全 文 ：葛根素对成骨细胞生物学作用的实验研究
臧洪敏 3 o陈君长 o刘亦恒 o王坤正
k西安交通大学 第二医院 o陕西 西安 ztssswl
≈摘要 目的 }观察葛根素对体外培养 ≥⁄大鼠成骨细胞增殖 !分化 !矿化的影响 ∀方法 }取新生 ≥⁄大鼠的颅
骨 o胶原酶法培养成骨细胞 ∀应用 ××法 o对硝基苯磷酸盐法k°°°l及茜素红染色方法观察葛根素对体外培养成
骨细胞的增殖 !碱性磷酸酶活性及矿化结节形成的影响 ∀结果 }葛根素具有刺激成骨细胞增殖 o提高碱性磷酸酶活
性及矿化结节形成数量的作用k Π s1st或 Π s1sxl ∀结论 }葛根素具有促进成骨细胞的增殖 !分化及矿化的作
用 ∀
≈关键词 葛根素 ~细胞培养 ~成骨细胞 ~骨质疏松症
≈中图分类号 u{x1x ≈文献标识码 ≈文章编号 tsst2xvsukussxluw2t|wz2sv
≈收稿日期 ussx2sx2u{
≈通讯作者 3 臧洪敏 oר¯ }tvtt|tvszw| o ∞2°¤¬¯}½«°t|z
tyv1¦²°
骨质疏松症k³l是绝经后女性和老年人的常
见病 ∀目前临床上治疗 ³通行的是雌激素替代疗
法 ∀但长期 !大量应用雌激素有导致乳房胀痛 !阴道
出血 o增加乳腺癌和子宫内膜癌发病率的危险 ∀而
葛根素是中药葛根的主要成分 o属于植物雌激素 o具
有雌激素样活性 o但副作用相对较少 ∀已有学者报
道葛根素对原发性骨质疏松症有良好的防治作
用≈t ou ∀为了进一步阐明此药的作用机制 o对体外
培养的新生 ≥⁄大鼠成骨细胞进行干预 o从细胞水
平观察葛根素对成骨细胞增殖 !分化和矿化的影响 o
进行了实验 ∀
1 材料和仪器
111 试剂
胎牛血清k杭州四季青公司l o⁄∞ 培养基k美
国 ¬¥¦²公司l o °tyws培养液k¬¥¦²l o胰酶及四
甲基偶氮唑盐k ×× 试剂l和 ´型胶原酶k≥¬ª°¤公
司l o碱性磷酸酶k°l试剂盒k北京中生公司l o葛
根素注射液k陕西安康制药厂 o批号 ussususzl ∀
112 仪器
倒置显微镜k¯ ¼°³∏¶l o≤u培养箱 o细胞培养板
k¬¥¦²l ozuv 型分光光度计 o∞÷{s{ 酶标仪k美国
¬²2× ®¨公司l等 ∀
2 方法
211 药物及分组
葛根素注射液每支 u °o含葛根素 tss °ª∀分
为 w组 o以含 ts h胎牛血清的 tyws培养液分别配成
剂量为 us ows o{s °ª#pt的供试液及双蒸馏水对照
组 ow ε 保存 o备用 ∀
212 成骨细胞的分离与培养≈v
取出生 uw «内的 ≥⁄大鼠k由西安交通大学医
学院实验动物中心提供l的颅骨 o彻底剥离骨膜等软
组织 o置入含 ⁄∞ 培养液的培养皿中修剪成
t °° ≅ t °°≅ t °°的骨片 ∀加入 s1t h ´型胶原
酶在 vz ε 环境下振荡消化 xs °¬±o再加入等体积的
胎牛血清终止消化 ∀收集消化液 o在 w ε ot sss µ#
°¬±pt条件下离心 ts °¬±使细胞沉淀 ∀沉淀细胞放
置于含 tx h胎牛血清 ⁄∞ 培养基和 °∞≥×k青霉素
tss #°pt o链霉素 tss Λª#°ptl的培养皿内 ∀并
以约 u ≅ tsw ∗ x ≅ tsw#¦°pu的密度接种于培养瓶中 o
放入 vz ε ox h ≤u培养箱内培养 ∀每 u ∗ v §换液
t次 ∀待细胞长满后进行传代 o使用第 v代细胞进
行实验 ∀倒置显微镜下观察细胞生长情况并行 °
染色k图 t oul ∀
图 t 倒置显微镜下成骨细胞k ≅ ussl
#zw|t#
第 vs卷第 uw期
ussx年 tu月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1vs o¶¶∏¨ uw
⁄¨ ¦¨ °¥¨µoussx
图 u 成骨细胞k°染色 o≅ wssl
213 观察指标≈w ox
21311 细胞增殖功能测定 成骨细胞以每孔 y ≅
tsv个细胞的密度接种于 y孔培养板中 o每孔加入含
