全 文 ：中国生态农业学报 2014年 5月 第 22卷 第 5期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, May 2014, 22(5): 566−570


* 国家自然科学基金项目(31070364)资助
** 通讯作者: 陈怡平, 主要从事环境生物学研究。E-mail: lifesci@ieecas.cn
蒙钟文, 主要从事环境生物学研究。E-mail: mengzw@ieecas.cn
收稿日期: 2013−11−08 接受日期: 2014−02−27
DOI: 10.3724/SP.J.1011.2014.31102
CO2激光与外源 NO对低温胁迫小麦的防护效应*
蒙钟文 1,2 张 静 1,2 陈怡平 1**
(1. 中国科学院地球环境研究所 西安 710075; 2. 中国科学院大学 北京 100049)
摘 要 以冬小麦‘小堰 22 号’为试验材料, 研究了 CO2激光与外源一氧化氮(NO)复合作用对低温胁迫(4 )℃
下小麦幼苗自由基双氧水(H2O2)、超氧阴离子(O2−)浓度, 超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化
物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)、一氧化氮合成酶(NOS)活性, 一氧化氮(NO)
及蛋白质含量, 及幼苗生长发育的影响。结果表明：与单独低温胁迫相比, 外源 NO 处理后低温胁迫和 CO2
激光处理后低温胁迫都显著降低了 H2O2和 O2−浓度, 提高了 SOD、CAT、POD、APX、NOS活性, NO和蛋白
质含量, 促进幼苗生长发育。外源 NO处理后再进行 CO2激光辐射, 虽然可以降低低温胁迫下幼苗 H2O2和 O2−
浓度, 提高 SOD、CAT、POD、APX、NOS活性及 NO和蛋白质浓度, 促进幼苗生长发育, 但其保护效应明显
低于外源 NO处理后低温胁迫和 CO2激光处理后低温胁迫的效果。上述结果说明, NO对低温胁迫的防护效应
优于 NO和 CO2激光复合处理。因此, 建议在农业生产中单独采用 NO处理或者 CO2激光处理, 可以促进农作
物对低温胁迫的抗性。
关键词 小麦 低温胁迫 CO2激光 NO 抗氧化酶活性 自由基
中图分类号: Q945 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2014)05-0566-05
Enhancing effects of laser and exogenous nitric oxide on chilling
tolerance of wheat seedling
MENG Zhongwen1,2, ZHANG Jing1,2, CHEN Yiping1
(1. Institute of Earth Environment, Chinese Academy of Sciences, Xi’an 710075, China;
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)
Abstract Chilling stress, one of the most important limiting environmental factors, delays plants growth and development and
reduces crops yield. The mechanisms of chilling stress is cell membrane damaged by chilling injury, which causes reactive oxygen
species (ROS) overproduction such as superoxide (O2−), hydroxyl radicals ( i OH) and hydrogen peroxide (H2O2). ROS is a cytotoxic
compound and a mediator for the induction of stress tolerance. To protect cellular and organelle membranes from ROS damage,
plants have evolved various enzymatic and non-enzymatic defense mechanisms for detoxifying free radicals and reducing oxidative
stress. The antioxidive enzymes include superoxide dismutase (SOD), ascorbate peroxidase (APX), glutathione reductase (GR),
catalase (CAT), peroxidases (POD), etc. Non-enzymatic antioxidants include glutathione, ascorbate, etc. In agriculture, scientists
have attempted to seek some effective external physical ways to help plants eliminate the overproduction of ROS and enhance plant
tolerance to environmental stress. Our previous studies also showed that CO2 laser irradiation could enhance chilling tolerance by
increasing the activities of nitric oxide synthase (NOS), CAT, POD, SOD and the concentrations of NO and glutathione. However,
little is known about effects of laser and exogenous nitric oxide on chilling tolerance of wheat seedling. To determine the effect of
CO2 laser and exogenous nitric oxide on chilling tolerance of wheat seedling, seeds were exposed to different treatments and some
physiological and biochemical parameters measured in 7-day-old seedlings. The results showed that compared with chilling stress
(CS), wheat seedling subjected to sodium nitroprusside (SNP) and then followed by chilling stress (SNP+CS), decreased the
concentrations of H2O2 and O2− and at the same time increased the activities of SOD, APX, GR, CAT, POD and NOS, and also
increased the concentrations of NO and protein and the lengths of roots and shoots. Moreover, CO2 laser treatment followed by
第 5期 蒙钟文等: CO2激光与外源 NO对低温胁迫小麦的防护效应 567


