全 文 ：丹参酮对培养 °≤tu细胞损伤模型的保护作用
何丽娜t o杨 军t o姜 怡u o王 静t o刘 超t o何素冰t
kt q安徽省医学科学研究所 省生物医药重点实验室 o安徽 合肥 uvssyt ~
u q合肥市第二人民医院 o安徽 合肥 uvssssl
≈摘要  目的 }探讨丹参酮对 °≤tu细胞缺血样损伤模型的保护作用 ∀方法 }采用组织培养法 o以肾上腺嗜铬
瘤克隆化细胞株 °≤tu细胞为材料 o制备缺糖损伤 !缺氧损伤 !自由基损伤 !咖啡因损伤 !一氧化氮损伤及谷氨酸毒
性损伤模型 ∀结果 }形态学检查发现丹参酮对六种脑缺血样损伤模型中的 °≤tu细胞具有明显保护作用 o  × × 染
色和 ⁄‹ 活性测定提示丹参酮可显著提高损伤模型中 °≤tu细胞的存活数 o降低细胞损伤程度 ∀其中以对缺氧损
伤 !咖啡因损伤的保护作用尤为显著 ∀结论 }丹参酮对上述六种 °≤tu细胞缺血损伤均有显著的保护作用 o但其保
护作用可能主要与抑制细胞损伤初期病变进程及咖啡因所致细胞钙超载有关 ∀
≈关键词  丹参酮 ~°≤tu细胞 ~脑缺血样损伤
≈中图分类号  • u{x qx ≈文献标识码  … ≈文章编号  tsst2xvsukusstlsy2swtv2sw
缺血性脑血管病所致的神经细胞损伤涉及多种
因素 o微循环障碍可导致细胞能量供应短缺 o缺血后
再灌注所致的一氧化氮和氧自由基损伤加重细胞病
变的进展 o兴奋性氨基酸的毒性作用引起细胞内的
钙超载最后导致细胞坏死 ∀丹参酮是中药丹参的有
效活性成分 o具有抗缺血缺氧 !改善微循环 !抑制血
小板聚集功能和抗血栓形成作用≈t  o临床上丹参被
广泛用于治疗缺血性心脑血管性疾病 o文献已证实
丹参酮 µ„2磺酸钠能够降低缺血再灌注产生的心肌
线粒体脂质过氧化物的含量 o改善心肌线粒体膜的
流动性≈u  o并能够清除人工自由基产生系统所产生
的氧自由基≈v  ∀丹酚酸 „ 可改善脑缺血在灌注引
起的小鼠记忆功能障碍 o并使小鼠脑组织内脂质过
氧化反应和羟自由基的生成明显减少≈w  o为进一步
探讨丹参酮治疗缺血性脑血管疾病的作用及机理 o
我们观察其对传代 °≤tu 细胞理化损伤模型的影
响 ∀
1 材料
1 q1 药品与试剂 丹参酮 o河北兴隆希力药业有限
公司产品 o批号 ||svsu ∀双蒸水溶解 o微孔滤膜除
菌过滤 ow ε 冰箱保存 o实验时用 • ° Œ2tyws培养液
稀释成不同的浓度 ∀连二亚硫酸钠k‘¤u≥u ’wl o宜兴
市化学制剂三厂产品 ~葡萄糖氧化酶 o武汉中健科技
发展有限公司产品 ~硝普钠k¶²§¬∏° ±¬·µ²³µ∏¶¶¬§¨ o
≈收稿日期  usss2sx2ts
≥‘°l o北京制药工业研究所实验药厂产品 ~谷氨酸
kŠ¯ ∏·¤°¬¦¤¦¬§o Š¯ ∏l o十二烷基硫酸钠k≥²§¬∏° ⁄²2
§¤¼¯ ≥∏¯©¤·¨ o≥⁄≥l上海化剂公司产品 ~• ° Œ2tyws培
养基 !咖啡因k≤¤©©¨¬±¨ o≤¤©l ! × × k四甲基偶氮唑
盐l购自 ≥¬ª°¤公司 ~胎牛血清 o购自浙江四季青生
物有限公司 ~乳酸脱氢酶k⁄‹l测试盒购自南京建
成生物工程研究所 ∀
1 q2 细胞 °≤tu细胞 o大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤克
隆株 o引自武汉大学菌种保藏中心 o本研究室传代保
存 ∀
1 q3 细胞培养液 tyws培养液 o内含 us h胎牛血
清 otss ˜# °¯ p t青霉素 otss ª# °¯ p t链霉素 o³‹ 为
z qu左右 ∀
2 方法
2 q1 药物对实验模型的保护作用
2 q1 q1 缺糖损伤模型的建立≈x  加入无糖 ∞¤¯ µ¨. ¶
