全 文 :·学术探讨·
“一测多评”法中药质量评价模式方法学研究
王智民,高慧敏,付雪涛,王维皓
(中国中医科学院 中药研究所,北京 100700)
[摘要] 目的:建立适合于中药特点的利用1个对照品同步测定多成分的分析方法,并建立其方法学的考察
模式。方法:以木通为研究对象,以药材中典型成分皂苷PJ1(saponinPJ1)为指标,建立该成分与其他成分白木通皂
苷B和白木通皂苷C(mutongsaponinB和C)间的相对校正因子,测定saponinPJ1的含量,用校正因子计算mutong
saponinB和C的含量;同时采用外标法实测药材中3种成分的绝对含量;采用夹角余弦法对一测多评法的计算值
与外标法实测值进行比较,评价一测多评法的准确性和科学性。结果:建立了一测多评法方法学的考察模式;方法
准确性评价结果表明一测多评法的计算值与外标法实测值之间没有显著性差异,实验所得的校正因子可信。结
论:一测多评的研究思路在木通药材中得到验证,有望成为适合中药特点的多指标质量评价新模式。
[关键词] 一测多评;HPLC;木通;校正因子
[中图分类号]R284.1 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2006)23192505
[收稿日期] 20060908
[通讯作者] 王智民,Tel:(010)84014128,Email:zhmw123@
263.net
中药质量控制和评价是中药现代化的瓶颈,中药多成分
的复杂性决定了单一成分或指标评价难以表达中药的质量,
并由此提出多成分质量控制的模式;多指标的质量评价模
式,必需有足够量的化学对照品,由于中药化学对照品分离
难度大或单体不稳定难以供应或供应价格高等因素,致使对
照品的供应和使用力不从心。鉴于目前单成分质量控制尚
缺乏对照品供应,更不用说多指标成分的质量控制模式,该
模式也仅限于科研,难以应用到实际质量监督和评价中。故
有人提出增加指纹图谱进行质量控制的模式,但指纹图谱的
模糊性特点决定了其在实际生产、监督中应用的难度和“难
以说清楚”的局面。
那么能否通过中药有效成分间存在的内在函数关系和
比例关系,仅测定1个成分 (对照品可以得到者),来实现
多个成分 (对照品没有或难以供应)的同步监控,这是
“一测多评”的基本设计思想。作者以木通药材为例,采用
一测多评模式对其中3种皂苷类成分进行同步测定,对一
测多评方法的技术适用性和应用可行性进行了探索和评价。
1 仪器与试药
Waters2695-2996高效液相系统,Empower工作站(Wa
ters公司);Agilent1100高效液相系统,白木通皂苷 B(mu
tongsaponinB),皂苷 PJ1(saponinPJ1)和白木通皂苷 C(mu
tongsaponinC)对照品由本实验室分离纯化并鉴定结构(图
1),HPLC(面积归一化法)纯度 >98%。白木通药材采自四
川,经本所生药室何希荣主管技师鉴定为白木通Akebiatrifo
liata(Thunb.)Koidz.var.australis(Diels)Rehd的干燥藤
茎,其他样品由本所生药室郝近大研究员鉴定提供。甲醇为
色谱纯,水为高纯水,其余试剂均为分析纯。
图1 对照品白木通皂苷B,皂苷PJ1和白木通皂苷C
2 方法与结果
2.1 方法原理
在一定的范围内(线性范围内)成分的量(质量或浓度)
与检测器响应成正比,即:W=fA[13]。在多指标质量评价时,
以药材中某一典型组分(有对照品供应者)为内标,建立该组
分与其他组分之间的相对校正因子,通过校正因子计算其他
组分的含量。这种测定一个成分,实现对多个成分定量的方
法命名为一测多评法。
假设某样品中含有i个组分
Wi
Ai
=fi(i=1,2,…,k,…,m) ①
式中Ai为组分峰面积;Wi为组分浓度。
选取其中一组分k为内标,建立组分k与其他组分m之
·5291·
第31卷第23期
2006年12月
中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
Vol31,Issue 23
December,2006
间的相对校正因子[46]。
fkm=
fk
fm
=
Wk×Am
Wm×Ak
②
由此可导出定量计算公式:
Wm=
Wk×Am
fkm×Ak
③
式中Ak为内标物峰面积,Wk为内标物浓度。Am为其他
组分m峰面积;Wm为其他组分m浓度。
2.2 一测多评方法学[7]考察
2.2.1 色谱条件 色谱柱 AltimaC18 (46mm×250mm,
5μm),流动相甲醇 (A)乙腈 (B)01%磷酸水 (C),
梯度洗脱程序见表 1,流速 10mL·min-1,柱温 30℃,
检测波长210nm。上述色谱条件下,各组分分离度良好
(图2)。
表1 流动相梯度洗脱程序
t/min A/% B/% C/%
0 35 5 60
40 15 25 60
图2 对照品及药材的HPLC图
A.对照品;B.样品;
1.mutongsaponinB;2.saponinPJ1;3.mutongsaponinC
2.2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取 mutongsaponin
B,saponinPJ1和 mutongsaponinC对照品 152,403,20mg
置于10mL的量瓶中,甲醇溶解并稀释至刻度得 0152,
