全 文 ：清开灵注射液对缺氧／缺糖再给氧损伤时
神经细胞线粒体膜电位的保护作用
庞 鹤，朱陵群，牛福玲，崔 巍
（北京中医药大学 东直门医院 周围血管科 中医内科学教育部
重点实验室和北京市重点实验室，北京 １００７００）
［摘要］ 目的：以缺氧／缺糖再给氧为模型，观察清开灵注射液对神经细胞线粒体膜电位的保护作用。方法：
四唑盐比色实验（ＭＴＴ）检测细胞线粒体活性，激光共聚焦扫描显微镜检测细胞内游离钙离子含量（［Ｃａ２＋］ｉ），流式
细胞术检测细胞凋亡百分率和线粒体膜电位。结果：缺氧缺糖５ｈ再给氧３ｈ时，细胞内［Ｃａ２＋］ｉ和细胞凋亡率明
显增加，并随再给氧时间的延长而明显增高，线粒体膜电位和活性明显降低，并随再给氧时间的延长而进一步下
降，清开灵注射液能显著降低细胞内［Ｃａ２＋］ｉ浓度，抑制细胞凋亡的发生，提高线粒体膜电位和活性，与缺氧缺糖再
给氧组相比均有显著性差异（Ｐ＜００５，＜００１）。结论：清开灵注射液可抑制缺氧缺糖再给氧损伤所致的线粒体膜
电位的降低，从而具有稳定线粒体膜电位的作用，抑制细胞凋亡的发生，而对海马神经细胞起到保护作用，这种作
用可能与其能抑制神经细胞内钙超载有关。
［关键词］ 清开灵注射液；神经细胞；线粒体；膜电位；缺氧缺糖再给氧
［中图分类号］Ｒ２８５５ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００１５３０２（２００５）２３１８５２０４
［收稿日期］ ２００５０５０８
［基金项目］ 教育部科学技术研究重点项目 （０３０３０）
［通讯作者］ 庞鹤，Ｔｅｌ：（０１０）８４０１３２０２，Ｆａｘ：（０１０）６４０１０８１７
在细胞凋亡时，线粒体发生一系列与凋亡密切
相关的变化，包括形态和功能的转变，其中以线粒体
膜电位（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎｍｅｍｂｒａｎｅｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ＭＭＰ）的下
降是细胞凋亡在早期就出现的重要变化，多种刺激
如氧化应激、缺血性损伤、钙超载等均可引起 ＭＭＰ
的下降，呼吸链断裂，诱导细胞凋亡和死亡［１２］。
ＭＭＰ的改变与细胞凋亡信号系统的调控有密切的
关系，甚至是决定性的因素，ＭＭＰ的变化启动细胞
凋亡过程［２］。清开灵注射液是用于治疗脑缺血性疾
病的常用中药制剂，具有抗脑水肿、抗自由基、改善
脑微血管的功能、稳定神经细胞内游离钙离子含量
（［Ｃａ２＋］ｉ）水平，对神经细胞缺血性损伤有保护作
用［３］。但对其作用机制缺乏深入研究，本研究在细
胞模型上摸拟脑缺血性损伤，观察细胞内［Ｃａ２＋］ｉ、
细胞凋亡率、ＭＭＰ和线粒体活性的变化，探讨清开
灵注射液对神经细胞ＭＭＰ的影响及其可能的机制。
１ 材料和方法
１１ 材料
ＤＭＥＭ培养基为美国 Ｇｉｂｃｏ公司产品，胎牛血
清为ＨｙＣｌｏｎｅ公司产品；碘化丙啶（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ，
ＰＩ）购自 Ｓｉｇｍａ公司；Ｆｌｕｏ３／ＡＭ和 ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７均
购自美国 ＢＩＯＲＥＤ公司；尼莫地平（Ｎｉｍｏｄｉｐｉｎｅ）和
Ａ２３１８７购自美国 ＩＣＮ公司；清开灵注射液由北京中
医药大学药厂生产，批号２１３７１０Ａ。
１２ 方法
１２１ 缺氧缺糖再给氧模型及分组 孕 １８ｄ的
Ｗｉｓｔａｒ大鼠，由中国医学科学院繁育场提供，海马神
经细胞的培养按照作者已报道方法［４］进行。取培养
第１０天的神经细胞用于实验，随机分为模型组：用
无糖Ｅａｒｌｅ’ｓ液置换含血清的ＤＭＥＭ培养液，然后置
于缺氧罐内充以９５％Ｎ２和５％ ＣＯ２，罐内氧气含量
低于１％，３７℃培养 ５ｈ，然后从缺氧罐中取出，将
Ｅａｒｌｅ’ｓ液换为无血清的 ＤＭＥＭ培养液，置培养箱中
继续培养，制备缺氧缺糖再给氧模型；对照组：不经