chilling stress (LR+CS) resulted in significant decrease in the concentrations of H2O2 and O2−, and increased activities of SOD, CAT,
POD, APX GR, NOS and the concentrations of NO and protein and the lengths of roots and shoots. When wheat seedling was
subjected to SNP and CO2 laser followed by chilling stress (SNP+LR+CS), the concentrations of H2O2 and O2− was higher and the
above mentioned enzymes and seedling growth lower than that of SNP+CS. The results showed that SNP+LR had identical positive
effects on enhancing chilling tolerance in wheat seedling. However, the effect of SNP+LR was less than that of SNP treatment. The
results suggested that SNP and laser enhanced wheat seedling tolerance and recommended for application alone in agriculture.
Keywords Wheat; Chilling stress; CO2 Laser; NO; Antioxidase activity; Free radical
(Received Nov. 8, 2013; accepted Feb. 27, 2014)
高温和低温胁迫对植物生长发育、生理生化代
谢以及细胞结构均造成严重的影响, 胁迫下植物体
内活性氧 (ROS)动态平衡被打破 , 导致产生过量
ROS 分子, 从而引起膜脂、蛋白质和核酸氧化损伤,
导致细胞衰老、死亡[1]。温度胁迫还能够影响核酸
和蛋白质的构象[2−4], 抑制光合作用、损害天然光系
统Ⅱ的释氧中心(oxygen evolving complex, OEC)[5],
降低核酮糖二磷酸羧化酶(Rubisco)活性 [6], 导致类
囊体膜解聚[7]。因此, 低温胁迫是影响农作物产量的
主要限制因子。全球每年因低温伤害造成的农作物
损失高达数千亿元[8]。因此, 如何应对因环境变化引
起的低温胁迫对农业生产的负面影响是农业生态科
学的关键问题之一。
与普通光源相比, 激光具有极高的辐射能流, 高
的功率密度, 优良的相干性, 单色性、方向性好[9]。目
前激光被广泛应用于农业及生物学领域[10−11]。大量
研究证明, 激光对植物有一定的生长调节效应。如
CO2 激光能促进种子萌发[12], 提高幼苗酶活性及叶
绿素含量[13], 促进幼苗生长发育和生理生化代谢[14],
显著提高农作物抗逆境能力[15]。最近, Chen等[15]发
现 CO2激光辐射小麦种子能显著提高幼苗对冷冻伤
害的抵抗能力, 与对照相比, 低温降低了小麦超氧
