全 文 ：311 深翻错沟措施对根腐病有一定控制作用 o若结
合药剂处理可收到更好的防治效果 ∀该措施用于育
苗地 o可增加一年的土地有效利用时间 o提高土地利
用率 ∀这对节约土地资源 !降低生产成本具有积极
的意义 ∀
312 深翻错沟只是农业辅助措施之一 o措施的应用
必须与其他技术相结合 ∀对已种植三七两年以上七
园 o因土壤带菌量太多 o不宜采用 ∀
313 根腐病的发生具有随时间推移逐渐加重的特
点 o生产上应以选育健壮无病种子或种苗 !土壤处
理 !种子或种苗处理为主 ∀土壤处理可用 zs h敌克
松可湿性粉剂 n ts h叶枯宁可湿性粉剂各 t ®ª制
成毒土撒施 ~种子 !种苗处理可用 x{ h瑞毒霉锰锌
可湿性粉剂k或 yw h杀毒矾可湿性粉剂l n ts h叶
枯宁可湿性粉剂 n水按 trxss配成药液后浸种 tx
∗ us °¬±∀
≈责任编辑 王康正
千层塔茎尖组织培养灭菌方法的研究
沈晓霞 o俞旭平 o盛束军
k浙江省中药研究所 o浙江 杭州 vtssuvl
千层塔为石杉科的蕨类植物 o它含有的石杉碱
甲素是一种高效胆碱酯醇抑制剂 o对重症肌无力症
的治疗有效率高达 || qu h o且还能提高脑内乙酰胆
碱的含量 ∀石杉碱甲素制剂k石杉碱甲素片 !哈伯因
等l现已应用于临床 o用于治疗老年人记忆减退和早
期老年性痴呆症 ∀由于全合成石杉碱甲素步骤繁
琐 !价格昂贵且有副作用 ∀因此 o现在无论是结构改
造还是直接作为药品 o石杉碱甲的主要来源还是少
数石杉科植物的提取 ∀该类植物是最古老的蕨类植
物群 o现已大多灭绝 o现存的该类植物大多生长缓
慢 o对环境要求苛刻 o且只有千层塔 Ηυπερζιασερρα2
τα !小杉兰 Λψχοποδιυ µ σελαγο等少数种类含有石杉
碱甲素 o故资源极其有限 ∀目前 o国内外对石杉科植
物的组织培养研究较少 ∀我们采用千层塔为实验材
料 o对其外植体进行组织培养 o筛选出一套理论上较
完善的灭菌方法和组织培养条件 o且进一步推断出
其植株中有内源真菌的共生 o并标记了内源真菌的
共生部位 o为内源真菌的大规模培养提供了依据 ∀
1 实验材料 千层塔茎尖采自安吉龙王山 o品质由
盛束军鉴定 ∀
2 实验方法
2 q1 灭菌 外植体首先用自来水冲洗 o然后在加有
洗涤剂的水中浸洗 o最后用清水冲洗干净 ∀灭菌时
≈收稿日期 usst2tt2vs
≈通讯作者 电话 }ksxztl{xuu|xyv 传真 }ksxztl{xuu|yz{
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先在超净工作台上用 zs h酒精浸泡 t °¬±o然后在
不同的灭菌剂中灭菌 ∀
2 q1 q1 次氯酸钠溶液灭菌 用不同浓度的次氯酸
钠溶液分别灭菌 ts otx ous oux °¬±o用无菌水冲洗
至少 v °¬±以上 o接种 ∀
2 q1 q2 升汞溶液灭菌 用 s .t h的升汞溶液分别
灭菌 u ov ow ox °¬±o用无菌水冲洗 v ∗ w次 o接种 ∀
2 q2 培养方法 分别在 ≥和 tru ≥培养基上 o
在 ux ε 恒温箱中 ouw «光照培养和暗培养对照 ∀
2 q3 推测内源真菌生长部位 用 s .t h升汞浓液
灭菌 v °¬±的茎段 o在无菌条件下用手术刀刮去表
皮 o进行培养 o并用未刮去表皮的茎段作对照培养 ∀
3 结果与分析
3 q1 千层塔的处植体灭菌
3 q1 q1 不同浓度次氯酸钠溶液的灭菌效果 浓度
不同 o灭菌效果不同 q饱和次氯酸钠溶液和 tru倍数
的饮和次氯酸钠溶液 o无论时间长短 o外植体陆续死
亡 o不出现污染 o说明浓度过高杀死了组织 ∀浓度为
饱和溶液的 trts时 o无论时间长短 o均出现 {| qv h
∗ tss h的污染率 o说明浓度过低 o灭菌不完全 o大部
分内生真菌未被杀死 ~trx倍的饱和次氯酸钠溶液
灭菌 tx °¬±效果最好 o在刚灭完菌的 ts ∗ tx §内不
出现污染 o之后逐渐出现污染 o在组织表面长出真
菌 o说明 trx倍数的饱和次氯酸钠溶液液灭菌 o表面
灭菌已完全 o但由于内生真菌的作用 o随培养时间的
推移 o不断在组织表面长出真菌 ∀因此 o解决该材料