缺氧缺糖再给氧处理；尼莫地平组：１０μｍｏｌ·Ｌ
－１于
实验开始时加入培养液中；药物组：终剂量分别为
１５，３０ｍＬ·Ｌ－１的清开灵注射液于实验前１２ｈ加入培
养液中，其余同模型组。
１２２ 线粒体活性的测定 ９６孔板中的细胞经缺
氧缺糖再给氧后每孔加入２０μＬＭＴＴ（终剂量为５ｇ
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·Ｌ－１），３７℃温育 ４ｈ，吸弃 ＭＴＴ，每孔加入 １００μＬ
ＤＭＳＯ，震荡１０ｍｉｎ，使结晶充分溶解。用酶标仪（瑞
士 ＭｕｌｔｉｓｋａｎＡｓｃｅｎｔＶｌ２４３５４００６２７Ｔ型）在 ５７０ｎｍ
波长处测定 Ａ值，其 Ａ值代表细胞线粒体活性。
１２３ 凋亡细胞计数 收集细胞悬液，１０００×ｇ
离心５ｍｉｎ，弃上清，沉淀用７０％乙醇悬浮，４℃冰箱
内固定 １２ｈ以上。取固定后的细胞用 ０１ｍｍｏｌ·
Ｌ－１磷酸盐缓冲液（ｐＨ７４）洗２遍并悬浮之，加入终
剂量为２０ｍｇ·Ｌ－１ＲＮａｓｅＡ，３７℃恒浴１ｈ，再加入ＰＩ
染液至终剂量５０ｍｇ·Ｌ－１，摇匀后４℃避光静置１ｈ，
过滤，在 ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ型流式细胞仪上计数 １万个
细胞，测定凋亡细胞所占比例。
１２４ 细胞胞内钙离子浓度的测定 按作者已报
道的方法进行测定［４］，测定结果按下列公式可得到
整个细胞内的［Ｃａ２＋］ｉ浓度：［Ｃａ２＋］ｉ＝ｋｄ（ＦＦｍｉｎ）／
（ＦＦｍａｘ），Ｆ：检测到的荧光强度，Ｆｍａｘ：加入 Ｃａ２＋载
体Ａ２３１８７后细胞内饱和时的荧光强度，Ｆｍｉｎ：加入
ＭｎＣｌ２使荧光淬灭后的荧光强度，Ｆｌｕｏ３的 ｋｄ值为
４５０ｎｍｏｌ·Ｌ－１。
１２５ ＭＭＰ测定 收集细胞，１０００ｒ·ｍｉｎ－１，离心５
ｍｉｎ，弃上清，用新鲜培养液悬浮细胞，加入 Ｒｈｏ
ｄａｍｉｎｅ１２３（终剂量为０５μｍｏｌ·Ｌ
－１）３７℃２０ｍｉｎ，ＰＢＳ
洗细胞３次，留细胞悬液 １ｍＬ，２００目尼龙网过滤，
在流式细胞仪上用 ＬＯＧ软件分析，绘制 ＭＭＰ变化
的平均荧光值分布图。其中横坐标为 ＭＭＰ的平均
荧光值的对数值，纵坐标为细胞体积。Ｒｈｏ
ｄａｍｉｎｅ１２３是一种阳离子荧光染料，由于线粒体内膜
的负电性而滞留在活细胞线粒体内，以其荧光强度
变化表示ＭＭＰ变化（激发光波长４８０ｎｍ，发射光波
长５３０ｎｍ）。
１２６ 统计方法 数据用珋ｘ±ｓ表示，组间显著性
比较用医学统计软件 ＳＰＳＳ８０中方差分析程序进
行。
２ 结果
２１ 清开灵注射液对线粒体活性的影响
与对照组相比，神经细胞缺氧缺糖５ｈ再给氧
３ｈ时，细胞线粒体活性降低４３８４％（Ｐ＜００１），并
随着再给氧时间的延长细胞线粒体活性进一步下
降，２４ｈ时降低６３０２％（Ｐ＜００１），提示缺氧缺糖
再给氧损伤可明显造成神经细胞线粒体的损伤；清
开灵注射液能够明显提高神经细胞线粒体活性，并
随着剂量的增加而作用增强（表１）。
表１ 清开灵注射液对线粒体活性的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
组别
剂量
／ｍＬ·Ｌ－１
线粒体活性（Ａ）
３ｈ １２ｈ ２４ｈ
对照组 ０５８４±０２３５１） ０５６２±００３１１） ０５４９±００３９１）
模型组 ０３２８±０１１７ ０２７６±００３３ ０２０３±００５１
清开灵组 １５ ０４６４±００８８２） ０４１５±００４７１） ０３９２±００６３１）
清开灵组 ３０ ０５１３±００６３１） ０５０７±００４２１） ０４９９±００７５１）
尼莫地平 １０３） ０５３９±００２６１） ０５２７±００５２１） ０５１３±００３８１）
注：与模型组比较１）Ｐ＜００１，２）Ｐ＜００５，３）剂量单位为μｍｏｌ·Ｌ
－１（表２～４同）
２２ 清开灵注射液对细胞内［Ｃａ２＋］ｉ浓度变化的影响
神经细胞缺氧缺糖 ５ｈ再给氧，［Ｃａ２＋］ｉ含量
的产生明显增高，并随再给氧时间的延长而有所增
加，尼莫地平明显降低 ［Ｃａ２＋］ｉ的浓度，清开灵注
