全 文 ：熟地黄对毁损下丘脑弓状核大鼠学习记忆及
海马¦2©²¶oƒ表达的影响
崔 瑛t o侯士良t o颜正华u o常章富u
kt q河南中医学院 临床中药学科 o河南 郑州 wxsssu ~
u q北京中医药大学 中药学院 o北京 tsssu|l
≈摘要 目的 }研究熟地黄改善学习记忆的作用及机理 ∀方法 }采用谷氨酸单钠k ≥ l毁损下丘脑弓状核大
鼠模型 o通过跳台实验和 ²µµ¬¶水迷宫实验观察熟地黄对学习记忆的影响 ~免疫组化法观察大鼠海马 ¦2©²¶o神经
生长因子kƒl 表达 ∀结果 }熟地黄能延长 ≥ 大鼠跳台实验潜伏期 !减少错误次数 ~缩短水迷宫实验寻台时
间 o提高垮台百分率 ~提高 ¦2©²¶o ƒ 在海马的表达 ∀结论 }熟地黄有改善 ≥ 大鼠学习记忆作用 o作用机理可
能与提高 ¦2©²¶o ƒ 在海马的表达有关 ∀
≈关键词 熟地黄 ~学习记忆 ~ ≥ 模型 ~¦2©²¶~ƒ
≈中图分类号 u{x qx ≈文献标识码 ≈文章编号 tsst2xvsukussvlsw2svyu2sw
熟地黄为玄参科植物地黄的干燥块茎炮制而
成 ∀功能补血滋阴 o益精填髓 ∀是优良的滋阴补血
药 ∀被誉为/壮水之主 o补血之君0 o广泛用于阴虚 !
血虚所致的各种病症 ∀古今临床在治疗健忘 !痴呆
的复方中频繁使用≈t ou ∀根据熟地黄的性能特点 o以
及阴虚 !学习记忆功能障碍和下丘脑2垂体2肾上腺
k°l轴关系的认识 o我们提出熟地黄益智研究应
在基本符合中医肾阴虚证候 !有突出的学习记忆功
能障碍 !伴有 ° 轴功能亢进的动物模型上进
行≈v ∀通过筛选 o选择谷氨酸单钠k ≥l毁损下丘
脑弓状核动物模型进行了熟地黄改善学习记忆的实
验 ∀
1 材料与方法
1 q1 主要试剂
左旋谷氨酸单钠k ≥l oƒ ∏¯®¤进口分装 o购自
上海化学试剂站分装厂 ∀使用时以生理盐水溶解 ~¦2
©²¶免疫组化试剂盒 !ƒ 免疫组化试剂盒 o购自北
京中山生物技术公司 ~⁄
显色剂 o≥¬ª°¤公司 ∀
1 q2 药品
熟地黄煎剂 地黄 Ρεηµ αννια γλυτινοσα ¬2
¥²¶¦«q的干燥块茎 o购自河南省武陟县药材公司 o一
等品 ∀经河南中医学院生药学科陈随清副教授鉴
≈收稿日期 ussu2sy2us
≈通讯作者 ר¯ }ksvztl yvwstut
定 ∀按5中国药典6kusss 年版 o一部l酒炖法制成熟
地黄 ∀取熟地黄 o第 t 次加 y 倍水煎煮 t «o第 u ov
次各加 w倍水 o每次煎煮 t «o滤取上清 o合并 v次药
汁 o过滤 o浓缩至 tΒt ow ε 保存备用 ∀
六味地黄煎剂 取5小儿药证直诀6六味地黄丸
原方 o除熟地黄自制外 o山药 !山茱萸 !泽泻 !牡丹皮 !