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第 uz卷第 y期
ussu年 y月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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组织培养的污染问题 o首先要解决内生真菌的逐渐
污染这一难题 ∀
3 q1 q2 采用 s .t h 的升汞溶液灭菌 灭菌时间不
同 o产生的灭菌效果也不相同 ∀u °¬±灭菌 o大部分
外植体在 v ∗ w §内 o陆续出现污染 o说明灭菌时间
过短 o无法将表皮污染源杀死 ~w °¬±以上灭菌 o大
部分外植体陆续发白死亡 o说明灭菌时间过长 ~而 v
°¬±灭菌时间产生的效果与浓度为 us h的次氯酸钠
溶液灭菌 tx °¬±效果基本相同 o在 u周内不出现污
染 ∀
总之 o经过多种灭菌方法的摸索和比较 o发现千
层塔茎尖外植体的灭菌十分困难 ∀第 t次灭菌后 o
能在 tw ∗ tx §内不污染的灭菌方法k如采用 us h的
次氯酸钠溶液灭菌 tx °¬±os qt h的升汞溶液灭菌 v
°¬±ox h新洁尔灭溶液与升汞溶液交替灭菌 !磁力
搅拌仪处理后再用 us h的次氯酸钠溶液灭菌等方
法l是最有效的 o说明表面灭菌已完全 o分析后得出
一个新推断 o千层塔组织内部含内源真菌 o经过 u周
培养后逐渐出现污染 o将 u周后出现污染的外植体
同样方法再次灭菌后培养 o一般千层塔的茎尖需经
过 v ∗ w次灭菌后才能完全除去真菌 o灭菌成功率相
对较高 o可达 wu h ∀多次灭菌一般采用 us h的次氯
酸钠溶液灭菌 tx °¬±或 s qt h 的升汞溶液灭菌 v
°¬±的效果最好 o其余方法 o因为过程系琐 o成功率
反而降低 ∀
3 q2 培养条件
实验结果表明 o ≥ 和 tru ≥ 培养基 o对于千
层塔外植体培养的影响 o差异不大 ∀在恒温 ux ε 的
培养箱中培养 o发现 uw «的光照培养 ow ∗ x §后外
植体都发白死亡 o无法继续培养 o诱导愈伤组织 ∀只
有在暗培养的条件下 o茎外植体才保持嫩绿 o在含有
特殊前加物和加有 x °ª#ptu ow2⁄和 t °ªop t×
的 ≥基本培养基上培养诱导成功 o两个月后长褐
色的愈伤组织 o以后停止生长 o约两个半月后长出淡
黄色的愈伤组织 o生长速度为每月加倍 ∀
此外 o在自然光下 o不采取任何处理方法 o仅保
持茎外植体在一定环境空间内的湿度 ous ∗ vs §
后 o在茎节处长出灰白的幼根 o说明千层塔外植在培
养时不需要外加光源 ∀
3 q3 内源真菌生长部位的推断
经实验 o刮去表皮的茎段 o培养后 x§o有
zv qv h污染率 oy §有 |v qv h污染率 ~而未刮去表皮
的茎段 tx §后才出现 vv h的污染率 o表明内源真菌
不在表面部位 o存在于茎的皮层 o至少在表皮内组
织 ∀刮去表皮后 o内源真菌直接与培养基接触便很
快污染 o且污染率极高 ∀
我们从千层塔组织培养的实验中清楚地认识
到 o千层塔这类较低等且伴有内源真菌的蕨类植物
离体培养十分困难 o用其外植体的组织培养进行工
业化大规模生产 o应从提高石杉碱甲素含量和增加
培养细胞的生长速度两方面着手 o目前还有大量的
基础工作需要进一步深入研究与探讨 ∀此外 o检测
千层塔内源真菌中是否含有石杉碱甲素 o并利用其
进行工业化发酵来生产石杉碱甲素 o是否可能成为
石杉碱甲的来源 o尚需进一步实验论证 ∀
≈参考文献
≈t 郑珍贵 o黄永伯 o刘 涤 o等 q蛇足石杉的培养和石杉碱生成 q
中草药 ousss okvtl增刊 }tv| q
≈u 朱文廉 q植物组织培养中的外植体灭菌 q植物生理学通报 o
t||y ovukyl }www q
≈v 比可华 o赵建萍 o蒋小满 o等 q芋茎尖离体培养和快速繁殖 q广
西植物 ot||| ot|ktl }yt q
≈责任编辑 王康正
k上接第 wuz页l
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≈责任编辑 王康正
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