学问题的基础研究kŠt|||sxxwl ~国家中医药管理局 /缺血脑病多因
子调控与修复及与排毒关系的实验研究0kusss2…22tyl
≈通讯作者  3 王忠 o应康 oר¯ }kstslyu{zxx||2yttw o ∞2°¤¬¯}
½«²±º ƒ ¶¬±¤q¦²°
主要成分 ∀本实验应用基因芯片对局灶性脑缺血大
鼠脑组织与假手术组鼠脑组织及黄芩苷治疗组基因
表达的差异进行比较研究 o发现黄芩苷在一定程度
上能逆转局灶性脑缺血中部分基因表达谱 o现报告
如下 ∀
1 实验材料与方法
1 .1 动物分组及药物 ≥⁄雄性大鼠 vs只k北京维
通利华实验动物有限公司 o合格证号 ≥≤÷Žp tt p ss
p ss{{l体重kuws ? uslªo随机分为 v组 }假手术组 !
模型组k局灶性脑缺血l与黄芩苷治疗组 ∀给药前禁
食 tu «∀黄芩苷k中国药品生物制品检定所提供l用
t h羧甲基纤维素钠配置ktss °ª#®ªptl o其他组给予
同体积的 t h羧甲基纤维素钠 ∀
1 .2 局灶性脑缺血模型的建立 按 פ°∏µ¤方法≈t  o
本实验室加以改进建立局灶性脑缺血动物模型 o≥⁄
#v{#
第 u|卷第 t期
ussw年 t月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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¤±∏¤µ¼oussw
大鼠 v qx h水合氯醛腹腔注射麻醉后 o经颞下入路 o
打开颅窗 o剥开软脑膜 o剥露右侧大脑中动脉 o电凝
嗅束与大脑下静脉之间的一段大脑中动脉k电凝输
出功率为 w • l o假手术组只开颅窗 o不电凝大脑中
动脉 ∀伤口缝合后回笼饲养 o实验及饲养室温为
kux qs ? tsl ε ∀uw «以后断头取脑 ∀标本迅速入液
氮保存备用 ∀
1 .3 总 • ‘„抽提和测定 按一步法≈u 抽提大鼠病
侧脑组织的总 • ‘„ o紫外分析及电泳检测总 • ‘„的
纯度 o浓度及完整性 ∀
1 .4 芯片制备 芯片包含 w s|y个 ¦⁄‘„ 克隆 o包
括癌基因及抑癌基因 !细胞因子及受体编码基因 !细
胞凋亡相关蛋白编码基因 !看家基因 !阴性对照 !空
白对照等 ∀用通用测序引物进行 °≤• 扩增制备靶
基因 o°≤• 反应及产物纯化用标准方法进行≈u  ∀通
过琼脂糖凝胶电泳监控 °≤• 质量 ∀将制备的靶基
因溶解于 v ≅ ≥≥≤溶液中 o用 ≤¤µ·¨¶¬¤±°¬¬¶¼¶zxss点样
仪点样于硅烷化玻片 ∀玻片经水合ku «l !室温干燥
ks qx «l o˜∂ 交连k能量值设定 yx °#¦°ptl o再分别
用 s qu h ≥⁄≥ o水及 s qu h硼氢化钠溶液处理 ts °¬±
晾干备用 ∀
1 .5 探针制备 参照 ≥¦«¨ ±¤的方法逆转录标记
• ‘„≈v  o用 ≤¼v §˜×°标记假受术组或模型组脑组织
• ‘„ o≤¼x §˜×°标记模型组或黄芩苷治疗组脑组织
• ‘„ o利用逆转录酶合成探针 o乙醇沉淀后将 ≤¼v
§˜×°和 ≤¼x §˜×°标记的探针混合溶解在 us ˏx ≅
≥≥≤ n s qu h ≥⁄≥杂交液中 ∀
1 .6 杂交及洗涤 将芯片和杂交探针分别于 |x ε
变性后置于杂交舱内 o加入混合探针 o用杂交密封舱
加以密闭k不能留有气泡l ∀恒温杂交箱内 wu ε 杂
交 t{ «∀按顺序用洗涤液 u ≅ ≥≥≤ n s qu h os qt h ≅
≥≥≤ n s qu h os qt h ≅ ≥≥≤洗涤 ts °¬±o室温晾干备扫
描 ∀
1 .7 荧光扫描和结果分析 用 „¬²± Š¨ ±¨ ³¬¬wsss…
扫描仪扫描芯片 o观察杂交结果 ∀扫描后所得所有
芯片数据均进行整体校正 o数据校正方法参考 ≠¤±ª
等≈w 提出的整体校正法 ∀整体校正后的数据采用容
许区间法计算各信号 •¤·¬²值 o确定差异表达阈值 ~
计算各信号 •¤·¬²值的 ≤∂ 值对芯片的准确性和重复
性进行评价 ∀根据差异表达阈值 o观察差异基因的
•¤·¬²值分布 o分析实验差异的可能因素 ∀所有数据
经过筛选 o筛选由图像分析软件自动完成 ∀相关系
数 Ρ的计算采用 ³¨ ¤µ¶²±相关系数≈x  ∀Š¨ ±¨ °¬¬°µ²