茯苓等 o购自河南省药材公司 ∀经陈随清副教授鉴
定 ∀上述药物依次按 {ΒwΒwΒvΒvΒv 重量比例称量 ∀
煎煮方法同熟地黄 o制得 tΒt 药液 ow ε 保存备用 ∀
1 q3 动物分组
≥⁄大鼠k普通级l购自河南省实验动物中心 o实
验室繁殖 o取雄性新生鼠于出生后第 u ow oy o{ ots §
皮下注射 ≥w °ª#ªp t #§p t o对照组皮下注射
s q| h ¤≤¯∀u{ §离乳 o分笼饲养 o至第 { 周时 o将
大鼠分成 x 组 o即正常组k注射 ¤≤ l¯ !模型组 !六味
地黄煎剂组kw ª#®ªp tl !熟地黄大剂量组k{ ª#
®ªp tl !熟地黄小剂量组kw ª#®ªp tl o正常组和模型
组给予饮用水 o各组均连续灌胃 vs § ∀灌胃体积为
每 tss ª体重 t °∀
1 q4 跳台实验
装置为 v 个茶色有机玻璃反射箱 o底面铺以铜
丝 o电压 ux ∂ ∀每间右后角放置一橡胶平台 ∀先将
大鼠放入箱内适应 v °¬±o然后通电 ∀观察并记录 x
°¬±内大鼠跳下橡胶平台的次数 o称为/错误数k µ¨2
µ²µ¶l0 ∀第 u天同一时间段将大鼠放于橡胶平台上 o
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第 u{卷第 w期
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观察并记录大鼠第 t 次跳下平台的时间k潜伏期l及
x °¬±内跳下橡胶平台的次数 o作为/错误数0 ∀
1 q5 空间记忆实验
按文献≈w ∗ y 建立 ²µµ¬¶水迷宫 ∀装置为直
径 tss ¦°圆形水池 o内设 y ≅ ts ¦°的透明站台 o放
于任一象限的中央 o没于水下 t ∗ u ¦° ∀水面洒布
白色泡沫颗粒 ∀实验时 o水池周围参照物保持不变 o
水温 kus ? ul ε ∀观察 }≠寻台潜伏期k≥°l }连续
z § o每天 w 次 o分别将动物头向池壁随机从 w 个入
水点放入水中 o记录其在 t °¬±内寻找水下平台的
时间 ∀t °¬±内找不到平台 o记为 t °¬± o并将动物
放到平台上熟悉 tx ¶ o休息 vs ¶ o进行下一次训练 ∀
跨台百分率k跨越原水下平台位置次数占跨越各
象限平台相应位置总次数的百分比 ≤°° l }训练结
束后撤除平台 o将动物从任一个入水点头向池壁放
入水中 o记录 u °¬±内跨越原水下平台位置次数和
其他各象限平台相应位置次数 o计算跨台百分率 ∀
1 q6 取材及免疫组化染色
行为实验结束后 o每组取大鼠 x 只 o戊巴比妥钠
kws °ª#®ªp tl麻醉 o开胸后插管至升主动脉 o先以
s q| h ¤≤¯冲净血液 o再用含 w h 多聚甲醛和
s qu h 苦味酸的 s qt °²¯ #p t磷酸盐缓冲液k°
o
³ z qw l灌注固定 ∀冰台取脑入上述新鲜固定液中
后固定 u ∗ w «kw ε l o再移入含 vs h 庶糖的 °
液
中至沉底 ∀恒冷箱切片机连续切片 o片厚 vs Λ° ∀
选取海马部位切片按试剂盒说明行免疫组织化学染
色 ∀主要步骤 }冰冻切片以 °
液浸泡 v «o洗涤 v
次 os qx h uu甲醇灭活内源性酶 ~依次滴加 ´抗
k¦2©²¶tΒuss oƒ tΒ{ss l !生物素化山羊抗兔 ª
及生物素 ) ) ) 辣根过氧化物酶 o⁄
显色 ∀空白对
照 o除 ´抗为正常山羊血清外 o其余步骤相同 ∀免疫
组化结果用 ¼¯°³∏¶显微镜观察 o ≥° × µ 照相 o
²·¤ ²µ³«计算机图象分析系统分析 o分别测出各
组吸光度 ∀
1 q7 统计分析
所有实验数据用平均值 ? 标准差表示 ∀多组间
比较用 ∂ 分析 o再用≥⁄进行两两比较 o
Π s qsx 时差别有统计学意义 ∀
2 结果
