全 文 ：姜汁轻组分对 ƒ„引发软骨细胞产生
过氧化氢的抑制作用 3
郭平 3 3 许君辉 许善锦 王夔
k北京医科大学药学院 北京 tsss{vl
摘要 为探讨生姜成分对大骨节病的治疗作用 o采用生姜挥发油对黄腐酸刺激软骨细胞产生活性
氧进行清除抑制 o发现微量ks qty °¯ rl生姜挥发油即能够抑制 ƒ„刺激软骨细胞产生的过氧化氢 ∀
关键词 生姜挥发油 黄腐酸 软骨细胞 过氧化氢
作用曾报道生姜原汁具有清除超氧阴离子
及羟自由基的作用≈t  o为探讨生姜成分对软骨
细胞产生活性氧的清除作用及对大骨节病的治
疗作用 o我们研究了生姜石油醚提取轻组分对
黄腐酸刺激体外培养软骨细胞产生活性氧的清
除作用 ∀
1 材料与方法
1 q1 材料
⁄ ∞ 培养基kŠŒ…≤ ’l o胎牛血清k天津
生化制品厂l o≤²± „ !过氧化氢酶 !胶原酶k µ
型l !胰蛋白酶 !⁄≤ƒ 均购自 ≥ŒŠ  „ 公司 ~大骨
节病区黄腐酸kƒ„l由甘肃天水大骨节病区饮
水中提取k中国科学院生态环境中心提供l o
⁄≤ƒ ‹2⁄„由北京医科大学药学院有机教研室
按 •¬¦«¤µ§ …µ¤±§·≈u 方法合成 o生姜挥发油
kŠ∂ ’l由北京医科大学药学院药剂教研室提
供 o其他试剂均为分析纯 ∀苯航k¨ª«²µ±l鸡胚
胎由北京兽医生物制药厂提供 ∀
1 q2 方法
1 q2 q1 软骨细胞分离 !培养
软骨细胞分离 !培养按 °¤·µ¬½¬² ≤¤¶·¤ª±²2
·¤≈v 方法稍加改进 o即 }在无菌条件下 o取孵化
tu天的鸡胚胫骨和股骨 o仔细剥离肌肉及骨
膜 o用 s qux h 胰蛋白酶消化液消化 tx°¬±
kvz ε l ~取骺板软骨 o用胶原酶消化 v«kvz ε l ∀
得到分散均匀的单个细胞后 o每瓶按 t qx ≅ tsxr
°¯ 接种至含 ts h 胎牛血清的 ⁄ ∞ 培养基
中 o置 vz ε 细胞培养箱内 o贴壁培养 o隔日更换
含 ts h胎牛血清的 ⁄ ∞ 培养基 o培养至细
胞长满单层kz天l进行实验 ∀
1 q2 q2 ⁄≤ƒ ‹2⁄„的配制
取适量 ⁄≤ƒ ‹2⁄„先用少量无水乙醇溶解
k乙醇在被测液中不可超过 s qt h l o充氮气密
封 o置 p us ε 冰箱备用 o临用前用 °…≥ 将原液
稀释 o终浓度为 xΛ°²¯r∀
1 q2 q3 细胞加载 ⁄≤ƒ ‹2⁄„
长满单层的软骨细胞用 s qsx h 胰蛋白酶
消化液消化 o在显微镜下观察 o见细胞开始圆
缩 o用吸管吹打分散 o分散均匀后 o用 °…≥洗 u
次k{ssµr°¬±ox°¬±l o计数细胞 o调至 s qx ∗ t qs
≅ tsyr °¯ o加 ⁄≤ƒ ‹2⁄„ 稀释液至细胞悬液中 o
在 × ‹2{u型恒温振荡器k上海跃进医疗器械
厂lvz ε 振摇温育 tx°¬±o使 ⁄≤ƒ ‹2⁄„ 加载入
细胞内 ∀
1 q2 q4 过氧化氢产生及抑制试验
已加载 ⁄≤ƒ ‹2⁄„ 的软骨细胞悬液 o用台
盼蓝染色 o计数活细胞超过 |s h o分组加入
ƒ„ o≤²± „k有文献报道 ≤²± „能使软骨细胞产
生过氧化氢≈w  o我们采用 ≤²± „ 为对照l ovz ε
温育 vs°¬±k|s次r°¬±ovz ε 恒温振荡器振摇温
育l ~过氧化氢酶在细胞与 ⁄≤ƒ ‹2⁄„ 共同温育
前 tx°¬±加入 o终浓度为 yss˜r°¯ ∀经过氧化
氢酶抑制试验确定软骨细胞产生过氧化氢后 o
分组进行生姜挥发油对 ƒ„ 刺激软骨细胞产生
过氧化氢的抑制试验 }生姜挥发油加入后 o在
3 国家/八五0科技攻关项目k{x p |tz p st p sw资助l
3 3 华北煤炭医学院 唐山 syvsss
