全 文 ：º µ¨¨ §¨·¨¦·¨§ º«¨ ± §¬©©¨ µ¨±·¥¤¶¨2° §¨¬¤o³¯¤±·³«¼·²«²µ°²±¨ ¶o¦¤µ¥²«¼§µ¤·¨¶¤±§³‹ º µ¨¨ ¤³³¯¬¨§qΡεσυλτ ανδ Χονχλυσιον : × «¨ §¬2
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[ Κεψ ωορδσ] ∆ενδροβιυ µ χανδιδυ µ ~³µ²·²¦²µ° ~ªµ²º·«~§¬©©¨ µ¨±·¬¤·¬²± ≈责任编辑 王康正 
x种习用柴胡的 Œ×≥序列鉴别
武 莹t ou 3 o刘春生t o刘玉法t o阎玉凝t
kt1 北京中医药大学 中药学院 o北京 tsstsu ~
u1 北京卫生学校 中药学科 o北京 tsssxvl
≈摘要  目的 } 用 °≤ • 扩增方法测定 x种常用柴胡的 Œ×≥序列 o为柴胡的分子鉴定提供依据 ∀方法 }分别从
x种柴胡的叶片中提取总 ⁄‘„ o以核基因组通用引物进行扩增 o扩增产物经纯化后 o用 °≤ • 产物直接测序 ∀结果 }
各样品的 Œ×≥t长度为 utw ∗ uus ¥³oŒ×≥u长度为 uvs ∗ uvt ¥³∀x种柴胡的 Œ×≥序列分别有多个特异性信息位点 ∀
结论 }Œ×≥序列可以作为柴胡分子鉴定的依据 ∀
≈关键词  柴胡 ~Œ×≥序列
≈中图分类号  • u{u1x ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussxlts2szvu2sv
≈收稿日期  ussw2sy2st
≈通 讯 作 者   3 武 莹 o ר¯ }k sts l yvxv{{uu2txs o ∞2°¤¬¯}
¥º º¼|{xt ƒ tyv1¦²°
Œ×≥序列在被子植物中的长度变异很小 oŒ×≥t
和 Œ×≥u的长度均不足 vss ¥³o°≤ • 扩增及测序简
单易行 o特别是 °≤ • 直接测序法的诞生 o极大地推
动了 Œ×≥在被子植物科内 o尤其是近缘属间及种间
关系研究中的应用≈t  ∀
柴胡是一种多来源药材 o自古以来应用品种就
很多≈u2w  ∀虽然5中国药典6usss年版一部只规定伞
形科植物柴胡 !狭叶柴胡 u种为柴胡的正品≈x  o但市
场所出售的柴胡品种有十几种 o其中以北柴胡 !狭叶
柴胡 !竹叶柴胡 !黑柴胡 !小叶黑柴胡为主 ∀然而仅
用性状鉴别 !显微鉴别及理化鉴别方法较难清楚地
区分市场上的柴胡品种 ∀本实验旨在通过从上述 x
种柴胡植物叶片中提取 ⁄‘„ 并测定其 Œ×≥序列 o
为柴胡的分子鉴定提供依据 ∀
1 材料和方法
111 材料 柴胡 !狭叶柴胡 !黑柴胡为硅胶快速干
燥的叶片 o竹叶柴胡为自然干燥的标本叶片 o小叶黑
柴胡为自然干燥的原植物叶片 ∀均经北京中医药大
学中药学院阎玉凝教授鉴定k见表 tl ∀
表 t 各种样品采集地点及时间
名称 采集地点 采集日期
柴胡 Βυπλευρυ µ χηινενσε 河北雾灵山 usst2s{
狭叶柴胡 Β1 σχορζονεριφολιυ µ 山东泰山 ussu2sy
竹叶柴胡 Β1 µ αργινατυ µ 云南昆明 usst2s{
黑柴胡 Β1 σµιτηιι 宁夏固原 ussu2ts
小叶黑柴胡 Β1 σµιτηιι √¤µ1 παρϖιφολιυ µ 宁夏海原 ussu2s|
112 ⁄‘„ 提取 用 ≤ × „… 法≈y 提取获得总
⁄‘„ ∀称取 s1v ª各样品叶片 o置于培养皿中 o加水
少许 o浸泡至充分展开 o剪去病斑 o用棉球擦拭叶片 o
去除杂质 o再用 zs h乙醇擦拭叶片表面 o然后用超
纯水清洗 v次 o置于超净台上干燥 ~在液氮中研磨成
细粉 o转移至含有 v °u ≅ ≤ × „… 的提取缓冲液
ku h ≤ × „…os1t °²¯ #p t ×µ¬¶2‹≤¯o³‹ {1s o∞⁄× „
s1su °²¯#pt o‘¤≤¯t1w °²¯#pt ot h °∂ ° o用前加