v qs软件分析 ≤¼v和 ≤¼x两种荧光信号的强度 o计
算 ≤¼xΠ≤¼v值 ∀基因差异表达的标准是 }≤¼vr≤¼x信
号比值k以 Ρ 值表示l的自然对数的绝对值应大于
s qy|k即基因的差异表达变化在 u倍以上l ~≤¼v或
≤¼x的荧光信号值均应大于 yss ~u次实验结果一致
的才被采用 o否则被剔除 ∀本研究中 o若 Ρt 或 Ρu
值大于 u o表示该基因在模型组和假手术组的表达
量明显上调 ~若 Ρt 或 Ρu 值小于 s qx o说明该基因在
模型组和假手术组中的表达水平显著下调 ∀
2 实验结果
2 .1 总 • ‘„ 提取结果 分别抽提假手术组 !模型
组和黄芩苷治疗组的总 • ‘„ o电泳结果显示 o无论在
us ε 状态还是在 zs ε 水浴 t «后 o其 t{≥和 u{≥条
带都很清晰 ou{≥条带的亮度大约是 t{≥条带亮度的
u倍 o总 • ‘„吸收度 ΑuysΠΑu{s  t q| o证实得到高纯度
的总 • ‘„ ∀
2 .2 芯片的质量标准控制 基因表达谱芯片的质
量标准 }其中包含植物基因和 ‹≤∂ 基因作为阴性对
照 o未加 ⁄‘„的点样液作为空白对照 ∀us个看家基
因必须阳性 ot{个植物基因k阴性对照l必须阴性 ous
个空白对照也必须阴性 ∀本实验结果完全符合上述
条件 ∀说明实验无污染且检测体系正常 ∀
2 .3 差异表达的基因表达谱 本研究显示 u对扫
描图谱的基因表达谱 o假手术组与模型组 o模型组与
黄芩苷治疗组 o图 t为假手术组与模型组芯片杂交
扫描图 o红色亮点代表高表达的基因 o绿色亮点代表
低表达的基因 o黄色亮点代表表达正常的基因 ∀
图 t 假手术组与模型组芯片杂交扫描图
2 .4 差异表达的基因数及变化 模型组与假手术
组之间差异表达的基因有 utt条 o其中 tu条基因上
调 ot||条基因下调 o这些基因可能与局灶性脑缺血
的形成和发展密切相关 ∀黄芩苷治疗组与模型组之
间差异表达的基因有 tzz条 o其中有 {|条基因在黄
芩苷治疗以后明显上升 o而 {{条基因在黄芩苷治疗
#w{#
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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¤±∏¤µ¼oussw
以后明显下降 ∀模型组上调基因多 o黄芩苷治疗组
中上调基因较模型组上调基因减少 o而下调基因较
模型组增多 ∀分析发现 ot个在模型组下调的基因
经黄芩苷治疗后上调 ov个在模型组上调的基因经
黄芩苷治疗后下调 ov个在模型组上调的基因经黄
芩苷治疗后表达进一步增强 ∀而且部分基因是未见
报道过的新基因 ∀表 t列出了部分差异表达基因 ∀
表 t 黄芩苷治疗后部分差异表达基因
基因录入号 平均比值 解释
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3 讨论
传统的 ‘²µ·«¨µ± ¥¯²·杂交或点杂交方法是以电
泳为基础的方法 o一次只能研究 t条或几条基因的
表达 o其研究效率 o尤其是研究基因群之间相互作用
和调控关系等方面受到极大的限制 ∀基因芯片技术
是 us世纪 |s年代中后期兴起的一项前沿技术 o其
特点是能大规模 !高通量和高平行性地研究成千上
万个基因的表达情况 ∀利用基因芯片可筛选疾病相
关基因 !研究新基因的功能 !诊断各类遗传性疾病和
感染性疾病 !研究药物作用机制及筛选药物等 ∀本
研究中模型组与假手术对照组之间差异表达的基因
群 o可视为疾病相关候选基因群 ∀该基因群表达的
上调或下凋可能与局灶性脑缺血大鼠的发病进程有
关 ∀这些基因涉及神经细胞结构 !信息传导 !能量代
谢 !氧化应激 !细胞凋亡等等 ∀以下对 Š ³µ²·¨¬± ³¤·«2
º¤¼¶∏³³µ¨¶¶²µo丙酮酸激酶k°Žl o波形蛋白等差异
表达基因予以讨论分析 ∀
3 .1 Š ³µ²·¨¬± ³¤·«º¤¼ ¶∏³³µ¨¶¶²µ Š蛋白 oŠ蛋白受
体和效应系统构成了生物体内一个重要的信号系
统 o骨骼肌 !平滑肌 !神经元 !卵母细胞及内分泌细胞
等需要快速应答极低浓度的细胞外刺激 o其信号转
导一般都经由受体2Š蛋白效应系统途径 ∀ Š蛋白在
