全 文 ：培养基中碳源和氮源对甘草愈伤组织生长
和黄酮类化合物合成的影响
杨世海 t3 o陶 静 t o刘晓峰 u o果德安 v o郑俊华 v
kt1吉林农业大学 中药材学院 o吉林 长春 tvstt{~
u1吉林亚泰 k集团 l股份有限公司 o吉林 长春 tvssvt~
v1北京大学 药学院 o北京 tsss{vl
≈摘要 目的 }研究碳源和氮源对甘草愈伤组织生物量积累和黄酮类化合物形成的影响 ∀方法 }在培养基中
添加不同质量分数的蔗糖和果糖以及不同比例的 nw和 pv o进行甘草愈伤组织的诱导和培养 o并用 °≤检测
愈伤组织中黄酮类化合物的含量 ∀结果 }u种碳源中 o甘草愈伤组织生物量积累和黄酮类化合物合成均以果糖为碳
源时高 ∀在用 uh果糖作为碳源时 o培养物中 x种黄酮类化合物的含量总和是 vh蔗糖作为碳源的 u倍 ∀果糖作为
碳源 o在 uh ∗ yh时 o随着质量分数的增加 o培养物中 x种黄酮类化合物的含量总和呈下降趋势 o但其中甘草查尔
酮的含量却增加 x倍以上 ∀硝态氮有利于甘草愈伤组织生长和黄酮类化合物的积累 ∀当 nw r pv 浓度比例为
tru时 o甘草愈伤组织中 x种黄酮类化合物含量的总和达最大值 o为 txt1wz Λª# ªpt ∀铵态氮抑制甘草愈伤组织生
长和黄酮类化合物的形成 ∀结论 }果糖作为碳源最有利于甘草愈伤组织生物量积累和黄酮类化合物的生物合成 ∀
硝态氮有利于甘草愈伤组织生长和黄酮类化合物的积累 ∀
≈关键词 甘草 ~愈伤组织 ~碳源 ~氮源 ~黄酮类化合物
≈中图分类号 ≥ xyz ≈文献标识码 ≈文章编号 tsst2xvsukussyluu2t{xz2sv
≈收稿日期 ussx2sw2tu
≈通讯作者 3 杨世海 oר¯} kswvtl wxvvvs{oƒ¤¬} kswvtl
wxvvvswo ∞2°¤¬¯} ¯¼¤±ª¶ ¼¤«²²q¦²°q¦±
甘草为豆科植物甘草 Γλψχψρρηιζα υραλενσισ
ƒ¬¶¦«1o胀果甘草 Γ1 ινφλατα
¤·1或光果甘草 Γ1
γλαβρα 1的干燥根及根茎 ∀甘草主要有效成分为
三萜和黄酮类化合物 o其中黄酮类物质具有较强的
生物活性 o现代药理学研究发现甘草黄酮类对肿瘤 !
胃溃疡和肝损伤等具有多方面的药效 ≈t ∀甘草组
织培养仅限于愈伤组织诱导与分化的研究报
道 ≈uov ∀有关利用甘草组织培养生产黄酮类成分及
影响因素的研究 o国内外未见报道 ∀本研究报道影
响甘草愈伤组织生物量积累和黄酮类化合物生物合
成的一些因素 o以探讨甘草细胞培养的适宜培养条
件 o为进一步开展甘草细胞悬浮培养和大量培养提
供参数指标 ∀
1 材料与方法
111 无菌材料的准备
甘草种子由北京时珍中草药研究所提供 o经北
京大学药学院郑俊华教授鉴定为 Γ1 υραλενσισ∀种子
置 w ε 冰箱中保存备用 ∀挑选充实饱满的甘草种
子 o用砂磨破种皮 o用自来水冲洗 vs °¬±o用 s1th
ª≤ u¯溶液浸 tu ∗ tx °¬±o再用无菌水冲洗 w ∗ x次 o
用灭菌滤纸吸干种子表面水分 o接种在 ≥sk不添
加激素 l琼脂培养基上 o置于 ux ε o光照 tu «# §pt
的条件下培养 ov §后种子伸出胚根 o待生长 u周后 o
苗高 v ∗ w ¦°时 o即可作为外植体材料 ∀
112 愈伤组织诱导
将无菌苗下胚轴切成 s1x ¦°的小段 o在无菌条
件下接种于诱导培养基上 k ≥ n
s1u °ª# pt n
u °ª# pt n vh蔗糖 n s1zxh琼脂 lo³ x1{o
ux ε o光照 tu «# §pt条件下培养 ∀每 ux §继代培
养 t次 ∀
113 愈伤组织培养
根据不同实验要求 o按各项处理方法进行 o取继
代培养 y代以上的愈伤组织进行各项实验 o此时愈
伤组织较为均匀一致 ∀将愈伤组织于灭菌培养皿内
均匀切成若干小堆 o分别接种到盛有 ux °琼脂培
养基的 xs °三角瓶中 o每瓶接种愈伤组织 t1x ª
k鲜重 l∀愈伤组织培养 vs §后收获 o置于 ys ε 烘
#zx{t#
第 vt卷第 uu期