射液能显著抑制 ［Ｃａ２＋］ｉ水平的升高，剂量增加，作
用增强，与模型组相比有显著性差异（表２）。
表２ 清开灵注射液对神经细胞内游离钙的影响 （珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
组别
剂量
／ｍＬ·Ｌ－１
神经细胞内［Ｃａ２＋］ｉ的浓度／ｎｍｏｌ·Ｌ－１
３ｈ １２ｈ ２４ｈ
对照组 ５１７４±９２４１） ４８１２±９８３１） ５３１９±１０１２１）
模型组 １６９３２±１１７７ ２０３６１±２１７９ ２９８１１±２５８７
清开灵组 １５ １１９６６±２０６１１） １４１８０±１８１７１） １６３３４±２１８５１）
清开灵组 ３０ ９４７７±２０６９１） １２１１７±１６２９１） １３９１６±２４３１１）
尼莫地平组 １０３） ８８２９±１５５４１） ７５０３±１０１７１） ６９９１±１８１２１）
２３ 清开灵注射液对神经细胞凋亡的影响
神经细胞缺氧缺糖５ｈ后再给氧，细胞凋亡的
百分率明显增高，并随给氧时间延长，凋亡的细胞也
越多，尼莫地平能够拮抗这种作用，清开灵注射液
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能抑制神经细胞凋亡的发生，与模型组相比有显著
性差异，并随剂量的增加而抑制作用更加明显，与尼
莫地平组相比无显著性差异（Ｐ＞００５，表３）。
２４ 清开灵注射液对神经细胞ＭＭＰ的影响
表３ 清开灵注射液对神经细胞凋亡的影响 （珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
组别
剂量
／ｍＬ·Ｌ－１
神经细胞凋亡的百分率
３ｈ １２ｈ ２４ｈ
对照组 ４２７±１３９１） ５８９±１２５１） ５１７±１８６１）
模型组 １９０６±５０１ ４５７３±１１５７ ４９８５±１０１９
清开灵组 １５ １４７２±３３６２） ２７７９±５９７２） ２３０１±５１４１）
清开灵组 ３０ １１６１±２５５２） １７９９±３７１１） ２１２２±８９０１）
尼莫地平组 １０３） ８０５±２６４１） １３９０±４８８１） １６２４±４１９１）
神经细胞经缺氧缺糖５ｈ再给氧处理后，ＭＭＰ
降低，模型组 ３ｈ时降低 ６５６９％ （Ｐ＜００１），随着
再给氧时间的延长 ＭＭＰ进一步下降，２４ｈ时降低
７３７０％（Ｐ＜００１）；清开灵注射液组的 ＭＭＰ随着
再给氧时间的延长而降低，但较模型组相应时间点
的ＭＭＰ仍高，提示清开灵注射液具有稳定细胞
ＭＭＰ水平的作用，并随剂量的增加而作用更加明
显（表４）。
表４ 清开灵注射液对神经细胞ＭＭＰ的影响（珋ｘ±ｓ，ｎ＝６）
组别
剂量
／ｍＬ·Ｌ－１
线粒体膜电位／平均荧光强度
３ｈ １２ｈ ２４ｈ
对照组 １２２１７±１３３６１） １１３８１±１０７８１） １２５３７±１１５７１）
模型组 ４１９１±９６４ ２９１２±５１１ ２０４１±６５４
清开灵组 １５ ７９６８±６０７２） ６６９５±８１１２） ６４８３±５０１１）
清开灵组 ３０ ８８１７±６１６１） ７３１４±７６８１） ６９５９±６０３１）
尼莫地平组 １０３） ９５２６±９３２１） ８７４１±８８３１） ８１２２±８０２１）
３ 讨论
线粒体既是细胞内能量转换器，又是细胞内钙
的储存库，参与细胞内钙离子的调节和信号的传递。
ＭＭＰ是指线粒体内、外膜之间的电位差 ，是由位于
线粒体内膜的质子泵活动所产生并维持，近年来研
究发现多种细胞在不同因子作用下发生凋亡时均伴
有ＭＭＰ的下降。ＭＭＰ下降与膜通透性增加有关，
并由线粒体通透性转换孔（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ
ｐｏｒｅ，ＰＴＰ）调控［５］。Ｉｃｈａｓ［６］等提出了钙依赖性的 ＰＴＰ
调节模型，认为ＰＴＰ有低导性和高导性 ２种不同的
开放方式，前者是一种可逆的正常代谢调节过程，后
者为不可逆的细胞死亡信号。２种开放方式均受线
粒体［Ｃａ２＋］ｉ浓度的升高直接或间接调控。线粒体
