全 文 ：#研究论文#
石斛总 ⁄‘„的提取及鉴定
彭 锐t o宋洪元u o李泉森t o王 宇t
k t重庆市中药研究院 o重庆 wsssyx ~u西南农业大学园艺系 o重庆 wssztyl
≈摘要 目的 }探讨不同 ⁄‘„提取方法对石斛属 ⁄‘„质量及分子标记结果的影响 ∀方法 }对提取的 ⁄‘„ 进行
紫外光谱分析 !总 ⁄‘„电泳及 • „°⁄分析 ∀结果 }不同方法提取的 ⁄‘„质量及产率存在显著差异 o对 • „°⁄结果
影响很大 ∀结论 }石斛属植物在 ⁄‘„提取前加入无 ≤ × „…缓冲液抽提多糖等杂质 o可获得较高质量的 ⁄‘„ ∀
≈关键词  石斛属 ~总 ⁄‘„ ~• „°⁄~电泳 ~紫外光谱
≈中图分类号  • u{u qu ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukussvltu2ttu{2sv
获取高质量的 ⁄‘„ 样品是进行分子生物学研
究的必要前提 ∀目前总 ⁄‘„ 提取及纯化在研究较
多的植物如小麦 !水稻 !玉米等已有成熟的方法 o但
是不同植物体内次生代谢物及其比例存在差异 o它
们可与 ⁄‘„ 结合形成复合物 o⁄‘„ 埋在这种粘稠
的胶状物中难以溶解 ∀因此 o根据所研究植物的不
同情况需要进行实验 o以获得高质量的 ⁄‘„样品 ∀
兰科石斛属植物体内含有较多的多糖 o多种生物碱
及未知的次生代谢产物 o在药用上它们是重要的药
用成分 o在分子生物生物学研究中如何除去这些成
分已有许多报道≈t2v  o但作者在研究中发现 o同一方
法提取不同种石斛植物 o稳定性较差 o鉴于此 o作者
经反复实验 o鉴定了 v种不同方法提取的 ⁄‘„ ∀
1 材料和方法
1 q1 仪器和试剂 紫外分光光度计k岛津 ˜ ∂2
uwst°≤l o¬±¬¦¼¦¯ µ¨×  扩增仪k基因公司生产l o
פ´ 酶 o ª≤ u¯ ots ≅ °≤ • ¥∏©©¨µk 中国医药上海化学
试剂公司 o¶¤±ª²±l o琼脂糖k¤ª¤µ²¶¨ t o¶¤±ª²±进口
分装l oª¨ ±²°¬¦⁄‘„ 纯化试剂盒k¶¤±ª²±o≥Žuxtl o
§‘×°¶k°µ²° ª¨¤公司l o≤ × „…k≥¤±ª²±l o引物k≥¤±2
ª²±的 ≥序列引物 ≥yvl o其他试剂均为分析纯 ∀
1 q2 材料 实验材料采自中国西部重庆 !四川 !贵
州 !云南等地区 o种植于重庆市中药研究院标本园 o
取其嫩叶用于 ⁄‘„提取 ∀材料情况见表 t ∀
≈收稿日期  ussu2tt2s{
≈基金项目  重庆市科委应用基础课题kusss2yzutul
≈通讯作者  彭锐 ר¯ }ksuvlyuwyuywu ∞2°¤¬¯}º¤±ª¼«¯t|zt
ƒ ¼¤«²²q¦²°
表 t 供试材料和来源
编号 材料名称 采集地点
t ∆ενδροβιυ µ νοβιλε k金钗石斛l 四川合江
u ∆ . λοηοηενσε k罗河石斛l 重庆南川
v ∆ . δενσιφλορυ µ k密花石斛l 贵州赤水
w ∆ . µ ονιλιφορµεk细茎石斛l 云南景洪
x ∆ . χανδιδυ µ k铁皮石斛l 贵州荔波
1 q3 ⁄‘„提取方法 方法 tk≤ × „…l法 }取新鲜嫩
叶 s qv ª置入 t qx °塑料离心管中 o放置于 p {s ε
下冷冻过夜 o取出后用玻璃棒迅速将材料研磨成匀
浆 o加入 ys ε 预热的 ≤ × „…分离缓冲液 xss ˏ于
ys ε 水浴中保温 ws °¬±o保温期间将离心管来回倒
数次 o然后加等体积氯仿2异戊醇kuwΒtl o轻轻倒转
混均 o使试管中内容物成乳浊状 ∀室温下 x sss µ#
°¬±p t离心 { °¬±o取上层水相于另一干净 t qx °
离心管 o加入 trts体积 v °²¯ #p t ‘¤„¦后再加入
urv体积 p us ε 预冷异丙醇于 p us ε 下静置 vs
°¬±∀取出后于 ts sss µ#°¬±p t离心 ts °¬±o使 ⁄‘„
沉淀下来 o去上清液 ozs h乙醇洗涤 v次 o室温下干