ussy年 tt月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯1vto¶¶∏¨ uu
²√ °¨¥¨ µoussy
箱中烘干至恒重 o称其干重 ∀每项实验均重复 v次 ∀
114 黄酮化合物的 °≤条件
11411 黄酮类化合物的提取 准确称取干燥样品
粉末 t1s ªo置 ts °具塞试管中 o每次加 ts °氯
仿 o置超声波提取 v次 o时间分别为 |so yso vs °¬±o
过滤 o合并 v次滤液 o回收溶剂 o用甲醇溶解残渣 o在
ts °量瓶中定容 o用脂溶性微孔滤膜过滤 o备用 ∀
11412 标准溶液配制 精密称取甘草素 kl!异甘
草素 k
l!甘草苷 k≤ l!异甘草苷 k⁄l!甘草查尔酮
k∞l标准品各 ts °ªo分别溶于 ts °量瓶中 o加甲
醇定容 o作为测试标准溶液 ∀
11413 色谱条件 • ¤·¨µ¶ ¬¯¯ ±¨±¬∏° usts°≤系
统 o≥«¬° p °¤¦® ≤≤ p ⁄≥色谱柱 ky °° ≅ txs
°°l~流动相 为 vh 醋酸水溶液 ~
为 tssh 乙
腈 o梯度洗脱 ~检测波长 o ≤组为 uzz1s ±°o
o
⁄o ∞组为 vzt1y ±°∀在上述色谱条件下 o用 °≤
测定各样品的峰面积 o根据回归方程计算甘草素 !异
甘草素 !甘草苷 !异甘草苷 !甘草查尔酮的含量 ∀
2 结果与分析
211 不同碳源对甘草愈伤组织生长及黄酮类化合
物合成的影响
在植物组织和细胞培养中 o一般采用蔗糖 !果糖
和葡萄糖作为碳源 ∀糖对次生代谢的作用 o首先表
现在不同的碳源对次生代谢产物的积累及细胞的生
长不一致 ≈wox ∀
为了确定适于甘草愈伤组织生长及黄酮类化合
物合成的碳源和质量分数 o本实验选用不同质量分
数的蔗糖和果糖作为碳源 ∀结果见表 t∀
表 t 碳源对甘草愈伤组织生长及黄酮类化合物合成的影响
碳源
质量分数
rh
愈伤组织鲜重 k干重 l
rª
黄酮类化合物 rΛª# ªpt
甘草素 异甘草素 甘草苷 异甘草苷 甘草查尔酮
蔗糖 u wquv ? sqw|{ksqvs ? sqstzl uxqw{ ttqxv t{qz{ tyqz| tsq{v
v wqxu ? sqwwsksqvx ? sqswtl uyq|x tvqv| uuqvs utqws tsqsx
w vqzu ? sqytzksqvy ? sqsuyl vwqyu tuqwu t{qv{ tyq{v ttqt{
x vqs ? squ{|ksqvz ? sqsusl utqyv tuqxt twq|s tvq|y tsqvv
y uq|{ ? sqwyuksqv{ ? sqstvl tyqty tsqss txqwz tuqw{ ttqtv
果糖 u wqv| ? sq{syksqu{ ? sqsvyl {uqzt uxqvy vyq{s vtqs tuqww
v wqs{ ? sq|vsksqvs ? sqsvyl ywqxv t|qzt vwq{s uwq|u tzqtz
w vqxu ? sqy{vksqvt ? sqsxvl wxqw| tzqvu uzqw| tzqws wxqvz
x vqwv ? sqwxxksqvx ? sqsvwl vyquy tyqvy uzqzx t{qwu wsq{y
y uqwu ? sqv||ksqu| ? sqswzl tzqtv tsqsx txqzx tsqwv zuqys
结果表明 ou种碳源中 o甘草愈伤组织生物量积
累和黄酮类化合物合成均以果糖为碳源时高 ∀在用
uh果糖作为碳源时 o培养物中 x种黄酮类化合物的
含量总和是 vh蔗糖作为碳源的 u倍 ∀果糖作为碳
源 o在 uh ∗ yh o随着质量分数的增加 o培养物中 x
种黄酮类化合物的含量总和呈下降趋势 o但其中甘
草查尔酮的含量却增加 x倍以上 ∀
212 nw r pv对甘草愈伤组织生长及黄酮类化合
物合成的影响
氮源的种类 k nw和 pv l和浓度对细胞生长
和次生产物合成的影响非常显著 ∀研究表明 o以
nw或 pv为唯一氮源时 o均不利于植物细胞的生