化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶
(POD)、一氧化氮合成酶(NOS)活性, 降低了谷胱甘
肽和一氧化氮(NO)含量, CO2 激光处理后再经低温
胁迫, 可显著提高小麦的 SOD、CAT、POD、NOS
活性, 提高谷胱甘肽和 NO 含量和生物光子辐射强
度, 从而降低丙二醛(MDA)和氧化型谷胱甘肽含量,
促进低温胁迫下小麦幼苗生长。
一氧化氮(nitric oxide, NO)是生物体内一种广
泛存在的信号传导分子[16], 植物可以通过一氧化氮
合成酶(NOS)、硝酸还原酶(NR)或者非酶促反应等途
径合成 NO[17], 其生物学功能是调节植物的生长发
育, 调节植物对逆境胁迫的应答响应。外源 NO处理
能提高植物对盐胁迫[18]、干旱胁迫[19]、紫外胁迫[20]、
重金属胁迫[21]等适应能力, 提高植物抗逆境能力。
然而外源 NO 与激光复合作用是否能提高农作物对
低温胁迫的适应能力, 这个问题尚不清楚。为此, 本
研究采用外源 NO 和 CO2激光处理小麦种子, 研究
小麦苗期生理生化变化规律, 旨在探讨外源 NO 和
CO2 激光对低温胁迫下小麦幼苗的防护效应及机制,
为 NO和激光在农业生产上的应用提供理论依据。
1 材料与方法
以小麦(Triticum aestivum L.,‘小堰 22号’)为试验
材料, 种子购于杨凌种子公司。NO 供体硝普钠(亚硝
基铁氰化钠, sodium nitroprusside, SNP, 购自 Sigma公
司)浓度为 50 μmol·L−1(预试验发现 50 μmol·L−1浓度对
小麦生长发育具有显著促进效应)。CO2激光辐照处理
时间为 6 min, CO2 激光波长 10 600 nm, 射束直径
6 mm, 辐照功率密度 20 mW·mm−2。
挑选大小均匀的种子, 流水清洗干净, 0.05%的
升汞表面消毒 10 min。无菌水冲洗 3~5 遍, 灭菌滤
纸吸干表面水分, 种子随机分为 4 组: 蒸馏水浸种
后低温(4 ℃)胁迫处理组(CS); 50 μmol·L−1SNP溶液浸
种后低温胁迫处理组(SNP+CS); 50 μmol·L−1SNP溶液
浸种后 CO2 激光辐照处理组(SNP+LR); 50 μmol·L−1
SNP 溶液浸种后 CO2激光辐照, 然后低温胁迫处理
组(SNP+LR+CS)。每个处理组设置 3 个重复。由于
前期研究工作已经证明了低温胁迫对小麦正常生长
的负效应以及 CO2激光对缓解小麦低温胁迫的正防
护效应[15], 故本研究设置 CS组为对照组。将种子播
种于铺有 2层滤纸的培养皿内, 每皿 90粒, 置 25 ℃
人工气候箱萌发, 8 h光照, 4 d后将 CS、SNP+CS、
SNP+LR+CS 处理组幼苗放置于 4 ℃培养箱进行低
温胁迫 24 h, 低温胁迫结束后, 25 ℃缓解 24 h。
取 7 日龄小麦幼苗进行生理生化测定。每个处
理组随机选取 30株幼苗, 采用直尺测量株高和根长,
分别采用 Lin等[22]、张志良等[23]的方法测定 H2O2、
O2−含量, 采用文献[24−27]的方法测定 SOD、CAT、
POD、APX 和 GR 活性, 采用 Murphy 和 Noack[28]
的方法测定 NOS活性和 NO含量, 采用 Bradford[29]
的方法测定可溶性蛋白含量。
数据处理与分析采用 Excel软件和 SPSS 16.0软
件进行。
568 中国生态农业学报 2014 第 22卷