燥 ∀溶于 tss ˏ双蒸水中 ∀
方法 u }Š ±¨²°¬¦⁄‘„纯化试剂盒提取 o取新鲜
嫩叶 s qv ª置于 t qx °塑料离心管中 op {s ε 下取
出研磨成匀浆 o其余步骤按说明书进行 ∀
方法 v }改进 ≤ × „…法k参照曾杰等方法≈v 并做
适当修改l ∀称取新鲜嫩叶 s qx ªo装入 x °离心管
中 o最后沉淀缓冲液改为≈ ≤ × „…t h o×µ¬¶2‹≤¯k³‹
{ qsl xs °°²¯ #pt o∞⁄× „ts °°²¯ #p t巯基乙醇
t h   o室温放置 ws °¬±ots sss µ#°¬±p t离心 ts °¬±o
小心去上清液 o用 zx h乙醇洗涤 v次 o弃洗液 o挥干 ∀
溶于 tss ˏ双蒸水中 ∀
#|utt#
第 u{卷第 tu期
ussv年 tu月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ qu{ oŒ¶¶∏¨ tu
⁄¨ ¦¨ °¥¨µoussv
2 ⁄‘„鉴定
2 q1 总 ⁄‘„纯度检测 用紫外分光光度计在波长
uvs ouys ou{s ±° 处测定吸光度k Α 值l o根据 uys
±°的 Α值计算总 ⁄‘„ 的大致纯度和含量 o根据
uys ±°和 uvs ±°处 Α值之比判断有无残存的盐
和小分子杂质 o根据 uys ±°和 u{s ±°处 Α值之比
判断有无多糖 !蛋白质 !• ‘„ 等杂质 o根据 uys ±°
处的 Α值初步估算总 ⁄‘„ 浓度 ∀在 t qt h的琼脂
糖凝胶中 o于 w ∂ #¦°p t电压下电泳 o检测总 ⁄‘„样
品质量 ∀
2 q2 °≤ • 反应 反应总体积 ux ˏo其中引物 u
ˏo约 ys ±ªoפ´ 酶 t qx ˜ o§‘×°¶s qu °°²¯#p t o
 ª≤ u¯ t qx °°²¯ #pt ots ≅ ¥∏©©¨µu qx ˏ∀扩增程
序为预变性 x °¬±o|w ε t °¬±ovy ε t °¬±ozu ε u
°¬±共 vs个循环 o最后延伸 zu ε ts °¬±∀取 ts ˏ
扩增产物于 t qt h琼脂糖凝胶中 ow ∂ #¦°p t电压下
电泳 o电泳缓冲液为 s qx ≅ ׅ∞o紫外拍照 ∀
3 结果
3 q1 ⁄‘„ 纯度 !浓度 对提取的石斛总 ⁄‘„ o测
定其 uss ∗ vss ±°内紫外吸收光谱吸收度k Α值l o
本实验检测不同提取方法的 ⁄‘„ 得知 oΑuysr Αuvs
比值k表 ul o说明方法 t中 o蛋白质 !多糖等杂质除去
不完全 o方法 u比方法 t好 o但仍有少量蛋白质 !多
糖等杂质 o而方法 v得到的 ⁄‘„ 比较纯 o蛋白质及
多糖 !酚类去除较完全 ∀ Αuysr Αuvs比值k表 ul o表明
方法 t及方法 u的溶液中有残留的小分子及盐类杂
质 o其存在会影响反应的结果 ∀根据 uys ±°的吸收
值估测 ⁄‘„的浓度 ov种方法存在差异 o其原因估
计是 ⁄‘„提取程序不同对 ⁄‘„的损失有差异 ∀考
虑到极微量的 ⁄‘„ 即可做 • „°⁄分子标记 o所以 o
为了保证 ⁄‘„的质量 o宁可保证较低的 ⁄‘„产率 ∀
电泳检测结果与分光光度计检测结果基本一致 o
⁄‘„样品在电泳凝胶上呈现的条带清晰 o迁移率较
低 o溴酚蓝前无光亮区 o且点样孔内无荧光出现k图
tl ∀本实验所用提取方法在其他植物中还有许多报
道 o但用于石斛 ⁄‘„ 提取 o结果不一致 o因此 o⁄‘„
提取方法应根据不同植物具体探索 o以获得高质量
的 ⁄‘„ ∀
表 u 石斛总 ⁄‘„浓度及产率
编号 材料名称 Αuvs Αuys Αu{s Αuysr Αuvs Αuysr Αu{s
⁄‘„浓度
°ª#p t
⁄‘„产率
r°ª#ªp t
t ∆ενδροβιυ µ . νοβιλε s qsvz s qszz s qsyt u qs{ t quy v q{x tu q{v
u ∆ . λοηοηενσσε s qsvu s qszt s qsyw u quu t qtt v qxx tt q{v