长 ≈y ∀本实验中 ≥培养基总氮浓度保持不变为 ys
°°²¯# pt o考察 nw r pv浓度比例对甘草愈伤
组织生长和黄酮类化合物生物合成的影响 o结果见
表 u∀由表 u可见 o硝态氮有利于甘草愈伤组织生
长和黄酮类化合物的积累 ∀当 nw r pv浓度比例
为 tru时 o甘草愈伤组织中 x种黄酮类化合物含量
的总和达最大值 ∀铵态氮抑制甘草愈伤组织生长和
黄酮类化合物的形成 ∀
表 u 氮源对甘草愈伤组织生长及黄酮类化合物合成的影响
nw r pv
愈伤组织鲜重 k干重 l
rª
黄酮类化合物 rΛª# ªpt
甘草素 异甘草素 甘草苷 异甘草苷 甘草查尔酮
tΒs uqwz ? sqvswksqut ? sqstzl txq|u yqxu twqvu ttqtu txqyx
sΒt wq|u ? squ{|ksqws ? sqst{l v|qy{ vyqs| uyq{w utqu{ ttqst
tΒt vqxx ? squtwksqu| ? sqsutl vuqvu tsqxu utqys twq|w utqyu
tΒu yq|s ? squyyksqx| ? sqsvwl wuqs{ u{qy| vyqsz vwqxy tsqsz
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第 vt卷第 uu期
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Χηινα ϑουρναλοφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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3 讨论
碳源是细胞生长的能量来源和构成细胞骨架的
重要成分 ∀培养基中糖不仅起到碳源的作用 o而且
还有调节渗透的作用 o碳源的种类和浓度对愈伤组
织细胞生长和次生代谢产物的含量有明显影
响 ≈wox ∀本试验研究表明 o甘草愈伤组织培养中果
糖是适宜碳源 o其中 uh果糖最有利于愈伤组织生
物量积累和黄酮类化合物的生物合成 ∀
氮是细胞中核酸的组成成分 o也是生物体许多
酶的成分 ∀氮被植物吸收利用后转化为氨基酸再转
化为蛋白质 o然后被植物利用 ∀氮主要以铵态氮
k nw l和硝态氮 k pv l两种形式被利用 ∀氮源的
种类和浓度对细胞生长和次生产物合成的影响非常
显著 ≈z2tt ∀本试验中 o当培养基中铵态氮和硝态氮
的比例为 tru时 o显著促进甘草愈伤组织生物量积
累及次生代谢产物的合成 ∀
通过研究不同碳源和氮源对甘草愈伤组织生长
和黄酮类化合物合成的作用 o明确甘草细胞培养的
适宜条件 o为进一步开展甘草细胞悬浮培养和大量
培养奠定基础 ∀
≈参考文献
≈t 贾国惠 o贾世山 q甘草中黄酮的药理研究进展 ≈ q中国药
学杂志 o t||{o vvk|l} xtvq
≈u 芮和恺 o忻晓君 o顾慧芬 o等 q甘草的组织培养 ≈ q植物生
理学通讯 o t|{yo kwl} xwq
≈v 安利佳 o李凤霞 o张俊敏 o等 q豆科植物组织培养研究 ≈ q
植物学报 o t||uo vwktsl} zwvq
≈w ¬±2²²± ¬°o ¨²±ª2«º¤± ≠∏±o ≠ ²±ª2≥²²± º¤±ªo ·¨¤¯q °µ²2
§∏¦·¬²± ²© ·¤¬²¯ ¤±§ ·¤¬¤± ¶¨¬± Ταξυσ βρεϖιφολια ¦¨ ¯¯ ¦∏¯·∏µ¨¶}
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¶¬²± ¦∏¯·∏µ¨ ²©≥«¨ µ¬§¤± ªµ¤³¨ ¶≈ q ° ¤¯±·
¬²·¨¦«o ussuo w
kul}{vq
≈{ 许明淑 o黄璐琦 o陈美兰 o等 q几种理化因子对贯叶金丝桃
细胞培养中的细胞生长和总金丝桃素合成的影响研究 ≈ q
中国中药杂志 o ussvo u{ktsl} |utq
≈| 于荣敏 o赵鸿莲 o郑玉果 o等 q银杏愈伤组织培养及其代谢