#|xx# 中国中药杂志 t||z年第 uu卷第 |期
|s次r°¬±恒温振荡器kvz ε l振摇温育 ∀
1 q2 q5 过氧化氢的流式细胞计分析
经 ƒ„ o≤²± „ 作用 vs°¬±后 o或加入生姜
挥发油后 o再加入 ƒ„ 作用 vs°¬±o在电脑控制
的 ƒ„≤≥≤ „‘型流式细胞计k美国 …2⁄公司l
上 o激发波长 w{{±° o检测发射波长 xux±° 处
的绿色荧光k前向角光散射系数小于 ul o检测
数据由 ≠≥≠≥ µ软件分析处理 ∀
2 结果与讨论
2 q1 ƒ„刺激软骨细胞产生过氧化氢
⁄≤ƒ ‹2⁄„是一种稳定的无荧光非极性化
合物 o可扩散通过细胞膜 o在胞内酶作用下脱去
乙酰基成为无荧光的 ⁄≤ƒ ‹ o‹u’u 可将其迅速
氧化成高荧光的 ⁄≤ƒ o其荧光强度与细胞产生
‹u’u量成正比 ∀而反映在 ƒ≤  谱图中为整
体细胞群效应 o即可反映平均每个细胞的过氧
化氢产量 ∀软骨细胞处在静止状态的呼吸代谢
也可使很少量 ⁄≤ƒ ‹ 氧化成 ⁄≤ƒ o在 ƒ≤  谱
图中可见加载 ⁄≤ƒ ‹2⁄„ 后的细胞发出很低的
荧光k为本底lk图 t…l ∀经外源性物质 }ƒ„ o
≤²± „刺激后 o软骨细胞内 ⁄≤ƒ 明显增多k图
t⁄o≤l o当过氧化氢酶存在时 o完全抑制了过氧
化氢的产生k表 tl ~与 ≤²± „ 比较 oƒ„ 对软骨
细胞的作用不仅与 ≤²± „ 相似 o且刺激作用程
度要高于 ≤²± „k表 tl o从而证明 ƒ„ 确实可引
发软骨细胞产生过氧化氢 ∀图 u表示三次平行
实验中 o随着 ƒ„浓度增加 o胞内 ⁄≤ƒ的荧光强
度增大 o当 ƒ„浓度为 tss°ªr时达到最大 o其
后不再增加 ∀软骨细胞内 ⁄≤ƒ的产生对 ƒ„浓
度的依赖关系也说明 ƒ„ 引发软骨细胞产生过
氧化氢与 ƒ„浓度相关 ∀
表 t 过氧化氢酶对软骨细胞产生 ‹u ’u的抑制作用
刺激物 °ªr 过氧化氢酶 ˜# °¯ p t 荧光强度
ƒ„ uss tz qwu
uss yss tt qvt
xs tz qst
xs yss tt q|w
≤²± „ tss tw qsz
tss yss tt quv
表 u Š∂ ’ 温育 s qx«对软骨细胞产生 ‹u ’u的抑制作用
ƒ„
°ªr
空白
Š∂ ’ °¯ r
s qty s qvv s qvvtl s q||
uss tz qwu ts qts ts qx{ tz qv{ ts qsz
tss tz qxt ts qtx ts q|z tz qxs
xs tz qst | q|w ts qvz ty q|{ ts qtu
ux ty qus ts qsx ts qvx ty quv
注 }Š∂ ’ 和 ƒ„自荧光为 s tl为静止温育
图 t 软骨细胞产生 ‹u ’u的比较
„ qƒ„荧光 …q软骨细胞呼吸代谢产生的 ‹u’u ≤ qxs°ªr
ƒ„刺激软骨细胞产生的 ‹u’u ⁄qtss°ªr≤²± „ 刺激软骨
细胞产生的 ‹u’u
图 u ƒ„刺激软骨细胞产生 ‹u ’u与 ƒ„浓度相关
图 v 生姜挥发油对 ƒ„刺激软骨细胞产生 ‹u ’u的清除
ƒ qxs°ªrƒ„刺激软骨细胞产生 ‹u’u Š q生姜挥发油对 ƒ„
刺激软骨细胞产生 ‹u’u的清除
2 q2 生姜挥发油对 ƒ„ 引发软骨细胞产生
#syx# 中国中药杂志 t||z年第 uu卷第 |期
‹u’u的抑制作用
实验结果发现生姜挥发油在很低浓度对
ƒ„引发软骨细胞产生 ‹u’u 具有抑制作用 o见
图v o表 u 表明在生姜挥发油为 s qty °¯ r时
k与细胞共同孵育 s qx«后l无论 ƒ„ 浓度从