0403和020mg·mL-1的混合对照品溶液。精密称取 sap
oninPJ1对照品406mg置于10mL的量瓶中,甲醇溶解并稀
释至刻度得0406mg·mL-1的单一对照品溶液。
2.2.3 供试品溶液的制备 取药材粉末(过60目筛)约10
g,精密称定,置具塞三角瓶中,精密加入70%的甲醇50mL,
精密称定,超声提取30min,补足重量,摇匀,滤过。精密量
取续滤液30mL,减压蒸干溶剂,残渣以10mL水分次洗涤,
洗涤液并入分液漏斗中,以水饱和醋酸乙酯萃取3次,每次
10mL,弃去醋酸乙酯液,水层用水饱和正丁醇萃取5次,每
次10mL,合并萃取液,置蒸发皿中蒸干,残渣以70%甲醇溶
解、洗涤并定容于50mL量瓶中,过045μm微孔滤膜,即
得。
2.2.4 线性范围 精密吸取上述混合对照品溶液1,5,10,
15,20μL进样分析,以进样量对峰面积积分值进行回归处
理,得mutongsaponinB,saponinPJ1,mutongsaponinC回归方程
分别为:Y=548105C-3778(r=0.9997),Y=285281C-
2822(r=0.9999),Y=252842C-513(r=0.9998)。三者
分别在015~304,040~806,020~40μg线性良好。
2.2.5 校正因子计算 以SaponinPJ1为内标,按2.1项下公
式②,分别计算saponinPJ1对mutongsaponinB和mutongsapo
ninC的校正因子,见表2。
表2 校正因子
进样体积/μL fsaponinPJ1/mutongsaponinB fsaponinPJ1/mutongsaponinC
1 1912 0811
5 1918 0863
10 1921 0871
15 1923 0890
20 1760 0900
Mean 1887 0867
RSD/% 376 399
2.2.6 精密度试验 精密吸取同一混合对照品溶液20μL,
连续进样6次,记录峰面积,mutongsaponinB,saponinPJ1和
mutongsaponinC峰面积的 RSD分别为 17%,18%和
20%。
2.2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液分别于1,2,3d进
样分析,记录峰面积,mutongsaponinB,saponinPJ1和 mutong
saponinC的RSD分别为17%,17%和065%,表明处理后
的样品溶液室温放置3d稳定。
2.2.8 重复性试验 称取白木通(四川峨嵋山麻柳村)药材
粉末(60目)约10g共6份,精密称定,按供试品溶液处理
方法制备样品,测定,mutongsaponinB,saponinPJ1和 mutong
saponinC的平均含量为 015%,065%和 018%,RSD为
17%,15%和13%。
2.2.9 加样回收率 精密称取适量已知含量的白木通药材
粉末 (60目)6份,分别加入一定量的对照品,按供试品
溶液处理方法制备样品,测定,计算加样回收率,mutong
saponinB,saponinPJ1和 mutongsaponinC的平均回收率为
997%,974%,994%,RSD为24%,26%和29%。
2210 样品测定 分别精密吸取供试品、混合标准品及
单一标准品 (saponinPJ1)溶液各5,10,10μL注入高效
液相色谱仪,测定。分别采用一测多评法和外标一点法计
算木通药材中 mutongsaponinB,saponinPJ1和 mutongsaponin
C的含量 (表3)。
2.3 一测多评方法耐用性和系统适应性评价
2.3.1 色谱柱及高效液相色谱仪考察 取2.2.2项下混合
对照品溶液,进样1,5,10,15,20μL,测定,按2.2.5项下计
算saponinPJ1对 mutongsaponinB和 mutongsaponinC的校正
因子。
试验考察了 Waters2695-2996,Agilent1100两种高效
液相色谱系统和 AgilentC18(46mm×250mm,5μm),Phe
nomenexLunaC18(46mm×250mm,5μm),AltimaC18(46
mm×250mm,5μm)3种色谱柱,结果见表4。
2.3.2 实验室考察 采用建立的一测多评试验方法在经两
·6291·
第31卷第23期
2006年12月
中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
Vol31,Issue 23
December,2006
表3 不同来源木通药材中3种皂苷类成分的含量(一测多评法和外标法)
药材 产地
mutongsaponinB/%
测定 计算
saponinPJ1测定
/%
mutongsaponinC/%
测定 计算
白木通 四川峨眉 0066 0069 0325 0174 0174
四川双福镇 0107 0113 0379 0142 0141
四川悦连乡 0056 0059 0298 0091 0091
四川筠连 0136 0143 0630 0177 0176
四川黄湾乡 0061 0065 0357 0070 0069
四川大庙乡 0050 0052 0239 0075 0075
三叶木通 安徽绩溪县 0042 0044 0271 0118 0117
安徽城关镇 0138 0145 0808 0160 0159