氧化磷酸化过程中起偶联作用的膜电位在细胞凋亡
早期病理变化出现以前就开始下降，线粒体内钙离
子超载启动高导性的 ＰＴＰ开放，ＭＭＰ下降，线粒体
膨胀，外膜破裂，诱导细胞凋亡，如果能稳定ＭＭＰ就
能防止细胞凋亡或可阻止凋亡的进展。
作者以培养大鼠海马神经细胞缺氧缺糖再给
氧为模型，模拟缺血再灌注状态，诱导神经细胞凋亡
的发生。结果发现，随着缺氧缺糖５ｈ后再给氧时
间的延长，细胞内［Ｃａ２＋］ｉ随之明显增高，细胞凋亡
的发生也越来越多。清开灵注射液能明显改善这种
情况，使细胞内［Ｃａ２＋］ｉ水平、细胞凋亡的百分率均
明显降低，对缺血再灌注损伤的神经细胞有保护作
用。尼莫地平是Ｌ型钙通道阻断剂，能阻止钙离子
的跨膜内流，抑制细胞内钙离子的释放，使细胞内
［Ｃａ２＋］ｉ保持在一定的水平，清开灵注射液降低缺
血再灌注后海马神经细胞内［Ｃａ２＋］ｉ水平的效应与
尼莫地平相仿并能显著降低细胞凋亡率，提示清开
灵注射液能够调节细胞内［Ｃａ２＋］ｉ含量变化，在一
定范围内维持细胞内［Ｃａ２＋］ｉ稳态，从而抑制缺氧
缺糖再给氧损伤后海马神经细胞凋亡的发生。
本实验通过对细胞进行 Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３染色，应
用流式细胞仪检测其荧光强度，以反映细胞ＭＭＰ高
低。结果表明缺氧缺糖５ｈ后再给氧３，１２，２４ｈ后
神经细胞线粒体活性和ＭＭＰ均有所下降，随再给氧
时间的延长而变化越显著，提示线粒体氧化磷酸化
功能障碍随再给氧时间的延长而加重，而细胞钙离
子的超载是导致线粒体氧化磷酸化功能障碍的原因
之一；研究［７，８］证实在细胞凋亡早期阶段，在细胞核
病理改变之前，ＭＭＰ已经下降。本实验结果与文献
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报道一致。清开灵注射液能够明显提高细胞线粒体
活性，稳定细胞 ＭＭＰ水平，其作用随着剂量的增加
而增强。提示清开灵注射液能显著改善缺氧缺糖
再给氧损伤所致的线粒体氧化磷酸化功能障碍，调
节细胞能量代谢的作用，从而抑制海马神经细胞凋
亡的发生，这种作用可能与其能抑制神经细胞内钙
超载有关，但清开灵注射液的作用机制是影响细胞
外钙的内流，还是调整细胞内钙库的释放，尚需进一
步研究。
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ｄｕｒｉｎｇｉｎｊｕｒｙｉｎｄｕｃｅｄｂｙｈｙｐｏｘｉａｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉａａｎｄｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ
ｉｎｃｕｌｔｕｒｅｄｒａｔｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｎｅｕｒｏｎｓ
ＰＡＮＧＨｅ１，ＺＨＵＬｉｎｇｑｕｎ２，ＮＩＵＦｕｌｉｎｇ２，ＣＵＩＷｅｉ
（ＰｅｒｉｐｈｅｒａｌＶａｓｃｕｌａｒＣｅｎｔｅｒ，ＴｈｅｋｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉｃｉｎｅｏｆＭｉｎｉｓｔｒｙ
ｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎａｎｄＢｅｉｊｉｎｇ，ＤｏｎｇＺｈｉＭｅｎｇＨｏｓｐｉｔａｌ，ＢｅｉｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，１００７００，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｐｒｏｔｅｃｔｅｆｅｃｔｓｏｆＱｉｎｇｋａｉｌｉｎｇｉｎｊｅｃｔｉｏｎｏｎｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎｍｅｍｂｒａｎｅｐｏｔｅｎｔｉａｌ（ＭＭＰ）ｄｕｒｉｎｇ