tx h胎牛血清的培养基 o在 vz ε ox h ≤u条件下培
养 ∀uw «后分别换入不同浓度葛根素的 ⁄∞ 培
养基继续培养 uw ow{ ozu «∀采用 ××法 o于 xzs ±°
波长测吸光度值kΑl o在酶标仪上进行测试 ∀
21312 细胞分化功能测定k°活性测定l 同上 o
加不同剂量葛根素的 ⁄∞ 培养基培养 w{ ozu o|y «
后 o细胞经 s1t h ×µ¬·²± ÷2tss溶解液破碎制成细胞
悬液 o以对硝基酚磷酸盐k°°°l作底物 o用分光光
度计测定各组细胞溶液中的 °活性k条件为 ³
ts1x ovz ε 条件下 o波长为 wsx ±°l o再用考马斯亮
蓝法测定蛋白质含量k°ª#ptl o°活性以 ®#ªpt
表示 ∀
21313 细胞矿化功能测定 以每孔 t ≅ tsw个将细
胞加入 uw孔培养板 o加入含 tx h胎牛血清的培养基
培养 ∀uw «后换入含 xs Λª#°pt维生素 ≤ ot °°²¯#
pt的 2Β甘油磷酸钠的不同剂量葛根素培养基 ∀u
§换液 t次 ∀培养 tw §后用 |x h乙醇固定 ts °¬±o
s1t h茜素红溶液染色 vs °¬±∀以橘红色结节边界
清晰 o直径 uss Λ°为矿化结节的计数标准 ∀在低
倍镜下对各孔作矿化结节计数k矿化结节数r视野l ∀
本实验采用双盲法 ∀
214 统计学方法
用 ≥°≥≥ts1s软件进行处理 o参数值用 cξ ? σ表
示 ,组间比较采用 τ检验 ∀
3 结果
311 葛根素对成骨细胞增殖的影响
在 uw ow{ ozu «时中 !高剂量组的 Α值明显高于
对照组k Π s1stl ∀低剂量组的 Α值在 zu «时点明
显高于对照组k Π s1sxl o低剂量组在 uw ow{ «时点
与对照组相比无显著差异k Π s1sx o表 tl ∀
表 t 各实验组对成骨细胞增殖的影响kcξ ? σ, ν yl
组别
剂量
r°ª#pt
Α
uw « w{ « zu «
对照组 s qu{x ? s qstw s qv{z ? s qswt s qwzu ? s qsyu
葛根素 us s qvtz ? s qsty s qwtu ? s qsuz s qxwz ? s qsuttl
ws s qwzy ? s qsw{ul s qyzy ? s qswuul s q{u{ ? s qsyzul
{s s qyu| ? s qsvzul s q{sz ? s qsv|ul s q|t| ? s qs{yul
注 }与对照组比tl Π s1sx oul Π s1stk表 u同l
312 葛根素对 °活性水平的影响
中 !高剂量组在 w{ ozu o|y «时及低剂量组在
zu o|y «时 °活性水平高于对照组k Π s1stl ∀
低剂量组在 w{ «时 °活性水平与对照组无显著
差异k Π s1sx o表 ul ∀
313 葛根素对矿化结节数的影响
中 !高剂量组矿化结节数量k矿化结节数r视
野l o明显高于对照组k Π s1stl ~而低剂量组矿化
结节数与对照组无显著差异k Π s1sx o表 ul ∀
表 u 各实验组 °活性及矿化结节数测定kcξ ? σ, ν yl
组别
剂量
r°ª#pt
°r®#ªpt
w{ « zu « |y « 矿化结节数
对照组 s quvx ? s qsvz s qvxt ? s qszu s qwut ? s qsyv t qwz ? s qwt
葛根素 us s quz| ? s qsw| s qxx| ? s qsywul s qysu ? s qsy{ul t q|{ ? s qzv
ws s qywz ? s qsx{ul s qzwy ? s qsxvul s qz{u ? s qswzul w qyt ? s qxzul
{s s qz|t ? s qszuul s q{u| ? s qsztul s q{wy ? s qs|tul y qux ? s qz|ul
4 讨论