v ∆ . δδενσιφλορυ µ s qsuz s qsx| s qswt u qt| t qww u q|x | q{v
w ∆ . µ ονιλιφορµε s qsvw s qszy s qsxv u quw t qwv v q{s tu qyz
x ∆ . χανδιδυ µ s qswt s qs{| s qs{t u qtz t qts w qsx tv qxs
y ∆ . νοβιλε s qstu s qsu{ s qsuv u qtx t quu t qws w qyz
z ∆ . λοηοηενσσε s qstx s qsvt s qsut u qsz t qw{ t qxx x qtz
{ ∆ . δδενσιφλορυ µ s qsvt s qsyy s qsx| u qtv t qt| v qvs tt qss
| ∆ . µ ονιλιφορµε s qssz s qsty s qstt u qu| t qwx s qxx t q{v
ts ∆ . χανδιδυ µ s qstz s qsvw s qsux u qss t qvy t qzs x qyz
tt ∆ . νοβιλε s qssw s qss| s qssx u qux t q{s s qwx t qxs
tu ∆ . λοηοηενσσε s qssv s qssz s qssw u qvv t qzx s qvx t qtz
tv ∆ . δδενσιφλορυ µ s qssx s qstt s qssy u qus t q{v s qxx t q{v
tw ∆ . µ ονιλιφορµε s qssy s qstv s qssz u qtz t q{y s qyx u qtz
tx ∆ . χανδιδυ µ s qssw s qss| s qssx u qux t q{s s qwx t qxs
注 }t ∗ x为方法 t提取 oy ∗ ts为方法 u提取 ott ∗ tx为方法 v提取
图 t 石斛总 ⁄‘„凝胶电泳图谱
3 q2 • „°⁄反应 用不同提取方法的总 ⁄‘„作为
模板 o用 ts个碱基的寡核苷酸序段作为引物k≥yvl
进行随机扩增多态性 ⁄‘„k• „°⁄l o可获得清晰的
带谱k图 ul o说明 • „°⁄可作为有用的分子标记来
检测石斛总 ⁄‘„的多态性 !种源鉴定和系统学研 图 u 不同提取条件的 °≤ • 图谱
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第 u{卷第 tu期
ussv年 tu月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ qu{ oŒ¶¶∏¨ tu
⁄¨ ¦¨ °¥¨µoussv
究 ~本电泳图谱同时也表明 ⁄‘„ 纯度对 °≤ • 结果
有较大影响k图片的点样顺序为 t ou ov ow ox o l ∀
4 讨论
从石斛属植物中提取总 ⁄‘„ 是对石斛进行分
子生物学研究的必要前提 ∀要进行 ≥²∏·«¨µ±杂交 o
• „°⁄o• ƒ° o„ƒ°分析等研究 o都需要高质量的
总 ⁄‘„ ∀us世纪 {s年代以来 o普遍采用 ≤ × „…k十
六烷三甲基溴化铵l法提取植物总 ⁄‘„ ∀ ≤ × „…是
一种去污剂 o既能裂解细胞 o又能有效沉淀多糖 o因
此有其独特的优点 ∀ ⁄‘„ 提取试剂盒由于其使用
方便 o也广泛用于总 ⁄‘„ 提取 ∀但是 o对于次生代
谢物含量较多的石斛属植物 o这两种方法都是失败
的 ∀能成功地从石斛组织中提取总 ⁄‘„ 的关键是
如何有效地除去多糖 !生物碱及一些未知次生物质 ∀
4 q1 多糖及其他杂质的去除 在一般的总 ⁄‘„
抽提中 o某些未知化合物与总 ⁄‘„ 凝集成不溶性
的复合物 o并且这些化合物在 uvs ±°和 uzs ±°处
很强的吸收峰≈w  o干扰总 ⁄‘„ 的紫外吸收测定 ∀
污染有这种不溶性复合物的总 ⁄‘„ 不能进行下游
的分子生物学操作 ∀石斛组织中富含多糖 o在沉淀