ｉｎｊｕｒｙｉｎｄｕｃｅｄｂｙｈｙｐｏｘｉａｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉａａｎｄｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎｉｎｃｕｌｔｕｒｅｄｒａｔｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｎｅｕｒｏｎｓＭｅｔｈｏｄ：Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄ
ｂｙｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＭＴＴ）ｔｅｓｔＭＭＰａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｉｎｔｒａｃｅｌｕｌａｒｆｒｅｅｃａｌｃｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
（［Ｃａ２＋］ｉ）ｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｗｉｔｈｃｏｎｆｏｃａｌｌａｓｅｒｓｃａｎｎｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙＲｅｓｕｌｔ：Ｈｙｐｏｘｉａｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉａｃｕｌｔｕｒｅｓｆｏｒ５ｈｏｕｒａｎｄｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎｆｏｒ３
ｈｏｕｒｉｎｄｕｃｅｄｉｎｔｒａｃｅｌｕｌａｒ［Ｃａ２＋］ｉａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｒａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄＴｈｅｅｆｅｃｔｓｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｗｉｔｈｔｈｅｅｘｔｅｎｄｉｎｇｔｉｍｅｏｆｒｅｏｘｙｇｅｎａ
ｔｉｏｎＭＭＰａｎｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｄｅｃｌｉｎｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙａｆｔｅｒ３ｈｏｕｒｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎＴｈｅｅｆｅｃｔｓｗｅｒｅｄｅｃｌｉｎｅｄｗｉｔｈｔｈｅｅｘｔｅｎｄｉｎｇｔｉｍｅｏｆｒｅ
ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎＱｉｎｇｋａｉｌｉｎｇｉｎｊｅｃｔｉｏｎｍｉｇｈｔｈａｖｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｉｎｔｒａｃｅｌｕｌａｒ［Ｃａ２＋］ｉａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｒａｔｅ，ｉｎｃｒｅａｓｅＭＭＰａｎｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ
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ｇｅｎａｔｉｏｎ，ａｎｄｈａｄｅｆｅｃｔｓｏｆｓｔａｂｌｅｉｔａｎｄａｎｔｉｎｅｕｒｏｎａｌａｐｏｐｔｏｓｉｓＴｈｅｅｆｅｃｔｓｍｉｇｈｔｂｅｒｅｌａｔｅｄｔｏｉｎｈｉｂｉｔｏｖｅｒｌｏａｄｏｆｉｎｔｒａｃｅｌｕｌａｒｆｒｅｅｃａｌｃｉｕｍ
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