2 q1 对 ≥大鼠跳台实验的影响
从表 t 可以看出 o ≥ 大鼠与正常组比较 o跳
台训练期 !测试期错误反应次数均显著增加
k Π s qst l o触电潜伏期显著缩短k Π s qst l ~给予
熟地黄或六味地黄汤的 ≥ 大鼠 o跳台错误反应
次数显著减少k Π s .sx , Π s qst l o触电潜伏期
明显延长k Π s .sx , Π s qst l ∀
表 t 熟地黄对 ≥ 大鼠跳台实验的影响k ξ ? σl
组别
动物数
r只
测试触电潜伏期
r¶
每 x °¬±错误反应次数
训练期 测验期
正常对照 ts uxt q|t ? tst qxvl s q{s ? s q{vl s qv ? s qzvl
≥ 模型 tv yw qvt ? {s qttl u q{x ? t qztl u qvt ? t qstl
≥ n六味 tu uv{ quu ? ts{ quvl t qx{ ? t quul s qwu ? s qxvl
≥ n熟大 tu tzz qs{ ? ts{ qwul t qs{ ? t qwvl s q|u ? s qzvl
≥ n熟小 tv t{v q{v ? tvt qxvl s qzz ? t qsvl s qyu ? s q|vl
注 }与正常组比较 tl Π s qst 与模型组比较 ul Π s qsx vl Π s qst
2 q2 对 ≥大鼠空间记忆的影响
从图t可以看出 o ≥大鼠的寻台潜伏期
k ≥°l明显延长k Π s qst l o给予熟地黄后 o从训
练的第 x天开始 o≥°明显缩短 k Π s . s x ,
Π s qst l o给予六味地黄煎剂 o从训练第 y 天开
始 o≥°明显缩短k Π s .sx , Π s qst l o但均不能
恢复到正常组水平 ∀
图 t 熟地黄对 ≥大鼠 ≥°的影响
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从图 u 可以看出 o ≥ 大鼠的跨台百分率
k≤°°l 明显降低 o与正常组比较 Π s qst ~给予熟
地黄或六味地黄汤后 o ≥ 大鼠的 ≤°° 可显著升
高k Π s qst l o但仍不能恢复到正常组水平 ∀
图 u 熟地黄对 ≥ 大鼠 ≤°° 的影响
2 q3 对海马 ¦2©²¶和 ƒ 表达的影响
经对实验大鼠海马 ¦2©²¶和 ƒ 免疫组化染色
的半定量分析 o发现 ≥ 大鼠 ¦2©²¶和 ƒ 表达
较正常大鼠有轻度升高k Π s qsxl o给予熟地黄的
≥大鼠 ¦2©²¶和 ƒ 较 ≥模型组均有显著升
高k Π s qst o图 v owl ∀
图 v 熟地黄对 ≥ 大鼠海马 ¦p©²¶表达的影响k ν xl
图 w 熟地黄对 ≥ 大鼠海马 ƒ 的影响k ν xl
3 讨论
≥是一种神经毒素 o能选择性地破坏新生期
大鼠下丘脑弓状核 o引起神经内分泌功能紊乱 o°
轴功能亢进≈z ∀现已认识到 o该模型与肾阴虚密切
相关≈{ ∗ tu ∀应激研究观察到 o° 轴功能亢进 o血
浆糖皮质类固醇激素k≤≥ l升高 ∀长期高水平血浆
≤≥ o可通过海马糖皮质激素受体介导 o对海马神经
细胞产生损伤 o最终导致学习记忆功能减退≈tv ∀根
据应激 ° 轴亢进的继发性损害 o我们推测 o ≥
毁损弓状核后的 ° 轴亢进 o最终也将导致学习记
忆功能减退 ∀因此 o我们提出将 ≥模型作为肾阴
虚学习记忆障碍模型的设想≈v ∀本次实验发现 o
≥大鼠在跳台和 ²µµ¬¶水迷宫实验中 o有显著的
学习记忆功能减退表现 ~六味地黄 !熟地黄煎剂 !均
能显著改善 ≥ 大鼠学习记忆功能 ∀根据以方
k药l证型的观点 o我们认为 o将 ≥ 模型作为肾阴
虚学习记忆障碍模型使用的设想可行 ∀
神经生长因子是神经生长和功能活动必需的多
肽类因子 o存在于中枢神经系统 o海马内含量最
高≈tw ∀研究表明 o中枢 ƒ 与学习记忆密切相关 o