总 ⁄‘„时 o同时也产生了多糖的絮状沉淀 o这种含
有多糖的总 ⁄‘„ 沉淀难溶于水 o或溶解后产生粘
稠状的溶液 ∀由于多糖可以抑制多种酶的活性 o因
此污染了多糖的总 ⁄‘„ 样品无法用于进一步的分
子生物学研究 ∀在常规方法中 o通过 ≥⁄≥2盐酸胍处
理可以部分去除多糖 ~在高盐低 ³‹ 值条件下 o通过
笨酚 !氯仿抽提可以除去一些多糖 ∀但是 o在石斛总
⁄‘„的抽提中 o即使通过这些步骤 o仍会有多糖与
总 ⁄‘„混杂在一起 o为进一步除去多糖 o在抽提石
斛总 ⁄‘„ 过程之前 o加入无 ≤ × „…缓冲液抽提多
糖 o效果明显提高 ∀
4 q2 提取方法对 ⁄‘„ 质量的影响 本实验用 v
种提取程序提取石斛的基因组 ⁄‘„ o并进行了紫外
光谱测定 !电泳和 • „°⁄2°≤ • 反应 ∀v种实验结果
表明 o方法 t 含有较多的多糖 !小分子及盐类 o对
• „°⁄2°≤ • 结果影响严重 ~方法 u中虽然除去了大
部分的小分子及盐类 o但多糖和其他一些未知次生
物质去除不完全 o• „°⁄2°≤ • 结果不理想 ~方法 v
中杂质去除较完全 o• „°⁄2°≤ • 反应的谱带较清
晰 o所用引物显示了实验材料的多态性 o⁄‘„ 质量
符合做 • „°⁄2°≤ • 的要求 ∀
虽然 • „°⁄反应的 ⁄‘„ 不必过度纯化≈x  o但
是对 °≤ • 反应酶有抑制作用的物质如多糖等 o必须
去除完全 o否则会影响实验结果 o甚至使 • „°⁄结
果失败 ∀比较 v种 ⁄‘„ 鉴定方法 o本实验表明 o电
泳检测总 ⁄‘„ 不失为一种简便 !快捷 !准确 !经济
的方法 o只要在胶孔前沿有一条主带 o胶孔内不滞留
⁄‘„ o即可做 • „°⁄2°≤ • ∀
≈致谢  承西南农业大学园艺系蔬菜学实验室支持 ∀
≈参考文献 
≈t  ¼¨o⁄²¼¯ ¨qŒ¶²¯¤·¬²± ²© °¯ ¤±·⁄‘„ ©µ²° ƒµ¨¶« ׬¶¶∏¨ q
ƒ²¦∏¶ot||s ou }tv q
≈u  邹喻苹 o汪小全 o雷乙丁 o等 q几种濒危植物及其近缘类群总
⁄‘„的提取与鉴定 q植物学报 ot||w ovykzl }xu{ q
≈v  曾 杰 o邹喻苹 o白嘉雨 o等 q玩拗植物类群的总 ⁄‘„ 制备 q植
物学报 oussu owwkyl }y|w q
≈w  阎桂琴 o李 珊 o王 玲 o等 q太白红杉总 ⁄‘„的提取及鉴定 q
西北大学学报k自然科学版l qusst ovtktl }xv q
≈x  汪小全 o邹喻苹 o张大明 o等 q• „°⁄应用于遗传多样性和系统
学研究中的问题 q植物学报 ot||y ov{ktul }|xw q
Εξτραχτιον ανδ Χηαραχτεριζατιον οφ Τοταλ ∆ΝΑ φροµ ∆ενδροβιυµ
°∞‘Š • ∏¬t o≥’‘Š ‹²±ª2¼∏¤±u oŒ ±∏¤±2¶¨±t o • „‘Š ≠∏u
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·«µ¨¨§¬©©¨ µ¨±·° ·¨«²§¶q Ρεσυλτ : × «¨ ⁄‘„ ¦²±¦¨±·µ¤·¬²± ¤±§ ¼¬¨ §¯¶ º µ¨¨ §¬©©¨ µ¨±·oº«¬¦« ªµ¨¤·¯¼ ¬±©¯∏¨ ±¦¨§·«¨ µ¨¶∏¯·²© • „°⁄2
°≤ • q Χονχλυσιον : × «¨ «¬ª«¨µ ∏´¤¯¬·¼ ⁄‘„ ©µ²° ∆ενδροβιυ µ ¦¤± ¥¨ ²¥·¤¬±¨ § º¬·«·«¨ ° ·¨«²§²© ≤ × „…2©µ¨¨ ¬¨·µ¤¦·¬²± ° §¨¬∏° ¥¨ 2
©²µ¨ ·²·¤¯ ⁄‘„ º¤¶¬¶²¯¤·¨§q
[ Κεψ ωορδσ] ∆ενδροβιυ µ τοταλ~⁄‘„ ~ • „°⁄~¨¯ ¦¨·µ²³«²µ¨¶¬¶~ ˜ ∂ ¶³¨ ¦·µ²³«²·²° ·¨µ¼ ≈责任编辑 袁桂京 
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