全 文 ：z种药物对醛糖还原酶的抑制作用
刘长山 3 朱禧星
k上海医科大学附属华山医院内分泌科 上海 ussswsl
摘要 应用酶动力学抑制实验 o观察了 z种药物对牛睾丸纯化的醛糖还原酶的抑制作用 o结果发现
¶²µ¥¬±¬¯o·²¯µ¨¶·¤· o水飞蓟宾 o黄连素酶抑制作用较强 o其抑制常数分别为 }t1s{ os qtuΛ°²¯r~v1x o
u1zΛªr °¯ ∀另外我们认为 o利用本实验建立的方法可以进行醛糖还原酶抑制剂的初步筛选 ∀
关键词 糖尿病 醛糖还原酶 醛糖还原酶抑制剂
糖代谢的多元醇通路代谢增加是糖尿病慢
性并发症k⁄≤≤l的重要发病机制之一≈t  o该通
路的关键限速酶 ) ) ) 醛糖还原酶k„ • l高血糖
时被激活 o催化葡萄糖大量转化为不易透过细
胞膜的山梨醇 o引起细胞渗透性损伤诱发 ⁄≤≤
发生 ∀因而应用醛糖还原酶抑制剂k„ • Œ¶l有可
能防止 ⁄≤≤ 的发生与发展≈u  ∀我们利用体外
酶动力学实验方法 o分析了 z种对 „ • 有抑制
作用的药物 o并对其作用性质进行初步分析 ∀
1 材料与方法
111 药品 ‘„⁄°‹ 为 ≥¬ª°¤公司产品 ~∆Λ2
甘油醛为意大利 • ²·«公司产品 ~¶²µ¥¬±¬¯o·²¯µ¨2
¶·¤·由美国北得克萨斯大学细胞生物学教研室
徐国彤博士惠赠 ~水飞蓟宾kv{1x°ªr片l o上海
朝晖制药厂产品 ~黄连素ktss°ªr片l o上海利
生制药厂产品 ~柴胡 !丹参为注射液 o浓度分别
为 u1x ot1xªr °¯ o上海中药一厂产品 ~苯巴比妥
为注射粉剂 o每支含量 tss°ªo上海新亚制药厂
产品 ∀以上药物配成溶液 o用时根据需要稀释 ∀
112 牛睾丸 „ • 分离纯化 按 ≤«¤®µ¤¥¤µ·¬
等≈v 方法 o包括 }匀浆制备 o反复离心 o硫酸铵盐
析 o⁄∞„∞2纤维素 !羟基磷灰石 !葡聚糖 Š2tss
三步柱层析 ~≥⁄≥2°„Š∞电泳鉴定其纯度 ∀
113 酶的活性测定 按 ≥µ¬√¤¶·¤√¤等≈w 法 ∀用
光径 t¦°石英比色杯在 ˜ ∂2uws分光光度计下
记录 ‘„⁄°‹ 在 vws±° 处吸光值的下降来表
示 „ • 活性 o测定温度 ux ε o反应体系总体积
t °¯ o包括 }yz°°²¯r的 ‘¤n2Žn 磷酸缓冲液
k³‹y1ul ox°°²¯r的 u2巯基乙醇 ots°°²¯r
的 ∆Λ2甘油醛 os1t°°²¯r的 ‘„⁄°‹ 和适量
的酶 o反应时间至少记录 v°¬±∀
测定药物对 „ • 活性的影响时 o固定药物
浓度 o改变底物浓度 o每一药物分析至少用 x个
不同的药物浓度和 y个不同的底物浓度 o平行
测定 v次 o取均值 ∀
114 数据处理 本实验为计算方便将反应速
度值规定为 ‘„⁄°‹ 在 vws±° 处每分钟吸光
值的改变 o将测得酶活性读数按双倒数k¬±¨ º2
√¨ µ¨2…∏µ®l作图确定药物对 „ • 抑制类型后 o再
用 ⁄¬¬²±或 ≤²µ±¬¶«2…²º§¨ ±作图法求取药物对
„ • 的抑制常数 Ž¬∀
2 结果
牛睾丸 „ • 纯化结果 ≥⁄≥2°„Š∞电泳鉴
定呈均一条带 ∀药物对 „ • 的抑制作用以其抑
制常数 Ž¬为代表 o每一药物的 Ž¬求取根据陈
惠黎等≈x 提出的方法 }首先利用双倒数作图法
确定抑制剂对酶促反应的抑制类型 o然后根据
抑制类型的不同应用不同的作图求取 Ž¬值 o若
为非竞争性抑制 o则用 ⁄¬¬²±作图法k以抑剂的
浓度对反应速度的倒数作图l求取 Ž¬值 ~若为
反竞争性抑制 o则用 ≤²µ±¬¶«2…²º§¨ ±作图法k以
抑制剂浓度对浓度r反应速度比值作图l o求取
Ž¬值 ∀混合型抑制则先用 ⁄¬¬²±作图法求取
Ž¬o再用 ≤²µ±¬¶«2…²º§¨ ±作图法求其另一抑制
3 山东潍坊人民医院内分泌科 潍坊 uytswt
#uzv# 中国中药杂志 t||z年第 uu卷第 y期
常数 Ž¬χ o即混合性抑制有两个抑制常数 Ž¬o
Ž¬χ ∀若 Ž¬ Ž¬χ o又称作混合性非竞争和竞争
性抑制 o若 Ž¬ Ž¬χ o又称作混合性非竞争和反
竞争抑制 ∀根据上述方法 o我们分别研究了 z
种药物对牛睾丸 „ • 的抑制作用 o结果发现
¶²µ¥¬±¬¯为非竞争性抑制 o·²¯µ¨¶·¤·为反竞争性