信号转导过程中起到重要的作用 ∀另外 oŠ蛋白也
参与了光信号转导及磷脂代谢等生理过程 ∀一般认
为 o在信号转导过程中 oŠ蛋白主要起到信号放大和
分子开关作用≈y  ∀黄芩苷治疗组较模型组进一步使
Š ³µ²·¨¬± ³¤·«º¤¼¶∏³³µ¨¶¶²µt表达降低 o说明黄芩苷
对 Š ³µ²·¨¬± ³¤·«º¤¼能起到放大或增强作用 o可能与
应激调节有关 ∀
3 .2 °Ž 模型组 °Ž表达上调 o这与有关文献报道
一致≈z  o可能由于脑血管病致脑细胞缺血 !缺氧 o细
胞代谢障碍 o细胞大量坏死 o释放大量 °Ž所造成的 ∀
分子氧主要参与生物有机体的氧化还原反应 o作为
线粒体产生能量的终末电子受体发挥作用 ∀葡萄糖
经有氧氧化或无氧酵解产生 „×° o为多种哺乳动物
细胞的主要能源物质 ∀尽管目前关于 °Ž的研究有
很多 o血清 °Ž活性测定已被临床作为诊断和鉴别急
性心肌梗死的血清酶指标≈{  ∀神经精神学用测定血
清 °Ž活性作为神经肌肉疾病诊断和鉴别的依据≈|  ∀
特别对癫痫伴精神障碍时的诊断有较高价值≈ts  ∀
黄芩苷下调丙酮酸激酶的生理病理机制还不清楚 ∀
3 .3 波形蛋白k∂Œl 是一种细胞骨架蛋白 o中间
丝蛋白的一种 o它是维持细胞形态的物质基础 o并参
与细胞核在细胞内的定位和重排≈tt otu  o是神经系统
发育到一定阶段的细胞群体 o具有有限的自我更新
k增殖l和分化能力≈tv otw  ∀但在各种刺激后出现波形
蛋白的重新表达 o尤其是反应性胶质化时明显增强 o
反应性胶质化是一种常见的神经病理变化过程 o它
发生于几乎所有类型的脑损伤后≈tx  ∀黄芩苷治疗
组上调了波形蛋白的表达 o有利于胶质细胞的增殖
和轴突再生 ∀
黄芩苷对局灶性脑缺血的调控是多方面的 o尽
管目前尚不能完全解释这些基因群的生物学功能与
生理病理机制及基因群之间的相互作用 o但是本研
究表明 o黄芩苷可影响模型组大鼠基因表达谱 o从基
因水平上阐释黄芩苷的药理作用 o同时为基因芯片
技术高通量 !并行性研究疾病相关基因 o探索药物作
用的机理和作用靶点提供思路与借鉴 ∀
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中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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≈参考文献 
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激酶的动态变化 q解放军预防医学杂志 ot||z otxkxl }v{t q
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°¨¬¤²©µ¤·¥µ¤¬±l ¤±§¥¤¬¦¤¯¬±2·µ¨¤·¨§ªµ²∏³¶q°• ‘„¶º µ¨¨ µ¨√ µ¨¶¨ ¼¯·µ¤±¶¦µ¬¥¨§·²¦⁄‘„ º¬·«¬±¦²µ³²µ¤·¬²± ²©©¯∏²µ¨¶¦¨±·§˜×°k≤¼x ²µ≤¼v
§˜×°l·²³µ¨³¤µ¨ «¼¥µ¬§¬½¤·¬²± ³µ²¥¨¶q׫¨ °≤• ³µ²§∏¦·¶²©ws|y ª¨ ±¨ ¶º µ¨¨ ¶³²·¨§²±·«¨ ¦«¬³¤©·¨µ¤¶¨µ¬¤¯ ²©·µ¨¤·° ±¨·q׫¨ °¬¬¨ §³µ²¥¨¶
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≈Κεψ ωορδσ  …¤¬¦¤¯¬±~¦⁄‘„ °¬¦µ²¤µµ¤¼~©²¦¤¯ ¦¨µ¨¥µ¤¯ ¬¶¦«¨ °¬¤~ª¨ ±¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ³µ²©¬¯¨
≈责任编辑 古云侠 
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第 u|卷第 t期
ussw年 t月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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