液于 °≤tu 细胞培养板中 otss¯ r孔 ovz ε ox h ≤ ’u
温箱中作用 ts «造成缺糖损伤模型 ∀
2 q1 q2 缺氧损伤模型的建立≈x  将 ‘¤u≥u ’w 干粉
加入 tyws培养液中 o使终浓度为 x °°²¯#p t o充分
搅拌 o调整 ³‹ 为 z qu o即为缺氧溶液 ∀加入缺氧溶
液至 °≤tu细胞上 { «o造成缺氧损伤模型 ∀实验除
设损伤对照及正常对照外 o还设非低氧溶液k配制同
缺氧溶液 o放置 v §以上实验使用l对照 o以消除
‘¤u≥u’w在水中的分解产物的影响 ∀
2 q1 q3 自由基损伤模型的建立≈x  加入含有葡萄
#vtw#
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糖kux °°²¯#p tl2葡萄糖氧化酶ktu qx °˜# °¯ p tl
的无血清 tyws培养基 tss Λ¯r孔 o作用 °≤tu细胞 v
«o造成自由基损伤模型 ∀
2 q1 q4 咖啡因损伤模型的建立≈x  将含 ts °°²¯#
pt ≤¤©tyws培养液作用细胞 wx °¬±后 o造成咖啡
因损伤模型 ∀
2 q1 q5 一氧化氮k‘’l神经毒性实验模型的建立≈x 
将含 ≥‘°tss Λ°²¯ #pt的 tyws 培养液作用于
°≤tu细胞 ts °¬±o造成 ‘’神经损伤模型 ∀
2 q1 q6 谷氨酸损伤模型的建立≈y  加入含 xss
Λ°²¯#p t Š¯ ∏和 xs Λ°²¯#pt甘氨酸的 tyws培养液
tss Λ¯r孔 ovz ε ox h ≤ ’u温箱中作用细胞 ws °¬±o
造成谷氨酸损伤模型 ∀
2 q1 q7 药物对损伤模型的保护作用 接种 t ≅ tsyr
°¯ °≤tu细胞于 |y孔培养板中 o置 vz ε ox h ≤ ’u
温箱孵育 y «o再加入不同浓度的丹参酮作用细胞
t{ «后 o进行各类损伤实验 ∀造型后 o换成正常
tyws培养液继续培养 y «o进行结果观察 ∀
2 q2 观察指标
2 q2 q1 细胞形态学观察 倒置显微镜下观察 °≤tu
细胞的生长及细胞病变情况 ∀
2 q2 q2  × × 法测定 细胞培养实验结束前 w «o每
孔加入 x °ª# °¯ p t  × ×ts Λ¯ vz ε ox h ≤ ’u 温箱中
继续培养 o待蓝紫色的甲 ∞‘复合物形成后 o加入
ts h ≥⁄≥vz ε 温育过夜 o使甲 颗粒彻底溶解 o⁄Š2
vsuu„酶联检测仪波长 xzs ±°下测定 ’⁄值 o计算
细胞存活率 ∀
2 q2 q3 乳酸脱氢酶k⁄‹l测定 收集细胞培养上
清 o按 ⁄‹ 测试盒说明书进行操作并计算 ⁄‹ 活
力 ∀
2 q3 统计学处理 数据以 ξ ? σ表示 ,组间数据进
行 τ检验 ∀
3 结果
3 q1 细胞形态学观察 °≤tu细胞形状呈圆形 o为
贴壁细胞 o折光度强 o生长速度快 ∀培养 v §后细胞
生长成簇 ∀损伤后 o细胞先肿胀 o折光度减弱 o最终
细胞圆缩 o脱落 ∀各模型中 °≤tu 细胞的损伤及药
物保护的形态学表现基本一致 o结果见图 t ∀
图 t 缺糖损伤时 °≤tu细胞不同阶段形态学表现
„ q正常对照组 …q细胞损伤初期阶段k缺糖 u «l ≤ q°≤tu细胞严重损伤及死亡k缺糖 ts «l
⁄q丹参酮 uss Λ¯# °¯ p t对 °≤tu细胞缺糖损伤的保护
3 q2  × × 法活细胞测定 正常活细胞能量代谢旺
盛 o胞浆中线粒体在能量代谢过程中产生琥珀酸脱
氢酶 o可将淡黄色四甲基偶氮唑盐还原成蓝紫色的
结晶 o沉淀在细胞内和细胞周围 ∀所形成的结晶与
增殖的细胞数成正比 ∀表 t中 ’⁄值可见丹参酮在
浓度 v qtux ∗ uss Λª# °¯ p t o对缺糖 !缺氧 !自由基 !
