全 文 ：黄芩苷对大鼠肝细胞凋亡的影响
胡 聪t o韩聚强u o徐 铮v o修贺明v o刘景东t o郝 勇t
kt1 石家庄白求恩军医学院 药学教研室 o河北 石家庄 sxss{t ~
u1 北京军区总医院 肝病研究所 o北京 tsszss ~
v1 白求恩国际和平医院 o河北 石家庄 sxss{ul
≈摘要  目的 }研究黄芩苷对体外培养大鼠肝细胞凋亡的影响 ∀方法 }将黄芩苷作用于体外培养的大鼠肝细
胞 o以肿瘤坏死因子k× ‘ƒ2Αl和放线菌素 ⁄k„¦·⁄l诱导细胞凋亡 o × × 法检测细胞活性k„ 值l ~溴甲酚绿法检测
细胞功能k„…值l ~琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术检测法定性定量检测细胞凋亡情况 ∀结果 }经 s qu ou qs Λª# °¯ p t
浓度黄芩苷作用后肝细胞活性k„值l及分泌白蛋白功能k培养上清中 „…值l均高于凋亡模型组k„ 值 Π s qsx o
„…值 Π s qstl o其中 s qu Λª# °¯ p t浓度组肝细胞的 „…值比空白对照组还高k Π s qstl ~琼脂糖凝胶电泳显示 }
只有凋亡模型组出现了典型的0梯状0条带 ~流式细胞术检测结果表明 }各中药组的凋亡率与凋亡模型组相比均有
显著性差异k Π s qstl ∀结论 }不同浓度的黄芩苷均对 × ‘ƒ2Α和 „¦·⁄所诱导的肝细胞凋亡有抑制作用 ∀
≈关键词  黄芩苷 ~肝细胞 ~细胞凋亡
≈中图分类号  • u{x qx ≈文献标识码  … ≈文章编号  tsst2xvsukusstlsu2stuw2sw
细胞凋亡是当今生命科学领域内研究的热点之
一 ∀近年来 o人们发现肝细胞的异常凋亡与各种急 !
慢性肝病的发生 !发展和预后以及肝脏恶性肿瘤的
形成密切相关 o尤其是病毒性肝炎 o虽然其发病机制
十分复杂 o但是病毒感染后所引起的肝细胞凋亡是
不容忽视的一个重要因素 ∀因此 o从肝细胞凋亡的
角度探讨保肝中药的作用机制意义重大 ∀黄芩是临
床上治疗肝病的常用中药 o黄芩苷是其中的主要有
效成分 ∀本研究采用肿瘤坏死因子k× ‘ƒ2Αl和放线
菌素 ⁄k„¦·⁄l建立凋亡模型 o观察黄芩苷对细胞凋
亡的影响 o以期探讨其保肝作用机制是否与抑制肝
细胞凋亡有关 ∀
1 材料和方法
111 药品与试剂 黄芩苷k¥¤¬¦¤¯¬±l }按文献≈t 方
法提取 ∀化学组成是黄酮与葡萄糖醛酸以氧苷键结
合的黄酮苷 o提取物经双波长薄层扫描≈u 测定其含
量为 zt qx h ∀实验时以 • ° Œ2tyws培养基配成所
需浓度 o调 ³‹ 后 5 s quu Λ°滤膜过滤 o消毒 ow ε 保
存 ~• ° Œ2tyws }ŠŒ…≤ ’ 公司 ~使用时配成 • ° Œ2
tyws完全培养基 o内含 }ux °°²¯#p t ‹ ³¨¨¶ou °°²¯
#p t Λ2谷氨酰胺 !tss ˜# °¯ p t青霉素 !tss Λª# °¯ p t
链霉素 !s qu h ‘¤‹≤ ’v ots h小牛血清kƒ≤≥l ~ƒ≤≥ }
≈收稿日期  usss2sw2tv
杭州四季青生物工程公司 ~四甲基偶氮唑蓝
k × ×l }˜≥… 公司 ~台盼蓝 !Œ型胶原酶 !丫啶橙
k„’l !溴乙锭k∞…l }≥¬ª°¤公司 ~琼脂糖 }°µ²° ª¨¤公
司 ~蛋白酶 Ž} µ¨¦®公司 ~白蛋白试剂盒 }北京北化
精细化学品公司 ~×∏° µ¨‘¨¦µ²¶¬¶ƒ¤¦·²µ2Αk× ‘ƒ2Αl o
‹ ³¨¤·²¦¼·¨ Šµ²º·« ƒ¤¦·²µk‹Šƒl }北京邦定公司 ~黄