骨质疏松症是指单位体积骨量减少伴有骨强度
的降低 o主要与骨吸收和骨形成的动态平衡失调有
关 ∀而骨形成和吸收主要由成骨细胞和破骨细胞来
完成 ∀骨细胞分泌骨基质 o并参与骨基质及钙的代
谢 o是骨形成 !生长和发育主要的功能细胞 ∀所以 o
促进成骨细胞的增殖在骨质疏松症防治中有重要意
义 ∀
本实验结果显示 }不同剂量的葛根素均可增高
成骨细胞增殖率 o以中 !高剂量组的作用较为明显
kΠ s1stl o低剂量组在 zu «时明显k Π s1sxl ~不
同剂量给药组培养 w{ «后 o°活性增强 o提示葛
根素能促进成骨细胞分化 ~葛根素中 !高剂量组矿化
结节数量 o显著多于对照组k Π s1stl o提示其具有
促进成骨细胞矿化结节形成的作用 ∀ °是成骨细
胞所分泌的一种酶蛋白 o°活性的高表达是成骨
#{w|t#
第 vs卷第 uw期
ussx年 tu月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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⁄¨ ¦¨ °¥¨µoussx
细胞分化的特异性标志≈y oz o是最常见评价骨形成
的指标 ∀成骨细胞是促进骨矿化的主要细胞 o矿化
是细胞进一步分化成熟的功能表现≈{ o为骨形成的
敏感标志 ∀矿化结节形成代表了成骨细胞的分化成
熟 o是成骨功能的形态表现 ∀实验表明葛根素不仅
有刺激成骨细胞增殖作用 o对 °活性和矿化结节
形成也有较好刺激作用 ∀说明在促进细胞增殖的同
时 o也能促进细胞进一步分化成熟 o因而可提高成骨
细胞骨形成的功能 ∀
中药葛根主要成分是异黄酮 o包括葛根素 !大豆
苷 !金雀异黄素和拟雌内酯等≈| ∀研究发现有雌激
素样活性的异黄酮具有改善骨质代谢等作用 ∀
¯¤µ¬µ等≈t 用含异黄酮的饲料喂食去卵巢大鼠 o发现
大鼠的股骨密度明显增高 ∀郑高利等≈u 使大鼠口服
异黄酮后 o发现骨矿含量 !骨密度和生物力学强度均
有不同程度的改善 o认为葛根素对骨质疏松症具有
明显的防治作用 ∀而成骨细胞和破骨细胞表面均有
雌激素受体≈ts o又分别是骨质合成和分解代谢中的
主要功能细胞 ∀因而 o以上研究结果均提示葛根素
可以用于防治骨质疏松症 ∀
本实验在细胞水平观察了葛根素对成骨细胞的
直接作用 o说明其治疗骨质疏松的作用机制与其促
进成骨细胞的增殖 !分化及矿化的作用有关 o为葛根
素临床治疗骨质疏松症提供了理论和实验依据 ∀
≈参考文献
≈t
¯¤µ¬µ ≤ o²µ§¤± ≥ ∞o°¨ ·¨µ¶²± × o ετ αλ. ∂¤µ¬¤¥¯¨ ©¨©¨¦·¶²©·¼2
µ²¶¬±¨ ®¬±¤¶¨ ¬±«¬¥¬·²µ²± ¤√¬¤± ²¶·¨²¦¯¤¶·¬¦¤¦·¬√¬·¼ ¤±§µ¨§∏¦·¬²± ²©
¥²±¨ ²¯¶¶¬±²√¤µ¬¨¦·¬²°¬½¨ §µ¤·¶q Χελλ Βιοχηεµ , t||y oytkwl }yu| q
≈u 郑高利 o张信岳 o方晓林 o等 q葛根异黄酮对去卵巢大鼠骨矿
密度和骨强度的影响 q中草药 ousst ovukxl }wuu q
≈v 王 前 o钟世镇 o龚文汇 o等 q鼠颅盖骨成骨细胞体外培养及
°免疫组化法鉴别纯化 q中华骨科杂志 ot||x otxkyl }vyw q
≈w 张荣华 o舒晓春 q中药复方补肾活血液对成骨细胞影响的实
验研究 q中国病理生理杂志 oussv ot|kyl }zy| q
≈x 金慰芳 o朱文菁 o王洪复 o等 q补肾中药 2∞≤≥对培养成骨
细胞增殖 !分化及矿化功能的影响 q中国骨质疏松杂志 o
usst ozk{l }| q
≈y ƒ¤µ¯¨ ¼ o≥·¬¯·2≤²©©¬±ª
q ³²³·²¶¬¶°¤¼ §¨·¨µ°¬±¨ ·«¨ µ¨¯¨ ¤¶¨ ²©
¶®¨ ¯¨·¤¯ ¤¯®¤¯¬±¨ ³«²¶³«¤·¤¶¨ ¤¦·¬√¬·¼©µ²° «∏°¤± ²¶·¨²¥¯¤¶·2¯¬±¨ ¦¨¯¯ q