≤¤©造成的 °≤tu细胞损伤模型均较模型对照组有
显著地增高 o表明丹参酮对损伤细胞模型具有明显
地保护作用 o其作用随药物浓度的增加而提高 o
tu qx ∗ uss Λª# °¯ p t的丹参酮对 ‘’ 损伤亦具有显
著性保护作用但药物剂量组间的差异不明显 o对 Š¯ ∏
损伤丹参酮仅在浓度为 uss Λª# °¯ p t时具有显著保
护作用 ∀在各类损伤中 o丹参酮对提高 °≤tu细胞存
活数以缺糖和 ≤¤©损伤最为显著 ∀
3 q3 ⁄‹ 法测定细胞损伤程度 细胞死亡时 ⁄‹
释放入培养上清中 ∀上清液 ⁄‹ 水平反映出细胞
的损伤或死亡程度 ∀表 u可见丹参酮对缺糖损伤 !
缺氧损伤 !自由基损伤 !≤¤©损伤 !‘’ 损伤 !Š¯ ∏损伤
均有明显保护作用 o能显著地减低培养上清中 ⁄‹
活力 o降低细胞死亡率 ∀
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表 t 丹参酮对缺血样损伤模型中 °≤tu细胞增殖的影响 ’⁄值
组别 浓度rΛª# °¯ p t 缺糖损伤 缺氧损伤 自由基损伤 ≤¤©损伤 ‘’ 损伤 Š¯ ∏损伤
对照组 s q{v ? s qsx s qyz ? s qtu s qx| ? s qsy s q|u ? s qtt s qys ? s qsz s qx| ? s qsu
模型组 s qux ? s qsvtl s qxw ? s qsztl s qtz ? s qsttl s qyx ? s qt{tl s qtx ? s qsutl s qww ? s qsutl
丹参酮 uss s qxw ? s qsvvl s qy{ ? s qs{vl s quv ? s qsuvl t qtw ? s qswvl s quv ? s qswvl s qxu ? s qstvl
xs s qxs ? s qsuvl s qy{ ? s qs{vl s quu ? s qsuvl t qsx ? s qs|vl s qut ? s qsvvl s qwv ? s qsw
tu qx s qvy ? s qsvvl s qy{ ? s qs{vl s qut ? s qstvl s q|z ? s qsvvl s qtz ? s qsuul s qwu ? s qsv
v qtux s qvw ? s qsxvl s qyu ? s qs{ul s qut ? s qsvvl t qts ? s qtxvl s qty ? s qsv s qwx ? s qsu
注 }≠ ξ ? σ  ν € { ≈与对照组比较 tl Π s .st 与模型组比较 u) Π s .sx v) Π s qst
表 u 丹参酮对 °≤tu缺血样损伤模型中 ⁄‹ 含量的影响 ˜#p t
组别 浓度rΛª# °¯ p t 缺糖损伤 缺氧损伤 自由基损伤 ≤¤©损伤 ‘’ 损伤 Š¯ ∏损伤
正常组 zw qv ? w qsu tst qx ? w qxy xu qu ? t qw| utu qx ? tt qu y{ qz ? z q|s |{ qw ? t qw{
模型组 tu| qy ? u qystl t{t q| ? w q||tl twy qv ? w qvstl uyz qu ? { qxstl tyz qu ? y qz{tl tzy qy ? t qxx tl
丹参酮 uss x{ qy ? s quy ul tww q{ ? v qxvul yw qz ? x q|sul utt qv ? tt qtul {x qt ? x qsx ul |w qv ? u qwy ul