芩苷标准品ksztx2|zs{l }中国药品生物制品检定
所 ~黄芩 }石家庄市医药公司 ~其余试剂均为国产分
析纯 ∀
112 实验动物 • ¬¶·¤µ大鼠 t只 o雄性 o体重 {s ∗
tss ªo白求恩国际和平医院实验动物中心提供 ∀
113 大鼠肝细胞的分离与原代培养 参照 ≥ ª¨¯ ±¨
法≈v 并做部分修改 ∀获取的肝细胞经台盼蓝排斥试
验 o细胞活率达 |s h ∀调整细胞密度为 u ≅ tsx个细
胞r °¯ o分别接种于 |y孔板 !uw孔板 !y孔板及培养
瓶中 o置 vz ε ox h ≤ ’u条件下培养≈w ox  ∀
114 黄芩苷对大鼠肝细胞凋亡的影响 肝细胞接
种培养 uw «后 o镜下观察 o细胞变薄 o拉长 o核大清
晰 o线粒体明显 o细胞贴壁率达 zs h o此时加药进行
干预 ∀取终浓度为 s qu ou qs ous Λª# °¯ p t的黄芩苷分
别加入各培养器皿中 ovs °¬±后加入 „¦·⁄ ws ±ª#
°¯ p t ovs °¬±后再加入 × ‘ƒ2Α uxss ˜# °¯ p t ∀空白
对照组加入同体积的细胞悬液 o不加任何药物 ~凋亡
模型组只加入 „¦·⁄及 × ‘ƒ2Α∀待药物作用 uw «
#wut#
第 uy卷第 u期
usst年 u月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂ ²¯ quy o‘²qu
ƒ ¥¨qousst
后 o观察并分析细胞凋亡发生情况≈y  ∀
11411 细胞活性检测k  × ×l法≈z  于各组中k|y
孔培养板l加入  × × ts Λ¯ ow «后吸除各孔上清 o加
入酸化异丙醇 tss Λ¯ o振荡 o孵育 vs °¬±o置 ⁄Š2
vsuu„型酶联免疫检测仪上测每孔 xzs ±°吸收度
„值 ∀
11412 细胞功能检测≈{  取药物作用后的细胞培
养上清 o用溴甲酚绿法置 zuu光栅分光光度计上测
yvs ±°波长下各管中吸收度 „ 值 o除去 tyws中小
牛血清的干扰k„ € s qsu{l o计算白蛋白k„…l含量 ∀
11413 ⁄‘„ 的提取及 ⁄‘„ 片断琼脂糖凝胶电泳
药物作用后的肝细胞经培养 uw «o吹打 o收集至
tsy个细胞r¦°u o用 °…≥洗 ψ w ε 离心后 ψ沉淀溶于
us Λ¯ °…≥中 ψ加 wss Λ¯ 细胞裂解液kt h ‘°2ws ous
°°²¯#p t∞⁄× „ oxs °°²¯#p t ×µ¬¶‹≤¯o³‹ z qxl u
∗ x °¬±后 ψ w ε 离心 u次 ψ上清加 t h ≥⁄≥至 xs
Λ¯ ψ • ‘¤¶¨ „ x Λ¯ o置摇床中水浴加热振荡 t «后 o加
入蛋白酶 Žu qx Λ¯ o继续水浴加热振荡 t «o再加入
tux Λ¯ ts °²¯#pt乙酸铵及 t °¯ 冰醋酸 o混匀 ψ p
us ε 放置过夜 ∀次日取出 ow ε 离心弃上清 o每管再
加入 wss Λ¯ 冷 zx h乙醇 o轻轻吹打 o沉淀混匀 o弃之
不要 ψ倾斜倒置微离心管于滤纸片上 otx °¬±后 o加
×∞缓冲液 vs Λ¯ o⁄‘„全部溶解即可走电泳 ψ ys ∂
电压下电泳 v «ψ紫外透射仪上观察并照相 ∀
11414 流式细胞术检测kƒ≤  l≈|  收集药物处理
后的肝细胞 o离心 o去上清 o°…≥洗两次 ∀w ε ozx h
乙醇固定 uw «以上 o离心洗涤细胞 o调整细胞浓度
为t ≅ tsy# °¯ p t ∀用 °Œ染液使终浓度为 xs Λª#