ux°ªr增加到 uss°ªro胞内 ⁄≤ƒ 产量并不
增加 ∀生姜挥发油 !ƒ„k天水l在测定波长处均
无荧光k未加载 ⁄≤ƒ ‹2⁄„ 时l o对测定无影响 ∀
较高剂量生姜挥发油ks q|| °¯ rl作用下与低浓
度ks qty °¯ rl o作用效果相似k表 ul ∀表明 ƒ„
作用于体外培养的鸡胚软骨细胞引发软骨细胞
产生的 ‹u ’u 可被生姜汁轻组分抑制 ∀生姜挥
发油为脂溶性 o在与细胞膜接触进入胞内而起
作用 o在表 u 中我们看到加入生姜挥发油后 o
vz ε 静止温育组荧光值几乎与空白对照相同 ∀
许多研究发现 ƒ„ 能够对体外培养的软骨
细胞及胞外基质造成损伤 o并且与外源性活性
氧自由基造成的损伤有相似的结果≈x oy  ∀大骨
节病区 ƒ„ 对软骨组织的损伤作用 o很可能是
由于 ƒ„刺激软骨细胞产生 ‹u’u 及其他活性
氧自由基而导致软骨细胞或胞外基质异常及损
伤 o导致功能异常 ∀我们的实验表明生姜挥发
油能够清除 !抑制软骨细胞受 ƒ„ 刺激而产生
的 ‹u’u o生姜挥发油中含有多种有效成分及还
原性物质 o诸如姜酚 !姜酮和姜烯酚等分子均含
有酚羟基结构 o抗氧化能力可能与这些成分有
关 o可能从多种途径清除抑制 ƒ„ 刺激软骨细
胞产生活性氧 o但何种成分起作用及其作用机
理应待进一步研究 ∀这种常用食品的抗氧化效
能在抑制 ƒ„ 刺激软骨细胞产生活性氧方面是
有价值的 o对从日常饮食中寻找防治大骨节病
等疾病的食疗药物有指导意义 ∀
3 参考文献
t 曹兆丰等 1 中国中药杂志 ot||v ~t{ktul }zxs
u •¬¦«¤µ§…µ¤±§·¨ ·¤¯ q Ž¨¶·²±ot|yx ~tt }y
v °¤·µ¬½¬² ≤¤¶·¤ª±²¯¤ ·¨¤¯1 ׫¨ ²∏µ±¤¯ ²©≤¨¯¯…¬²¯²ª¼ ot|{y ~
tsu }uvts
w  ²·¬ ·¨¤¯1 ׫¨ ²∏µ±¤¯ ²©Œ°°∏±²¯²ª¼ ot||s ~twxkul }y|s
x 王春霞等 1 北京医科大学学报 ot|{| ~utkwl }vsz
y 李宏强等 1 科学通报 ot||w ~v|kwl }vy|
致谢 药学院有机化学教研室施羽翎同志为本研
究合成 !鉴定 ⁄≤ƒ ‹2⁄„ ~程天蓉博士为该研究做了探
索性工作 ~药学院药剂教研室强远杏同志提供生姜挥
发油 ∀
t||y ) ts ) sw收稿
地龙提取液对小鼠腹腔巨噬细胞活化的作用
张凤春 陈云峰 苏颜真 胡奇芬
k解放军第四六六医院 北京 tsss{tl
地龙是传统中药 o5本草纲目6记载 }能治疗
瘰疠溃烂 !口舌糜疮≈t  o临床上常用于治疗骨
折 !创伤 !下肢溃烂等多种疾病≈u ∗ w  o我们在临
床上发现地龙液能减少渗出 o缩短炎症期 o加速
伤口的愈合 ∀我们对地龙促小鼠腹腔巨噬细胞
活化作用进行了研究 ∀
1 材料与方法
111 动物 昆明种小鼠 o体重 us ∗ uxªo鼠龄 y
∗ {周 o全部为雄性 ∀
112 药液的制备 取鲜地龙 o吐泥 o洗净泥沙 o
制成匀浆k镜检细胞破碎l o离心 o经生化处理得
黄色澄清提取液 o浓度 xs h k按投药量计算l ∀
113 巨噬细胞活化率 将小鼠随机分组 o每只
鼠分别腹腔注射药液 u °¯ o对照组用生理盐水 ∀
次日重复注射 o第 w天采用眼眶放血法处死小
鼠 o剖开腹腔 o做腹腔印片 o每只小鼠印左 !中 !
右 v张 o自然晾干 o• µ¬ª«·2Š¬¨ °¶¤混合染色≈x  o
每个样本观察 tss个巨噬细胞 o计活跃细胞与
不活跃细胞数量 o计算活化率 o与对照组比较 ∀
细胞活跃程度的分级标准 ´型 }细胞的
#tyx# 中国中药杂志 t||z年第 uu卷第 |期