安徽霍山县 0047 0050 0351 0157 0156
安徽泾县 0012 0013 0546 0057 0056
江西修水县 0060 0063 0315 0196 0195
江西武宁县 0044 0046 0294 0171 0170
江西瑞昌市 0043 0046 0460 0185 0184
表4 不同仪器和色谱柱测得校正因子(n=5)
仪器 色谱柱
校正因子
fsaponinPJ1/mutongsaponinBfsaponinPJ1/mutongsaponinC
Waters Agilent 1880 0873
Luna 1858 0871
Altima 1887 0867
Agilent Altima 1902 0884
Mean 1882 0874
RSD 10% 08%
个实验室进行复核试验,结果见表5。
表5 不同实验室测得校正因子
进样体积/μL
fsaponinPJ1/mutongsaponinB fsaponinPJ1/mutongsaponinC
Lab.1 Lab.2 Lab.1 Lab.2
1 1912 1867 0811 0849
5 1918 1917 0863 0872
10 1921 1932 0871 0878
15 1923 1945 0890 0899
20 1760 1937 0900 0895
Mean 1887 1920 0867 0878
2.3.3 待测组分色谱峰的定位(专属性)
方法一:利用相对保留时间(RT)差定性:知道内标峰的
保留时间,加上相对保留时间差,再根据峰形判断,即能够正
确判断出目标峰的准确峰位置(表6)。
方法二:光谱相关色谱:同样的成分,在不同色谱柱及色
谱仪器中的保留时间有些差异,但他们的光谱(或质谱)相同
或相似。通过对所有不同流出时间点的光谱与纯物质之间
的光谱匹配程度。再结合目标峰所在原色谱峰簇的保留时
间信息,即能够正确判断出目标峰的准确峰位置。
2.4 一测多评方法与常规法比较研究
将常规的外标法实测含量与一测多评计算的含量采用
夹角余弦值进行比较,验证一测多评方法用于多指标成分质
量评价的准确性。
夹角余弦值计算公式[89]:
S=
n
i=1
xiyi
n
i=1
(xi)槡 2
n
i=1
(yi)槡 2
本实验采用一测多评法和外标法测得的 mutongsaponin
B和 mutongsaponinC的计算值和实测值之间的夹角余弦值
分别为099998和099999,表明两种方法测得含量没有显
著性差异。
表6 各组分保留时间及相对保留时间差
仪器 色谱柱 RTmutongsaponinB RTsaponinPJ1-RTmutongsaponinB RTsaponinPJ1 RTsaponinPJ1-RTmutongsaponin RTmutongsaponinC
Waters Agilent 23798 10055 33853 -3364 37217
Luna 22365 10457 32822 -3308 36130
Altima 24740 9914 34654 -3194 37848
Agilent Altima 26796 10011 36807 -3084 39891
Mean 24425 10109 34534 -3238 37771
2.5 方法再验证
随机选择另外的木通药材,分别按“实测法”和“一测多
评法”(按试验建立的校正因子)计算mutongsaponinB和mu
tongsaponinC的含量,验证一测多评法的科学性和适用性。
3 讨论
3.1 本试验以木通药材为例,通过方法学确证、方法的耐用
性、系统适应性考察和一测多评准确性的评价,对一测多评
法的技术适用性和应用可行性进行了探讨研究。结果表明,
一测多评法推算的含量与实测法所得含量没有显著性差异,
提示试验建立的校正因子比较可信,能够实现在mutongsapo
·7291·
第31卷第23期
2006年12月
中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
Vol31,Issue 23
December,2006
ninB和mutongsaponinC对照品缺乏的情况下,通过 saponin
PJ1与mutongsaponinB和mutongsaponinC之间相对保留时间
差的进行色谱峰定位,利用 saponinPJ1和校正因子计算两者
的含 量。实 验 所 得 的 相 对 保 留 时 间 差 RTsaponinPJ1 -
RTmutongsaponinB和RTsaponinPJ1-RTmutongsaponin的平均值为101096
和 - 32 372 min,校 正 因 子 fsaponinPJ1/mutongsaponinB 和
fsaponinPJ1/mutongsaponinC的平均值1882和0874可供他人参考和
使用。
3.2 本试验的两个重点是专属性和校正因子问题。从本实
验可以看出3个皂苷成分在不同柱子和仪器上出峰时间有
所变化,但相对保留时间差变化不大,所以利用相对保留时
间差能较好的解决专属性问题。本实验只考察了3个成分
在同比例时的校正因子,且3个成分都属于同一类化合物。
在后续实验中将对不同比例,不同类化合物之间的校正因子
进行研究。
3.3 本试验采用外标法实测组分的绝对含量与一测对评法
推算含量进行比较,评价一测多评方法的准确性和科学性。