2 结果与分析
2.1 不同处理对小麦幼苗活性氧(ROS)浓度的影响
ROS 浓度升高是小麦幼苗遭受低温胁迫的重要
特征之一[15]。图 1为不同处理下小麦幼苗体内 H2O2
和 O2−浓度的变化情况。从图 1可以看出, 与低温胁
迫组相比 (CS), 外源 NO 预处理后经历低温胁迫
(SNP+CS)、外源 NO 预处理后经历 CO2 激光辐照
(SNP+LR)、外源 NO预处理后经历 CO2激光辐照再
经过低温胁迫处理 (SN++LR+CS), 小麦幼苗体内
H2O2和 O2−浓度均显著降低(P<0.05), H2O2浓度分别
降低 20.3%、26.4%和 13.5%, O2−浓度分别降低
12.0%、24.0%和 20.0%。

图 1 不同处理对小麦幼苗叶片 H2O2和 O2−浓度的影响
Fig. 1 Influence of different treatments on H2O2 and O2−
concentrations in wheat seedling leaves
CS: 4 ℃低温; SNP+CS: 50 μmol·L−1SNP与低温复合处理;
SNP+LR: 50 μmol·L−1 SNP 与 CO2激光复合处理; SNP+LR+CS:
50 μmol· L−1SNP 与 CO2激光、低温复合处理。下同。CS: chilling
stress of 4 ℃; SNP+CS: 50 μmol·L−1 SNP and chilling stress of 4 ℃;
SNP+LR: 50 μmol·L−1 SNP and CO2 laser irradiation; SNP+LR+CS:
50 μmol·L−1 SNP combined with CO2 laser irradiation and chilling
stress of 4 ℃. The same below.

2.2 不同处理对小麦幼苗抗氧化酶活性的影响
POD、APX、SOD、CAT 和 GR 等抗氧化酶组
成了植物细胞内的酶促防御系统, 其生物学功能是
清除自由基, 保护植物免受自由基损伤[15]。从图 2
可知, 与低温胁迫相比, 不同处理均能显著提高小
麦幼苗 SOD、GR、CAT、APX和 POD活性。外源
NO 预处理后遭受低温胁迫 (SNP+CS)小麦幼苗
SOD、GR、CAT、APX和 POD活性分别比对照(CS)
处理提高 27.3%、57.8%、23.3%、42.4%和 18.2%, 外
源 NO 处理后经 CO2激光辐照(SNP+LR), 小麦幼苗
SOD、GR、CAT、APX和 POD活性分别提高 48.5%、
113.3%、41.7%、60.0%和 39.5%, 外源 NO 处理后
经 CO2激光辐照, 然后经历低温胁迫(SNP+LR+CS),
小麦幼苗 SOD、GR、CAT、APX和 POD活性分别
提高 15.2%、47.8%、10.0%、38.2%和 11.6%。

图 2 不同处理对小麦幼苗叶片抗氧化酶活性的影响
Fig. 2 Influence of different treatments on antioxidant enzyme
activities in wheat seedling leaves
2.3 不同处理对小麦幼苗 NOS 活性和 NO 浓度的
影响
从图 3 可以看出, 不同处理组 NOS 活性与 NO
浓度的变化趋势相似。与对照(CS)相比, 经外源 NO
处理后低温胁迫下的小麦幼苗 NOS活性和 NO浓度
分别提高 37.6%和 43.5%, 外源 NO预处理后 CO2激

图 3 不同处理对小麦幼苗叶片 NOS活性和 NO浓度的
影响
Fig. 3 Influence of different treatments on NOS activity and
NO concentration of wheat seedling leaves
第 5期 蒙钟文等: CO2激光与外源 NO对低温胁迫小麦的防护效应 569


光处理, NOS 活性和 NO 浓度分别提高 48.2%和
56.6%, 外源 NO预处理后 CO2激光处理遭受低温胁
迫, NOS活性和 NO浓度分别提高 28.2%和 28.2%。
2.4 不同处理对小麦幼苗生长的影响
从图 4可以看出, 外源NO预处理再经低温胁迫,
小麦抗低温胁迫能力显著增强, 地上和地下可溶性
蛋白含量、株高和根长与低温胁迫相比均有显著的提
高, 与对照(CS)相比分别增长 29.8%、13.8%、23.4%
和 33.9%。CO2激光预处理后再经低温胁迫, 地上和
地下部分蛋白质、株高和根长提高 42.4%、26.4%、
43.7%和 54.8%。NO 与 CO2激光复合处理后低温胁
迫, 幼苗地上和地下部分蛋白质、株高和根长比低温
胁迫分别提高 20.8%、10.3%、31.3%和 41.9%。