°¯ p t o摇匀后 w ε 避光放置 t «∀经 tss目尼龙网过
滤后 o在 ƒ„≤≥ wus流式细胞仪上测定 ⁄‘„含量 ∀
所有结果的显著性均采用 ≥°≥≥ { qs统计软件
进行分析处理 ∀实验结果以 ξ ? σ表示 ∀
2 结果
211 肝细胞活性 s qu ou qs Λª# °¯ p t浓度黄芩苷作
用后的肝细胞活性k„ 值l均高于凋亡模型组k Π
s qsxl ∀而 us qs Λª# °¯ p t黄芩苷组肝细胞活性与凋
亡模型组相比无显著性差异k表 tl ∀
212 肝细胞功能 s qu ou qs Λª# °¯ p t黄芩苷作用后
的肝细胞培养上清中 „…值明显高于凋亡模型组
kΠ s qstl o且 s qu Λª# °¯ p t黄芩苷组的 „…值比
空白对照组还高k Π s qstl o而 us qs Λª# °¯ p t组的
„…值与凋亡模型组相比无显著性差异k表 ul ∀
表 t 不同组别大鼠肝细胞活性检测k  × × 法l
组别 剂量rΛª# °¯ p t 吸收度 „值r h
空白对照组 s qwsv ? s qswy
凋亡模型组 s quwv ? s qsyx
黄芩苷组 s qu s qwst ? s qsxvtl
u qs s qv{z ? s quuttl
us qs s quyv ? s qtws
注 }ν € v t)黄芩苷组与凋亡模型组比 Π s qsx
表 u 不同组别大鼠肝细胞培养上清中白蛋白含量测定
组别 剂量rΛª# °¯ p t 白蛋白k„…l值rª#p t
空白对照组 v qtyu ? s qtst
凋亡模型组 u qvzz ? s qtux
黄芩苷组 s qu v qyvu ? s qutwu ovl
u qs u q|wu ? s qvxxul
us qs u qv{u ? s qswt
注 }ν € v u)黄芩苷组与凋亡模型组比 Π s .st v)黄芩苷组
与空白对照组比 Π s qst
213 ⁄‘„片断琼脂糖凝胶电泳 经 × ‘ƒ2Α及 „¦·
⁄诱导的凋亡模型组肝细胞的 ⁄‘„降解明显 o可见
清晰的 ⁄‘„ /梯状0条带 ) ) ) 凋亡的典型特征 ∀而
对照组及黄芩苷各组均未出现k图 tl ∀
图 t ⁄‘„片断琼脂糖凝胶电泳
„ q°¤µ® …q空白对照组 ≤ q凋亡模型组 ⁄qs quΛª# °¯ p t黄芩苷组
∞qu qsΛª# °¯ p t黄芩苷组 ƒ qus qsΛª# °¯ p t黄芩苷组
214 流式细胞术检测 }由于凋亡细胞 ⁄‘„ 在内源
性核酸酶的作用下裂解成 uss ¥³左右或与之成整
倍的寡核苷酸 o经去垢剂在细胞膜上打孔后 o小片段
⁄‘„会泄露出来 o因此 o凋亡细胞的 ⁄‘„ 含量比正
常细胞少 ∀经染色后显示 ⁄‘„峰时 o会在正常二倍
体ku≤l峰k包括 ŠsrŠt 期细胞l之前出现一个小峰 o
即 „°峰k¤³²³·²¶¬¶³¨ ¤®o„°l o可以据此峰的大小推
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测出发生凋亡的细胞量 ∀从图 u中可以看出 o空白
对照组未出现 „°峰 o仅显示 u≤ 峰及 w≤ 峰k包括
Šu o 期细胞l ~凋亡模型组 „°峰明显 o而中药各组
虽有 „°峰出现 o但明显低于凋亡模型组k图 ul ∀空
白对照组凋亡率为 t qz h o而凋亡模型组为 tz qx h o
各中药组的凋亡率与空白对照组及凋亡模型组相比
均有显著性差异k Π s qstlk表 vl ∀
表 v 流式细胞术检测不同组别大鼠肝细胞凋亡率
组别 剂量rΛª# °¯ p t 凋亡率r h