目前评价两组数据的贴近程度的方法主要有相关系数法、夹
角余弦值法、模糊分布法和模糊欧式距离法[10,11],根据试验
结果,本研究借鉴了中药色谱指纹图谱进行相似度评价常用
的夹角余弦算法和统计学上t检验。
3.4 在中药多指标质量评价过程中,多采用指纹图谱技术
来体现中药的整体性,但它太过模糊的特点造成了在实际生
产、监督中的应用难度和“难以说清楚”的局面。一测多评的
研究思路侧重从量上阐明主要成分或药效成分间的相互关
系,校正因子的运用能够实现在对照品短缺的情况下,多指
标成分的含量测定,有望成为适合中药特点的多指标质量评
价新模式。
[参考文献]
[1] 喻华达.无纯样色谱校正因子的测定[J].化学世界,1992,7:
816.
[2] 陈忆庭.药物的紫外百分吸收系数用于 HPLC定量测定的方
法探讨[J].中国现代应用药学杂志,2002,19(4):315.
[3] 李 聪.紫外检测器定量校正因子的性质与实用性探讨[J].
色谱,1990,8(4):254.
[4] 黄 信,郑 阳,曾泽玉,等.HPLC校正因子法测定牛蒡子提
取物中总木脂素苷的含量[J].成都中医药大学学报,2005,28
(4):42.
[5] 李玉兰,刘 敏,王 玉.舒巴坦钠中舒巴坦青霉胺杂质含量
测定方法的建立[J].中国药师,2005,8(6):467.
[6] 吴益群,史咏梅.校正因子法测定替硝唑葡萄糖注射液中5羟
甲基糠醛的含量[J].江苏药学与临床研究,2004,12(6):6.
[7] 中国药典[S].一部.2005:附录114.
[8] 谢培山.中药色谱指纹图谱[M]4版.北京:人民卫生出版
社,2005:141.
[9] 王龙星,肖红斌,梁鑫淼,等.一种评价中药色谱指纹谱相似性
的新方法:向量夹角发[J].药学学报,2002,37(9):713.
[10] 刘永锁,孟庆华,蒋淑敏,等.相似系统理论用于中药色谱指纹
图谱的相似度评价[J].色谱,2005,23(2):158.
[11] 聂 磊,曹 进,罗国安,等.中药指纹图谱相似度评价方法的
比较[J].中成药,2005,27(3):249.
Multicomponentsquantitationbyonemarkernewmethodforquality
evaluationofChineseherbalmedicine
WANGZhimin,GAOHuimin,FUXuetao,WANGWeihao
(InstituteofChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicialSciences,Beijing100700,China)
[Abstract] Objective:ToestablishanewqualityevaluationmethodforChineseherbalmedicine,usingonechemicalreference
substancetocalculatemulticomponentssimultaneously.Method:Relativecorectionfactors(RCF)ofmutongsaponinBandCtosap
oninPJ1,acharacteristiccomponentasmarker,werecalcalatedinThechromatographicconditionsfordeterminationofthethreesapo
ninsinCaulisAkebiaeakebiaeasaresearchmodel.ThecontentsofsaponinPJ1weredeterminedbyexternalstandardmethod,and
thoseofmutongsaponinBandCwerecalculatedbysaponinPJ1andtheirRCF.Theaccuracyofthenewmethodwasevaluatedbycom
paringthecalculatedcontentswiththedeterminedcontents.Result:Theanalysisprocedureswerevalidated.Therehasbeennosignif
icantdiferencebetweenthecalculatedcontentsandthedeterminedcontents,accordingtotheanglecosinevalue,andthecalcalated
RCFhaveconfidencevalue.Conclusion:Themethodofmulticomponentsquantitationbyonemarkerhasbeenverifiedincaulisake
biaeanditistobeanewqualityevaluationpaternforChineseherbalmedicines.
[Keywords] multicomponentsquantitivebyonemarker;HPLC;CaulisAkebiae;relativecorectionfactor
[责任编辑 戴 畅]
·8291·
第31卷第23期
2006年12月
中 国 中 药 杂 志
ChinaJournalofChineseMateriaMedica
Vol31,Issue 23
December,2006