Χαλχιφ Τισσυε Ιντ , usst oy{ktl }wv q
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ª¨ ¶¯q Βιοχηεµ Βιοσηψσ Ρεσ Χοµ µυν , ussv ovttktl }tz| q
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Χαλχιφ Τισσυε Ιντ , t|{y ov{ }twv q
≈| 王本祥 q现代中药药理学 q天津 }天津科学技术出版社 o
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²© ¶¨·µ²ª¨ ± µ¨¦¨³·²µ¥¨·¤u o¤©∏±¦·¬²±¤¯ √¤µ¬¤±·²© ¶¨·µ²ª¨ ± µ¨¦¨³·²µ
¥¨·¤ ¬¨³µ¨¶¶§¬± ±²µ°¤¯ µ¤··¬¶¶∏¨¶q Ενδοχριονολογψ, t||{ otv|kvl }
ts{u q
Εξπεριµενταλστυδψ οφ τηε εφφεχτσ οφ πυεραριν ον βιολογιχαλ χηαραχτερσ
οφ οστεοβλαστσ ιν ϖιτρο
²±ª2°¬±o≤∞∏±2¦«¤±ªo ≠¬2«¨ ±ªo • ∏±2½«¨ ±ª
( ∆επαρτµεντ οφ Ορτηοπεδιχσ, Σεχονδ Ηοσπιταλ οφ Ξι. αν ϑιαοτονγ Υνιϖερσιτψ, Ξι. αν ztsssw , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε : ײ ²¥¶¨µ√¨·«¨ ©¨©¨¦·²©³∏¨µ¤µ¬± ²± ¦¨¯¯ ³µ²¯¬©¨µ¤·¬²±o§¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²±o°¤·∏µ¤·¬²± ¤±§°¬±¨ µ¤¯¬½¤·¬²±¬±¦∏¯·∏µ¨§
µ¤·²¶·¨²¥¯¤¶·¶q Μετηοδ : ¶·¨²¥¯¤¶·¶©µ²° ¦µ¤±¬∏°¶²©±¨ º¯ ¼ ¥²µ± ≥⁄µ¤·¶º µ¨¨ ¦∏¯·∏µ¨§ ιν ϖιτρο . ×× o°°° ¤±§ ≥ º µ¨¨ ∏¶¨§·²²¥¶¨µ√¨
·«¨ ³µ²¯¬©¨µ¤·¬²±o¤¦·¬√¬·¼ ²©° ¤±§·«¨ ±∏°¥¨µ²©°¬±¨ µ¤¯ ±²§¨ ²©¦∏¯·∏µ¨§²¶·¨²¥¯¤¶·¶ιν ϖιτρο . Ρεσυλτ : ·º¤¶©²∏±§·«¤·³∏¨µ¤µ¬± «¤§·«¨ ©¨2
©¨ ¦·²± ¶·¬°∏¯¤·¬±ª¦¨¯¯ ³µ²¯¬©¨µ¤·¬²±o¤¦·¬√¬·¼²©° ¤±§·«¨ ±∏°¥¨µ²©°¬±¨ µ¤¯ ±²§¨ ²©¦∏¯·∏µ¨§²¶·¨²¥¯¤¶·¶k Π s1st ²µΠ s1sxl qΧονχλυ2
σιον : °∏¨µ¤µ¬± ¦¤± ³µ²°²·¨ ³µ²¯¬©¨µ¤·¬²±o§¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²±o °¤·∏µ¤·¬²± ¤±§ °¬±¨ µ¤¯¬½¤·¬²± ²©·«¨ ²¶·¨²¥¯¤¶·¶ιν ϖιτρο .
[ Κεψ ωορδσ] ³∏¨µ¤µ¬±~¦¨¯¯ ¦∏¯·∏µ¨ ~²¶·¨²¥¯¤¶·¶~²¶·¨²³²µ²¶¬¶
≈责任编辑 方文贤
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第 vs卷第 uw期
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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