空白对照组 t qzs ? s qtvtul
凋亡模型组 tz qxt ? s qtzuvl
黄芩苷组 s qu { qs ? s qzxtu ovl
u qs { qw ? s qwwxu ovl
us qs { qy ? s qzsuu ovl
注 }ν € v u)与凋亡模型组比 Π s qst vl与空白对照组比
Π s qst
3 讨论
近年来的研究表明 o各种急 !慢性肝病的发病过
程均与肝细胞的异常凋亡有关 ∀在病毒性肝炎患者
的肝组织中肝细胞凋亡与坏死同时存在 o患者体内
还有 × ‘ƒ2Α等多种细胞因子水平的升高 o细胞因子
水平的升高又加重了肝损害≈ts  ∀ ¨¬¶·等≈tt 发现 }
× ‘ƒ2Α可通过诱导肝细胞凋亡参与肝脏疾病的发病
过程 ∀但是 × ‘ƒ2Α在体内外单独应用时并不引起
细胞凋亡 o只有在与氨基半乳糖和放线菌素 ⁄等合
用时才显示出明显的毒性作用 ∀ „¦·⁄为转录抑制
剂 o可使肝细胞对 × ‘ƒ 毒性的敏感性大大增强 o而
病毒的感染可能类似于转录抑制剂 o通过干扰肝细
胞的正常代谢 o使肝细胞对 × ‘ƒ2Α的毒性更敏感 o
易于发生凋亡 o说明病毒是 × ‘ƒ2Α的强诱导剂≈tu  ∀
因此 o体内外的实验研究多以 × ‘ƒ2Α及 „¦·⁄诱导
肝细胞凋亡 o建立凋亡模型≈y  ∀本实验研究发现 }不
同浓度的黄芩苷对 × ‘ƒ2Α和 „¦·⁄诱导的肝细胞凋
亡均有明显的抑制作用 o浓度越低似作用越明显 o表
明随着药物浓度的增高 o细胞毒作用也随之增强 o不
仅细胞活性降低 o且细胞功能也随之下降 o这一点在
„值与 „…值的检测结果中得到了印证 ∀由于 s qu
Λª# °¯ p t黄芩苷组中 „…含量比空白对照组还高 o
因此 o可以推测在这一浓度范围内黄芩苷对肝细胞
分泌白蛋白的功能有较强的促进作用 ∀流式细胞术
检测表明 }虽然各中药组的凋亡率明显低于凋亡模
型组k Π s qstl o但却高于空白对照组 o所以在 ⁄‘„
图 u 流式细胞术检测大鼠肝细胞凋亡率
„ q空白对照组 …q凋亡模型组 ≤ qs quΛª# °¯ p t黄芩苷组
⁄qu qsΛª# °¯ p t黄芩苷组 ∞qus qsΛª# °¯ p t黄芩苷组
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组方图中也有较低的 „°峰出现 o然而由于流式细
胞术较凝胶电泳具有更高的灵敏性≈tv  o因此 o在电
泳图中只有凋亡模型组出现了典型的/梯状0条带而
凋亡率较低的其它各中药组均未出现 ∀本实验研究
表明 }黄芩苷的保肝作用中的确存在着抑制肝细胞
凋亡机制的参与 ∀
≈参考文献 
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≈y  ¨¬¶·  o Š¤±·±¨ µ ƒ o …²«¯¬±ª¨µo ·¨¤¯ q  ∏µ¬±¨ ‹ ³¨¤·²¦¼·¨
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¶¦µ¬³·¬²±¤¯ „µµ¨¶·o ׫¨ ²∏µ±¤¯ ²© Œ°°∏±²¯²ª¼ o t||w otxv }
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uyy q
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t||x ouykwl }wwu q