入 Β2巯基乙醇 u h l的离心管中 o轻轻转动离心管 o
使植物组织在提取缓冲液中均匀分散 oyx ε 温浴 |s
°¬±o并不时轻轻转动离心管 ~混合物冷却至室温
后 o加入等体积的氯仿2异戊醇kuwΒtl o轻轻颠倒离
心管 o使管内混合物成乳浊状 ow ε tu sss µ#°¬±p t
分相 ∀转移上清液至另一洁净离心管中 o重复该步
骤 u次 ~在最终 t次抽提液中加入 s1z体积 p us ε
异丙醇 ow ε 放置 vs °¬±以上 ow ε tu sss µ#°¬±p t
#uvz#
第 vs卷第 ts期
ussx年 x月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯1vs oŒ¶¶∏¨ ts
¤¼ oussx
离心 tx °¬±o倾去上清液 o加入 x °zs h乙醇 os1u
°²¯#p t醋酸铵 o冰上放置 vs °¬±ow ε tu sss µ#
°¬±p t离心 ts °¬±o弃上清液 o随即加入 zs h乙醇 !
无水乙醇各洗涤 t次 ∀w ε tu sss µ#°¬±p t离心 ts
°¬±o放于通风橱中空气干燥至无醇味 o溶于适量的
超纯水中 ~取 x ˏ用 t h琼脂糖凝胶电泳以标准量
的 Κ⁄‘„为对照 o检查 ⁄‘„质量和数量 ∀
113 引物设计 选择被子植物 °≤ • 扩增测序通用
引物≈z  o序列如下 }
¤€ xj2ŠŠ„„Š× „„„„Š× ≤ Š× „„≤ „„ŠŠ2vj
§€ xj2Š≤ × Š≤ Š× × ≤ × × ≤ „2× ≤ Š„× Š≤2vj
114 ⁄‘„ 扩增 Œ×≥ 的扩增采取整段扩增的方
法 oxs ˏ反应体系中含 ts ≅ …∏©©¨µx ˏoª≤ u¯ v
ˏo…≥„ x ˏo⁄‘×° t ˏoפ´ 酶 s1x ˏo引物¤和
§各 s1x ˏo模板 x ˏo超纯水 u|1x ˏ∀扩增程序
为 }|w ε 预变性 y °¬±ozu ε 整理 w °¬±o然后进入
如下循环 }|w ε 变性 t °¬±oxx ε 退火 u °¬±ozu ε
延伸 |s ¶ows个循环后 ozu ε 延伸 ts °¬±∀
115 测序 °≤ • 产物经纯化后 o由上海生工生物
工程有限公司测序部测序 ∀各样品均采用正向和反
向测序 o以保证测序的准确性 ~部分由于信号太弱而
无法直接测序的样品 o采用克隆测序的方法 o克隆载
体为 × 载体 °  Š ∀
116 序列分析 以柴胡属近缘植物伞形科阿米芹
族葛缕子亚族孜然芹属植物孜然芹 Χυ µινυ µ
χψµινυ µ 1 为外类群k资料来自 Š ±¨…¤±®o系列号
为 ˜z{wuu o˜z{vyul o与 x种柴胡 Œ×≥序列进行分
析 ∀ ⁄‘„序列的排序用 ≤ ∏¯¶·¤¯ ÷ 软件完成 ~排序
后的序列使用  ∞Š„u 分子进化遗传分析软件 o
Ž¬°∏µ¤2u参数遗传距离 o采用邻接法构建 ‘系统
树 ~系统树各分支的置信度用自举检验法检验 o共进
行 u sss次循环 ∀
2 结果
x种柴胡属植物及 t种孜然芹属植物的 Œ×≥序
列见图 t ∀
3 讨论
311 柴胡种间变异的比较 根据柴胡属 Βυπλευ2
ρυ µ 已报道的序列资料kŠ ±¨¥¤±® ˜{{tv{ o˜{{tv| o
˜{{tws o˜{{twtl确定核糖体 ⁄‘„ 内转录间隔区
Œ×≥t和 Œ×≥u与 v个编码区 t{≥ ox1{≥和 uy≥的界
限 ∀由于所测各样品的 x1{ ≥µ⁄‘„序列较为保守 o故
本研究不做进一步分析 ∀由图 t !表 u可知 o各样品的
图 t x种柴胡属植物及 t种孜然芹属植物的 Œ×≥序列
表 u x种柴胡属植物及 t种孜然芹属植物的 Œ×≥
区序列长度及 Š≤ 含量
植物名称 长度r¥³Œ×≥t Œ×≥u
Š≤ 含量r h
Œ×≥t Œ×≥u
Βυπλευρυ µ χηινενσε uty uvt yt1ws x|1zw
Β1 σχορζονεριφολιυ µ uus uvt ys1t{ ys1tz