当海马中 ƒ 缺乏时 o将引起动物学习和记忆的缺
陷≈tx ∀提高中枢 ƒ 水平 o可改善认知功能的障
碍≈ty ∗ t| ∀本实验观察到 o正常大鼠海马 ƒ 表达
较低 o ≥大鼠 ƒ 表达有一定升高 o可能与神经
损伤后 ƒ 重新表达有关≈us ~给予熟地黄的 ≥
大鼠 oƒ 表达显著升高 o学习记忆功能明显改善 o
表明熟地黄可能通过促进内源性 ƒ 产生 o对抗谷
氨酸对神经细胞的损伤 o改善学习记忆功能 ∀
多种学习训练模型均可诱导脑内 ¦2©²¶基因表
达 ~通过转基因技术获得的 ¦2©²¶基因缺乏小鼠 o空
间学习记忆能力明显降低 o提示 ¦2©²¶在中枢神经系
统内的表达与学习记忆有着密切的关系≈ut ∀据研
究 o连续腹腔注射人参皂苷 x § o能明显增强大鼠的
学习记忆能力 o同时也促进 ¦2©²¶基因的表达 o提示
人参皂苷的增智作用与诱导 ¦2©²¶基因表达有
关≈uu ∀本实验观察到 }正常大鼠 ¦2©²¶表达较少 o
≥ 模型大鼠 ¦2©²¶表达稍高 ~而给予熟地黄的
≥模型大鼠 ¦2©²¶基因表达显著升高 ~结合给予
熟地黄的 ≥模型大鼠学习记忆功能明显改善 o我
们认为熟地黄对抗谷氨酸对神经细胞的损伤 !改善
学习记忆功能 o与促进 ¦2©²¶基因的表达有关 ∀
≈致谢 郑州大学医学院解剖教研室张华 !方智慧 !张
静老师对组织切片和免疫组化染色工作 o北京东直门医院王
硕仁教授 !崔巍老师对摄像分析工作给予帮助 ∀
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Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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≈tw «¤±ª≥ ≠ o • ∏ƒ o≤¤¬÷ q≥·∏§¬¨¶²© ²²·µ²³¬¦⁄µ∏ª¶ q¤±
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≈tz 邹 飞 o罗炳德 o蔡绍曦 o等 q ƒ 改善老年大鼠 ²µµ¬¶水
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t{w q
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·¤¶®o¤±§¶«²µ·¨±·«¨ ¬±¦∏¥¤·¬²± ³¨µ¬²§²© ¶¨ ®¨¬±ª·«¨ ³¯¤·©²µ° o¤±§¬°³µ²√¨·«¨ ³¨µ¦¨±·¤ª¨ µ¤·¨ ·«µ²∏ª«·«¨ ³¯¤·©²µ° ³²¶¬·¬²± ¬±
²µµ¬¶º¤·¨µ°¤½¨ ·¤¶®q≥«∏ ⁄¬2«∏¤±ª¤¯¶²¬±¦µ¨¤¶¨ ·«¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²©«¬³³²¦¤°³¤¯ ƒ o¦2©²¶qΧονχλυσιον : ≥«∏ ⁄¬2«∏¤±ª¦¤±¬°2
³µ²√¨·«¨ ©∏±¦·¬²± ²©¯¨ ¤µ±¬±ª¤±§ °¨°²µ¼ ²© ≥ µ¤·¶o¤±§¬·¶° ¦¨«¤±¬¶° °¤¼ ¥¨ µ¨ ¤¯·¨§ º¬·«·«¨ ¬±¦µ¨¤¶¨ ²©·«¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²©«¬³2
³²¦¤°³¤¯ ¦2©²¶¤±§ ƒ q
[ Κεψ ωορδσ] ≥«∏⁄¬2«∏¤±ª~¯¨ ¤µ±¬±ª¤±§ °¨°²µ¼ ~ ≥ µ¤·¶°²§¨¯~¦2©²¶~ ƒ
≈责任编辑 方文贤
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