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Ινδυχεδ βψ ΤΝΦ2Α ανδ Αχτ ∆ ιν Ρατσ
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[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε: ײ¶·∏¥¼·«¨ ©¨©¨ ¦·¶²©¥¤¬¦¤¯¬± ²±µ¤·«¨ ³¤·²¦¼·¨ ¤³²³·²¶¬¶¬±§∏¦¨§¥¼·∏°²µ±¨ ¦µ²2
¶¬¶©¤¦·²µ¤k× ‘ƒ2Αl ¤±§¤¦·¬±²°¼¦¬± ⁄ k„¦·⁄l ¬± √¬·µ²q Μετηοδσ: ‹ ³¨¤·²¦¼·¨¶ º µ¨¨ ¦∏¯·¤µ¨§ º¬·« §¬©©¨ µ¨±·
¦²±¦¨±·µ¤·¬²±¶²©¥¤¬¦¤¯¬± ¤±§·«¨ ¦¨¯¯ ¤³²³·²¶¬¶º¤¶¬±§∏¦¨§¥¼ × ‘ƒ2Α¤±§„¦·⁄¬± √¬·µ²q„©·¨µ¦∏¯·∏µ¬±ª©²µuw
«o·«¨ ¤¦·¬√¬·¼ ²©«¨ ³¤·²¦¼·¶º¤¶ ¬¨¤°¬±¨ §¥¼  × × ¤¶¶¤¼ ¤±§·«¨ ©∏±¦·¬²± ²©«¨ ³¤·²¦¼·¨¶©²µ¶¨¦µ¨·¬±ª¤¯¥∏°¬±
º¤¶§¨·¨¦·¨§ ¥¼ ¥µ²°²¦µ¨¶²¯∏° ∂¬µ¬§¨ ° ·¨«²§q „ª¤µ²¶¨ ª¨ ¯¨ ¯¨ ¦·µ²³«²µ¨¶¬¶¤±§©¯²º¦¼·²° ·¨µ¬¦¤±¤¯¼¶¬¶ º µ¨¨
∏¶¨§·² §¨·¨µ°¬±¨ ·«¨ ¤³²³·²·¬¦¦¨¯¯¶q Ρεσυλτσ: ׫¨ ¤¦·¬√ ·¨¼ ²©·«¨ «¨ ³¤·²¦¼·¨ k„l ¤±§¦²±·¨±·²© ¤¯¥∏°¬±
k„…l¬±·«¨ ¶∏³¨ °¤·¤±·²©¦∏¯·∏µ¨§¦¨¯¯¶¬±·«¨ ªµ²∏³¶²©s qu Λª# °¯ p t ¤±§u qs Λª# °¯ p t ²©¥¤¬¦¤¯¬±¨ º µ¨¨ ¶¬ª2
±¬©¬¦¤±·¯¼ «¬ª«¨µ·«¤±·«²¶¨ ¬±¤³²³·²·¬¦°²§¨¯ªµ²∏³k„ }Π s qst ~„…}Π s qstl ~µ¨¶³¨¦·¬√¨¯¼ ∞√ ±¨·«¨ „…
√¤¯∏¨ ¬±·«¨ ªµ²∏³²©s qu Λª# °¯ p t ¥¤¬¦¤¯¬± º¤¶«¬ª«¨µ·«¤·²©¥¯¤¦®¦²±·µ²¯ ªµ²∏³k Π s qstl ~ ׫¨ ¦¯ ¤¨µ/ ¤¯§2
§¨µ2¯¬®¨ 0 ¶·µ¨¤®2¥¤±§²© ⁄‘„ ©µ¤ª° ±¨·¶ º¤¶©²∏±§²±¯ ¼ ¬± ·«¨ ¤³²³·²¶¬¶ °²§¨¯ ªµ²∏³ ¥¼ ·«¨ ¤ª¤µ²¶¨ ª¨¯ ¨¯ ¦¨2
·µ²³«²µ¨¶¬¶q ׫¨ ©¯²º ¦¼·²° ·¨µ¼¶«²º §¨·«¤·¤¯¯·«¨ ¤³²³·²¶¬¶µ¤·¨¶¬±·«¨ ·«µ¨¨¥¤¬¦¤¯¬± ªµ²∏³¶º µ¨¨ ²¯º µ¨·«¤±
·«¤·²©·«¨ ¤³²³·²·¬¦°²§¨¯ªµ²∏³k Π s qstl ∀ Χονχλυσιον : …¤¬¦¤¯¬±¨ ¦¤± µ¨¶·µ¤¬± µ¤·«¨ ³¤·²¦¼·¨ ¤³²³·²¶¬¶¬±2
§∏¦¨§¥¼ × ‘ƒ2Α¤±§ „¦·⁄¬± √¬·µ²q
[ Κεψ ωορδσ] ¥¤¬¦¤¯¬±¨ ~«¨ ³¤·²¦¼·¨ ~¤³²³·²¶¬¶
≈责任编辑 方文贤 
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