xs ys qy ? s qzu ul tyv qw ? y qtzul xu qy ? t qxs ul uut qt ? y qvxul {u q{ ? s qyw ul tut qu ? t qzsul
tu qx zt qt ? t qww ul tzv q{ ? x qwvul yz qz ? t q||ul ux{ q| ? u qz{ul {y qx ? s qxv ul tuz qu ? t qts ul
v qtux yz qt ? s qty ul usx qu ? s qwu wy qz ? t qvzul ut{ q{ ? y qu|ul {z qx ? s qzuul tyu q| ? t qxs ul
注 }与对照组比较 tl Π s .st 与模型组比较 u) Π s qst
4 讨论
°≤tu细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞
株 o具有神经内分泌细胞的一般特征 o因其有可传代
特点 o广泛应用于神经生理和神经药理学研究≈z 由
于神经细胞代谢活跃 o对脑缺血初期缺血 !缺氧耐受
较低 o极易发生神经细胞能量供应缺乏导致的能量
代谢障碍 ∀自由基和 ‘’ 所致神经细胞损伤模型可
模拟脑缺血损伤的具体过程 o高浓度 ≤¤©也导致细
胞内钙释放 o从而引起神经细胞死亡≈{  ∀ Š¯ ∏升高是
神经细胞损伤的结果 o也是进一步促进细胞损伤死
亡的原因 ∀脑缺血时 o能量供应障碍 o‘¤n2Žn2„×°
酶活动受损 o导致细胞外 Žn浓度升高 o使神经原细
胞膜去极化 o一方面引起 Š¯ ∏释放增加 o另一方面使
Š¯ ∏摄取系统发生逆转 o自胞内转移至胞外 o引起不
依赖钙的非囊泡性释放 o脑缺血时以该释放为主 ∀
Š¯ ∏通过激活细胞膜上 ‘ ⁄„和非 ‘ ⁄„受体 o使
细胞外钙内流和细胞内贮存钙释放 o造成胞内 ≤¤u n
超载 ∀胞内 ≤¤u n与钙调素k≤¤ l结合后 o激活一系
列依赖于 ≤¤u n r≤¤ 的蛋白酶 ∀特别是一氧化氮酶
k‘’≥l激活 o产生大量 ‘’ o引起严重的细胞毒性≈|  ∀
本文通过体外实验发现丹参酮对缺氧缺糖损伤
保护作用显著 o并能抑制氧自由基损伤过程 o对 ‘’2
氧自由基损伤途径同样发挥抑制作用 o这与报道的
丹参注射液可清除 ƒ u¨ n2‹u’u系统产生的 yx h羟自
由基和黄嘌呤2黄嘌呤氧化酶系统产生 tss h氧自由
基≈ts 及在离体兔心灌流液中加入丹参注射液 o可有
效清除心肌缺血再灌注产生的氧自由基≈tt 的文献
报道完全一致 ∀丹参酮的主要成分是丹参酮 ´ o丹
参酮 µ„ o丹参酮 µ • o对 ≤¤©导致的胞内 ≤¤u n大量
释放所致细胞死亡也表现出非常显著的保护 o可能
与丹参酮 µ „2磺酸钠抑制钙超载过程中大量 ≤¤u n
内流有关≈tu  ∀相比之下 o丹参酮对缺氧损伤和 ≤¤©
损伤模型的保护作用最显著 o说明丹参酮的主要作
用环节可能重在限制神经细胞缺血损伤初期病变的
发展 o此外抑制 ≤¤©引起的细胞内钙超载 o维持细胞
内外生物膜的稳态 o可能是丹参酮的另一作用机制 ∀
≈参考文献 
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出版社 ot||v qtusz q
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中国病理生理杂志 ot||t ozkul }t|w q
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功能障碍的改善作用及作用机制 q药学学报 ot||x ovskvl }