图 4 不同处理对小麦幼苗可溶性蛋白含量(A)、株高和
根长(B)的影响
Fig. 4 Influence of different treatments on soluble protein content
(A) and root length and shoot height (B) of wheat seedling
3 讨论
低温胁迫是许多温带农作物正常生长的主要限
制因子, 因此提高农作物的适应低温环境, 抗冻能
力(提高低温应答基因的表达)一直是科学家关注的
科学问题[30]。低温胁迫后植物体内的 ROS代谢就会
失调, 导致植物体内产生 O2−、 i OH、H2O2 等过量
的自由基, 体内 ROS 积累, 植物的膜结构与功能就
会受到损伤。植物在长期的进化过程中形成了清除
自由基的抗氧化机制, 主要包括酶类和非酶类。SOD、
GR、CAT、APX 和 POD 为主要的抗氧化酶, 具有
很强的清除自由基功能。低温胁迫引起植物细胞膜
的流动性降低, 体内产生多量的自由基, 降低抗氧
化酶活性。本研究表明低温胁迫导致 ROS显著增多,
与单独低温胁迫相比, 外源 NO 预处理后经低温胁
迫(SNP+CS)小麦幼苗自由基浓度(H2O2 和 O2−)显著
降低, SOD、GR、CAT、APX和 POD活性显著升高;
外源 NO 预处理后经 CO2激光辐照(SNP+LR), 小麦
幼苗 H2O2和 O2−浓度低于 SNP+CS组, SOD、GR、
CAT、APX和 POD活性显著高于 SNP+CS, 如果外
源 NO 预处理后经 CO2激光辐照后再经低温胁迫处
理(SNP+LR+CS), SOD、GR、CAT、APX和 POD活
性显著低于 SNP+CS 组, 这说明外源 NO 预处理能
显著提高农作物对低温胁迫的抗性; 虽然 NO 预处
理后经 CO2激光辐照也显著提高 5种抗氧化酶活性,
但效果不如 NO处理, 在农业生产上不宜复合施用。
低温胁迫引起植物最明显的生理变化是水分的
丢失, 当温度下降到一定程度时, 细胞膜的流动性
降低 , 通透性增加 , 使细胞内的渗透压失衡 , 而渗
透调节主要是维持细胞正常渗透压, 防止细胞过度
失水。可溶性蛋白质是亲水性较强的胶体物质, 能
够增加细胞的保水能力, 提高植物抗寒性。本研究
结果表明, 小麦幼苗不同处理组之间地上、地下部
分可溶性蛋白的变化趋势一致, 经外源 NO 处理的
幼苗低温胁迫下可溶性蛋白含量较低温胁迫有明显
提高, 外源 NO 复合 CO2激光处理较低温胁迫也有
所增加但幅度不如单独外源 NO 明显, 说明单独外
源 NO处理能显著提高幼苗的抗寒性。
植物早期生长发育对外界环境变化十分敏感 ,
它是植物生理生化响应的最终结果。外界环境剧烈
变化(热胁迫、低温胁迫、重金属胁迫等)会导致植物
生长发育受到抑制, 影响植物生物量积累。外源 NO
预处理后经过低温胁迫, 小麦生长发育受低温胁迫
的抑制效应明显缓解。综上生理生化指标来看, 单
独外源 NO 处理小麦幼苗可提高小麦幼苗抗氧化酶
活性, 降低低温胁迫对小麦幼苗的伤害, 提高抗寒
能力 , 显著改善小麦幼苗在低温胁迫下的生长状
况。外源 NO 结合 CO2激光处理可显著降低小麦幼
苗 O2−浓度, 缓解 ROS 的伤害, 明显提高小麦幼苗
可溶性蛋白含量, 增强小麦幼苗抗寒能力, 但是效
果不如 NO处理。结合以前的研究, 在农业宜单独采
用 NO 处理或激光处理, 可提高幼苗抗低温胁迫能
力, 两者不宜复合应用。
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