Β1 µ αργινατυ µ utw uvt yu1yu xz1x{
Β1 σµιτηιι uty uvt yu1sw x|1vt
Β1 σµιτηιι √¤µ1 παρϖιφολιυ uus uvs ys1ss xz1{v
Χυ µινυ µ χψµινυ µ uut utz xs1|u w|1zz
序列长度比较接近 oŒ×≥t长度为 utw ∗ uus ¥³oŒ×≥u
长度为 uu| ∗ uvx ¥³∀各种柴胡 Œ×≥t序列kt ∗ uty
¥³l差异较大 o信息位点 t{个 ∀而Œ×≥u序列信息位
点为 uv个 ∀
312 Œ×≥序列分析可用于柴胡的鉴别 ⁄‘„ 序列
分析技术通过比较 ⁄‘„ 分子中 w种碱基序列排列
的变化 o反映生物体在遗传上的变异 o直观性强 o重
现性好 ∀µ⁄‘„ Œ×≥序列是近年来探讨植物种内变
异和种间 !近缘属间分子系统关系的重要分子标记
之一 ∀本研究将该序列用于中药柴胡的品种鉴定
中 o通过对药典记载品种柴胡 !狭叶柴胡 o各地常用
#vvz#
第 vs卷第 ts期
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中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯1vs oŒ¶¶∏¨ ts
¤¼ oussx
品种竹叶柴胡 !黑柴胡 !小叶黑柴胡及柴胡近缘属孜
然芹属植物孜然芹的序列对位排列分析表明 o
Œ×≥t oŒ×≥u序列信息位点较为丰富 o不同种的柴胡
均有特异性的变异位点 ∀因此 o通过比较这 u段序
列可以准确鉴别柴胡的品种 ∀从表 v可以看出 o柴
胡属内差异百分率较低 o与近缘属植物间差异百分
率较高 ∀因此 o通过检测检品的 ⁄‘„ 序列 o然后与
数据库中各种序列比较 o就能确定该药材的基源种
类 o鉴别各种中药材 ∀
表 v x种柴胡属植物及 t种孜然芹属植物的
Œ×≥区遗传距离和一致度
t u v w x y
Βυπλευρυ µ χηινενσε s1ssz s1ssz s1sts s1ss{ s1sw{
Β1 σχορζονεριφολιυ µ s1sut s1ss{ s1stt s1ss{ s1sw|
Β1 µ αργινατυ µ s1sut s1su{ s1ssz s1ssz s1sw{
Β1 σµιτηιι s1swx s1sxv s1suv s1sts s1sxs
Β1σµιτηιι √¤µ1 παρϖιφολιυ s1su{ s1svy s1suy s1sxs s1sw{
Χυ µινυ µ χψµινυ µ s1xwz s1xwt s1xwz s1xyy s1xxu
313 柴胡属植物经典分类学的探讨 由于 Œ×≥t
和 Œ×≥u两个片段的长度有限 o各自提供的信息量
有限 o因此 o将这两个片断综合起来分析 o构建了柴
胡属植物分子系统树 ) ) ) ‘系统树k见图 ul ∀
图 u x种柴胡属植物及 t种孜然芹属植物的 ‘系统进化树
从图 u可以看出 o柴胡属与孜然芹属的分化十
分明显 o各自为一单系树 ∀柴胡属植物中 o黑柴胡与
小叶黑柴胡首先聚类在一起 o然后与竹叶柴胡 !狭叶
柴胡 !北柴胡聚在一起 ∀这与经典植物学分类是相
一致的 ∀柴胡属内种间遗传距离较近 o因此 o赞成这
x种柴胡同等入药 ∀此外 o经典植物分类学认为小
叶黑柴胡是黑柴胡的一种变种≈{  o但从本实验所测
定结果来看 o小叶黑柴胡与黑柴胡之间的碱基序列
有差异 o因此 o建议应将小叶黑柴胡单独列为一种 ∀
≈致谢 北京中医药大学白根本教授 !陈玉婷副教授 o宁
夏回族自治区药检所王英华主任 o山东中医药大学周凤琴教
授协助实验 ∀
≈参考文献 
≈t  汪小全 o洪德元 q植物分子系统学近五年的研究进展概况 q植物
分类学报 ot||z ovxkxl }wzv1
≈u  李时珍 q本草纲目 q北京 }中国档案出版社 ot|||1yws1