抑制 o这两种药物对 „ • 抑制作用较强 oŽ¬值在
Λ°²¯r水平 o水飞蓟宾 !黄连素k¥¨µ¥¨µ¬±¨ l对
„ • 亦有较强抑制作用 oŽ¬值在 Λªr°¯ 水平 o抑
制类型为混合性抑制 ∀所有 z种药物的抑制类
型及抑制常数统计于附表 ∀
附表 z种药物对醛糖还原酶的
抑制常数的抑制类型 Λªr°¯
抑制剂 抑制类型 Ž¬ Ž¬χ
¶²µ¥¬±¬¯ 非竞争性抑制 t1s{tl
·²¯µ¨¶·¤· 反竞争性抑制 s1tutl
苯巴比妥 非竞争性抑制 {sstl
水飞蓟宾 混合性抑制 v1x x1x
黄连素 混合性抑制 u1z u1u
丹参 混合性抑制 uss uxs
柴胡 无抑制作用
注 }tl单位为 Λ°²¯r
3 讨论
糖尿病及并发症是世界性常见病 o其发生
机制复杂 o一直缺少有效的防治手段 ∀近年来
随着对糖代谢多元醇通路的认识的深入 o应用
„ • Œ¶治疗 ⁄≤≤ 有了很大进展 o迄今为止 o已报
道对 „ • 有抑制作用的 „ • Œ¶有几十种之多 o新
合成的 „ • Œ¶仍不断出现 o其中部分已进入临床
试用 o这些 „ • Œ¶分属羧酸 !类黄酮 !螺旋己内酰
脲等几大类≈t  o然而这些 „ • Œ¶均系人工合成的
化合物 o不仅价格昂贵 o而且有一定的毒副作
用 o限制了其临床实用价值 ∀
利用纯化 „ • 体外作抑制剂对酶促反应动
力学的影响是初步筛选 „ • Œ¶的常用方法 o我们
选用牛睾丸 „ • 用于评估各种 „ • Œ¶的作用 o不
仅因为材料来源方便易得 o而且它的许多理化
特性与人 „ • 相似 o因而更能较好地代表人 „ •
的作用≈y  ∀本研究所用酶为电泳纯的高纯化
„ • oŽ¤§²µ≈z 认为 „ • 的作用既有种属特异性 o
又受酶纯度的影响 o在非均一的蛋白溶液中 o蛋
白质之间的相互作用及蛋白质与小分子物质之
间的作用可影响酶的动力学性质 ∀
¶²µ¥¬±¬¯o·²¯µ¨¶·¤·均系公认的 !高效的 „ •
抑制剂 o本实验发现对牛睾丸的 „ • 抑制常数
分别为 t1s{ os1tuΛ°²¯r∀¶²µ¥¬±¬¯是螺旋己内
酰脲类 „ • Œ¶o曾是应用最广泛的 „ • Œ¶之一 o但
近年来临床试用过程中出现了较多副作用≈t  ∀
·²¯µ¨¶·¤·属羧酸类 o临床观察副作用极少 o是一
种较有实用价值应用前景的 „ • Œ¶∀
苯巴比妥的抑制常数为 s1{°°²¯ro与
¶²µ¥¬±¬¯o·²¯µ¨¶·¤·相比有一个数量级的差别
k„ • 活性抑制一半时的血浆浓度相当于
s1t{ªrl o显然只有服用远远超出极量的苯巴
比妥时才能有效地抑制 „ • 活性 o因此作为
„ • Œ¶无临床价值 o但它是一种与一般 „ • Œ¶化
学结构不同的化合物 o认识和了解它的 „ • 抑
制作用可能为寻找新的 „ • Œ¶提供一些线索 ∀
中药作为 „ • Œ¶应用意义很大 o中药作为
„ • Œ¶应用一个重要优点就是价便宜且无明显
副作用 o尤其 ⁄≤≤ 病变呈慢性经过 o使用 „ • Œ¶
的原则必然是长期的 o使用几无副作用的中药
尤为优越 o因此有必要对其进行大量的筛选 o从
中找出有效的中药以用于 ⁄≤≤ 的防治 o本研究
发现黄连素kŽ¬u1zΛªr°¯ oŽ¬χu1uΛªr°¯ l和水飞
蓟宾kŽ¬xΛªr°¯ oŽ¬. |1xΛªr°¯ l对 „ • 抑制作用
较强 o而丹参的 „ • 抑制效力远低于上两药 o其
Ž¬€ ussΛªr°¯ oŽ¬. € uxsΛªr°¯ o柴胡则无抑制
作用 ∀我们认为上述方法作为 „ • Œ¶初筛方法
是比较理想的 o其方法简单 o用药很少kt°ª以
下l o对初筛 „ • Œ¶新药有一定价值 ∀
4 参考文献
t 刘长山等 q国外医学#内科分册 ot||x ~uuk|l }vy|
u ‘¤µ¤¼¤±¤±¶≥ q „±±¤¯¶²© ≤ ¬¯±¬¦¤¯ ¤±§¤¥²µ¤·²µ¼ ≥¦¬¨±¦¨ o
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x 陈惠黎等 q分子酶学 q北京 }人民卫生出版社 ot|{v }uvv
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