产物银杏内酯的研究 ≈ q生物工程学报 o t|||o txktl} xuq
≈ts 陈永勤 o朱蔚华 o吴蕴祺 o等 q组培条件对云南红豆杉愈伤
组织生长和形成紫杉醇的影响 ≈ q中国中药杂志 o ussso
uxkxl} uy|q
≈tt 张治国 o韩献忠 o蔡志光 o等 q条叶龙胆愈伤组织培养及龙
胆苦甙形成 ≈ q植物学报 o t||uo vwkul} |yq
Εφφεχτσ οφ χαρβον σουρχε ανδ νιτρογεν σουρχε ον χαλλυσ γροωτη ανδ
φλαϖονοιδ χοντεντ ιν Γ λψχψρρηιζα υραλενσισ
≠ ≥«¬2«¤¬t o × ¬±ªt o ÷¬¤²2©¨±ªu o ⁄ 2¨¤±v o ∞ ∏±2«∏¤v
(t1 Χολλεγε οφ Χηινεσε ΜεδιχιναλΜατεριαλ, ϑιλιν ΑγριχυλτυραλΥνιϖερσιτψ, Χηανγχηυν tvstt{, Χηινα;
u1 ϑιλιν ΨαΤαι Γρουπ Χο1 Λτδ1 , Χηανγχηυν tvssvt, Χηινα;
v1 Σχηοολοφ Πηαρµ αχευτιχαλΣχιενχεσ, Πεκινγ Υνιϖερσιτψ, Βειϕινγ tsss{v, Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ײ¶·∏§¼·«¨ ©¨©¨¦·¶²©¦¤µ¥²± ¶²∏µ¦¨ ¤±§±¬·µ²ª¨ ± ¶²∏µ¦¨ ²± ¦¤¯ ∏¯¶ªµ²º·«o ¤±§©¯¤√²±²¬§¦²±·¨±·¬± Γλψ2
χψρρηιζα υραλενσισ1 Μετηοδ : ±§∏¦·¬²± ¤±§¦∏¯·∏µ¨ ²©¦¤¯ ∏¯¶º µ¨¨ ¦²±§∏¦·¨§¬± ·«¨ ° §¨¬¤²©§¬©©¨µ¨±·¦²±¦¨±·µ¤·¬²±¶²©¶∏¦µ²¶¨o¤±§©µ∏¦2
·²¶¨ ¤±§µ¤·¬² ²© nw r pv o¤±§©¯¤√²±²¬§¦²±·¨±·º¤¶° ¤¨¶∏µ¨§¥¼ °≤q Ρ εσυλτ: ׫¨ µ¨¶∏¯·¶¶«²º §¨·«¤·©µ∏¦·²¶¨ º¤¶¶∏³¨ µ¬²µ·²
¶∏¦µ²¶¨ ©²µ¦¤¯ ∏¯¶ªµ²º·«¤±§©¯¤√²±²¬§©²µ°¤·¬²±o ¤±§·«¨ ²³·¬°∏° ¦²±¦¨±·µ¤·¬²± º¤¶uh q ׫¨ ©¯¤√²±²¬§¶¦²±·¨±·º¤¶u ·¬° ¶¨«¬ª«¨ µ
·«¤± ·«¤·²©¶∏¦µ²¶¨ ¤¶¦¤µ¥²± ¶²∏µ¦¨¶q ± ·«¨ µ¤±ª¨ ²©uh 2yh ²©©µ∏¦·²¶¨ ¦²±¦¨±·µ¤·¬²±o ·«¨ ©¯¤√²±²¬§¦²±·¨±·º¤¶§¨ ¦µ¨¤¶¨§ ¤¯²±ª
º¬·«·«¨ ¦²±¦¨±·µ¤·¬²± ²©©µ∏¦·²¶¨o ¥∏··«¨ ¬¯¦²¦«¤¯¦²±¨º¤¶¬±¦µ¨¤¶¨§x2©²¯§q ׫¨ «¬ª«¨ ¶·©¯¤√²±²¬§¦²±·¨±·²©txt1wz Λª# ªpt º¤¶²¥2
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Χονχλυσιον: ƒµ∏¦·²¶¨ ¤¶¦¤µ¥²± ¶²∏µ¦¨ º¤¶¶∏³¨ µ¬²µ·²¶∏¦µ²¶¨ ©²µ¦¤¯ ∏¯¶ªµ²º·«¤±§©¯¤√²±²¬§©²µ°¤·¬²±o ¤±§ pv º¤¶©¤√²µ¤¥¯¨·²·«¨
¦¤¯ ∏¯¶ªµ²º·«¤±§©¯¤√²±²¬§¶¤¦¦∏°∏¯¤·¬²±q
[ Κεψ ωορδσ] Γλψχψρρηιζα υραλενσισ; ¦¤¯ ∏¯¶~ ¦¤µ¥²± ¶²∏µ¦¨~ ±¬·µ²ª¨ ± ¶²∏µ¦¨~ ©¯¤√²±²¬§¶ ≈责任编辑 张宁宁
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第 vt卷第 uu期
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