≈v  唐慎微 q重修政和经史证类备用本草 q北京 }华夏出版社 o
t||v1tyu1
≈w  吴仪洛 q本草从新 q北京 }中医古籍出版社 ousst1tu1
≈x  中国药典 1 一部 qusss1uvu1
≈y  ≥¦²··’ • o„ °²¯§q∞¬·µ¤¦·¬²± ²© ⁄‘„ ©µ²° °¬¯¯¬ªµ¤° ¤°²∏±·¶
²©©µ¨¶«o«¨ µ¥¤µ¬∏° ¤±§ °∏°°¬©¬¨§³¯¤±··¬¶¶∏¨¶1 Πλαντ Μολεχυλαρ
Βιολογψot|{x ox }y|1
≈z  王建波 o张文驹 o陈家宽 q核µ⁄‘„ 的 Œ×≥序列在被子植物系统
与进化研究中的应用 q植物分类学报 ot||| ovzkwl }ws|1
≈{  中国科学院中国植物志编辑委员会 q中国植物志 1 第 xx卷 1
北京 }科学出版社 ot|z|1ut{1
ΙΤΣ σεθυενχειδεντιφιχατιον οφ Ραδιξ Βυπλευρι
• ˜ ≠¬±ªt ou oŒ˜ ≤«∏±2¶«¨ ±ªt oŒ˜ ≠∏2©¤t o ≠ „‘ ≠∏2±¬±ªt
(t1 Σχηοολ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα , Βειϕινγ Υνιϖερσιτψ οφ Τραδιτιοναλ Χηινεσε Μεδιχινε , Βειϕινγ tsstsu , Χηινα ;
u1 ∆επαρτµεντ οφ Χηινεσε Μετερια Μεδιχα , Βειϕινγ Ηεαλτη Σχηοολ, Βειϕινγ tsssxv , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ײ ³µ²√¬§¨ ·«¨ ¥¤¶¬¶²© °²¯ ¦¨∏¯¤µ¤∏·«¨ ±·¬¦¤·¬²± ²© • ¤§¬¬ …∏³¯ ∏¨µ¬¥¼ ·«¨ ¦²°³¤µ¬¶²± ²©·«¨ ¬±·¨µ±¤¯
·µ¤±¶¦µ¬¥¨ §¶³¤¦¨µkŒ×≥l ¶¨ ∏´¨ ±¦¨¶²©©¬√¨®¬±§¶²© • ¤§¬¬ …∏³¯ ∏¨µ¬¬±¦²°°²± ∏¶¨1 Μετηοδ }ƒ¬µ¶·¯¼ o·²·¤¯ ⁄‘„ ²©©¬√¨®¬±§¶²© • ¤§¬¬
…∏³¯ ∏¨µ¬º¤¶ ¬¨·µ¤¦·¨§1 ≥ ¦¨²±§¯¼ o·«¨ Œ×≥ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ º¤¶¤°³¯¬©¬¨§¥¼ °≤ • º¬·«∏±¬√ µ¨¶¤¯ ³µ¬° µ¨²©Œ×≥ ¤±§°≤ • ³µ²§∏¦·º¤¶§¬µ¨¦·2
¼¯ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨§¤©·¨µ³∏µ¬©¬¦¤·¬²±1 Ρεσυλτ } × «¨ ¯¨ ±ª·« ²© Œ×≥t ¤±§Œ×≥u ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ º¤¶utw ∗ uus ¥³ ¤±§uvs ∗ uvt ¥³ µ¨¶³¨ ¦·¬√¨¯¼1
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·«¨ √¨¬§¨ ±¦¨ ©²µ·«¨ °²¯ ¦¨∏¯¤µ¤∏·«¨ ±·¬¦¤·¬²± ²© • ¤§¬¬ …∏³¯ ∏¨µ¬1
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≈责任编辑 王康正 
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中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
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