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引起的大鼠大脑皮层神经细胞元损伤的保护作用 q药学学报 o
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¦«¨ °¬¤q…µ°«¤µ°¤¦²¯ ot||u otsy }zyy q
≈ts  杨卫东 o朱鸣泉 o赵保路 q丹参的氧自由基清除作用 q中国药
理学通报 ot||s oykul }tt{ q
≈tt  岳 平 o王孝铭 o梁殿权 q丹参素对氧自由基所致大鼠心肌线
粒体 ‹ n2„× °酶损伤的保护作用 q中国病理生理杂志 ot||z o
ts }||t q
≈tu  焦选茂 o周同庆 o刘树森 o等 q丹参酮 µ „2磺酸钠对鼠肝线粒体
功能的影响 q生物化学杂志 ot||x ottkvl }u|u q
Προτεχτιϖε Εφφεχτ οφ Τανσηινονε ον Ινϕυριεδ Χυλτυρεδ ΠΧtu Χελλσιν ςιτρο
‹∞ ¬2±¤t o ≠ „‘Š ∏±t oŒ„‘Š ≠¬u o • „‘Š ¬±ªt oŒ˜ ≤«¤²t o‹∞ ≥∏2¥¬±ªt
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tux ∗ uss Λ¯ # °¯ p t ·¤±¶«¬±²±¨ ³²¶¶¨¶¶¨§²¥√¬²∏¶³µ²·¨¦·¬√¨ ©¨©¨ ¦·¶²± °≤tu ¦¨¯¯¶©µ²° ¶¬¬¬¶¦«¨ °¬¤2¯¬®¨ ¬±­∏µ¼
°²§¨ ¶¯ q פ±¶«¬±²±¨ ¦²∏¯§¬±¦µ¨¤¶¨ ·«¨ ±∏°¥¨µ²© ¬¯©¨ ¦¨¯¯¶¤±§§¨¦µ¨¤¶¨ ⁄‹ ¤¦·¬√¬·¼ ¶¬ª±¬©¬¦¤±·¯¼ o³¤µ·¬¦∏¯¤µ¯¼
¬± «¼³²¬¬¤¤±§¦¤©©¨¬±¨ ¬±­∏µ¨§ °²§¨¯qΧονχλυσιον :פ±¶«¬±²±¨ ³µ²·¨¦·¨§°≤tu ¦¨¯¯¶©µ²° ¤¯¯¬±­∏µ¼ °²§¨ ¶¯ ©¨©¨ ¦2
·¬√¨¯¼¬± √¬·µ²qŒ·¶¤¦·¬²± °¤¼ °¤¬±¯ ¼ ©²¦∏¶²±¬±«¬¥¬·¬±ª §¨ √¨¯²³° ±¨·²©·«¨ ³µ¬°¤µ¼ ³¨µ¬²§²©¬¶¦«¨ °¬¤¬±­∏µ¼
¤±§¦¤¯¬∏° ²√ µ¨¯²¤§¬±ª¬±­∏µ¼ q
[ Κεψ ωορδσ ] ·¤±¶«¬±²±¨ ~°≤tu ¦¨¯¯¶~¦¨µ¨¥µ¤¯ ¬¶¦«¨ °¬¤2¯¬®¨ ¬±­∏µ¼
≈责任编辑 方文贤 
西洋参叶 us¶2原人参二醇组皂苷对
犬急性心肌梗死的保护作用
睢大员t o于晓风t o曲绍春t o吕忠智t o王 黎u o陈满秋u
kt q白求恩医科大学 药理教研室 o吉林 长春 tvssut ~
u q白求恩医科大学 第一临床学院 o吉林 长春 tvssutl
≈摘要  目的 }研究西洋参叶 us¶2原人参二醇组皂苷k°± ⁄≥l对犬急性心肌梗死的保护作用 ∀方法 }采用麻醉
开胸犬结扎左冠状动脉前降支k„⁄l产生急性心肌梗死模型 o测定心肌梗死面积 o血清 ≤Žo⁄‹ 活性 o心肌代谢 o
自由基及冠脉循环等参数 ∀结果 }°± ⁄≥ ts ous °ª#®ªp t对急性心肌梗死 y «犬 o能明显缩小心肌梗死面积 o降低血
清 ≤Ž及 ⁄‹ 活性 o并明显降低血清 ƒƒ„及 °’ 含量 o提高 ≥’⁄及 Š≥‹2°¬活性 ∀亦能明显增加心肌血流量 o降
≈收稿日期  usss2sw2tv
≈基金项目  吉林省科委新药基金资助课题k吉科合字第 |yu|st2tl
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