全 文 ：中国生态农业学报 2014年 10月 第 22卷 第 10期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, Oct. 2014, 22(10): 1214−1221


* 公益性行业(农业)科研专项(200903004)、农业部公益性行业专项(201203034)、国家苹果产业技术体系(CARS-28)和甘肃省农业生物技
术专项(GNSW-2012-27)资助
** 通讯作者: 徐秉良, 研究方向为植物病理学。E-mail: xubl@gsau.edu.cn
王卫雄, 研究方向为植物病原与植物病害。E-mail: 24810716@qq.com
收稿日期: 2014−03−08 接受日期: 2014−07−01
DOI: 10.13930/j.cnki.cjea.140272
苹果树腐烂病拮抗细菌鉴定及其抑菌作用效果测定*
王卫雄 1 徐秉良 1** 薛应钰 1 陈 臻 2 梁旭东 3
(1. 甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中−美草地畜牧业可持续发展研究中心
兰州 730070; 2. 甘肃省植保植检站 兰州 730020; 3. 七里河区植保站 兰州 730050)
摘 要 为了开发一种高效低毒的苹果树腐烂病生防制剂, 通过对峙培养法、形态学及分子生物学的方法进
行了苹果树腐烂病菌拮抗菌的分离筛选及鉴定, 采用离体枝条法测定了拮抗菌对苹果树腐烂病的防效, 并采
用显微观察和液体培养法分别研究了拮抗菌对苹果树腐烂病菌的抑菌机理和无菌滤液对苹果树腐烂病菌生长
的影响。分离筛选结果表明, 从甘肃省各苹果产区果园土壤和苹果树枝条上分离得到 23株细菌, 2株对苹果树
腐烂病菌具有较好拮抗作用, 分别为LZ-1201和TS-1203, 其对苹果树腐烂病菌菌丝生长抑制率分别为 79.00%
和 85.00%。鉴定结果表明, 菌株 LZ-1201和 TS-1203分别为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和解淀粉芽孢杆菌
(Bacillus amyloliquefaciens)。离体枝条防效测定表明, 拮抗菌无菌滤液对苹果树腐烂病的防效随着稀释倍数增
大而降低, 原液防效最高, 分别为 74.43%和 77.07%。抑菌作用机理结果表明, 两株拮抗菌均可导致苹果树腐
烂病菌丝膨大畸形、原生质浓缩、释放及溶解。拮抗菌无菌滤液对腐烂病菌生长的影响测定结果表明, 无菌
滤液对腐烂病菌分生孢子萌发和菌丝生长量均有显著抑制作用(P<0.05), 其无菌滤液稀释 40 倍时对腐烂病菌
分生孢子萌发和菌丝生长量的抑制率均高于 60%, 表明该拮抗菌具有很好的生防潜力。
关键词 苹果树 腐烂病 拮抗细菌 离体枝条防效 孢子 菌丝 抑菌作用
中图分类号: S661.1 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2014)10-1214-08
Identification and antifugla activity of the antagonistic bacteria of Cytospora spp.
WANG Weixiong1, XU Bingliang1, XUE Yingyu1, CHEN Zhen2, LIANG Xudong3
(1. College of Pratacultural Science, Gansu Agricultural University/Key Laboratory of Grassland Ecosystem, Ministry of
Education/Pratacultural Engineering Laboratory of Gansu Province/Sino-U.S. Centers for Grazing land Ecosystem Sustainability,
Lanzhou 730070, China; 2. Gansu Plant Protection and Plant Quarantine Station, Lanzhou 730020, China; 3. Plant Protection Station
of Qilihe, Lanzhou 730050, China)
Abstract In order to develop an effective biocontrol agent against apple canker, which was caused by the pathogen of Cytospora
spp., the antagonistic bacteria strains were isolated, screened and identified by the method of confronting incubation, morphology and
molecular biology. In addition, the control effect of antagonistic bacteria strains against Cytospora spp. in detached apple twigs was
determined in vitro, and the probable mechanism and antibacterial activity of antagonistic strains against Cytospora spp. conidium
germination and hypha growth were determined by microscopic observation and liquid culture. Twenty-three strains of bacteria were
isolated from the apple orchard soil and apple tree branches in apple production areas of Gansu Province. And two antagonistic
bacteria strains of LZ-1201 and TS-1203 showed significantly antagonistic effect on the Cytospora spp. growth. The inhibition rates
of LZ-1201 and TS-1203 against Cytospora spp. hypha growth were 79.00% and 85.00%, respectively. The strains of LZ-1201 and
TS-1203 were identified as Bacillus subtilis and Bacillus amyloliquefaciens, respectively. The results of control experiments showed
that the control effect of two antagonistic bacteria strains against Cytospora spp. decreased with the increasing dilution multiple of
fermentation filtrate. The undiluted fermentation filtrates of LZ-1201 and TS 1203 strains had the best control efficiencies, which
were 74.43% and 77.07%, respectively. Analysis of the probable antifungal mechanism of antagonistic bacteria strains indicated that
two antagonistic bacteria strains could induce the mycelium of Cytospora spp. enlargement and deformity, cytoplasm exosmosis and
dissolution. The fermentation filtrate of two antagonistic bacteria strains significantly reduced the conidium germination rate and
hypha growth. When diluted by 40 times, the inhibition rate of fermentation filtrates of antagonistic bacteria strains on hypha growth
第 10期 王卫雄等: 苹果树腐烂病拮抗细菌鉴定及其抑菌作用效果测定 1215


was more than 60%. Therefore, these results suggested that the antagonistic strains provide a new biological control method in
controlling apple canker.
Keywords Apple tree; Valse canker; Antagonistic bacteria; Control effect of excised twigs; Conidium; Hypha; Antifungal
activity
(Received Mar. 8, 2014; accepted Jul. 1, 2014)
甘肃省是我国苹果优势产区和生产大省, 苹果
栽种面积已跃居全国第 2 位[1]。截至 2011 年底, 全
省苹果挂果面积 30.7万 hm2, 产量 220万 t, 产值约
60 亿元[2], 因此, 苹果产业已成为甘肃中东部农民
脱贫致富的重要途径之一。但是近年来, 苹果树腐
烂病发生日趋严重, 已成为威胁全省苹果产业发展
的重要因素之一, 据报道, 2011 年甘肃省苹果树腐
烂病发病面积达 7.5万 hm2, 平均发病株率达 40%左
右, 对苹果产业的健康发展造成了严重的影响[3]。
目前, 在生产中对于苹果树腐烂病的防治主要
采取化学防治, 但化学药剂的长期使用不仅会破坏
果园的生态环境, 而且影响果实品质, 甚至可能造
成食品安全问题。因此, 为了能够解决以上问题, 寻
找能够高效防治苹果树腐烂病的低毒生防制剂势在
必行。生物防治是利用一种生物防治另一种生物的
方法, 具有无毒、无残留和无污染等特点。截至目
前 , 徐涛等 [4]、高克祥等 [5]、邓振山等 [6]及Xin等 [7]
研究发现, 链格孢属(Alternaria)、哈茨木霉(Trichoderma
harzianum)、螺旋毛科(Chaetomium spirale)和深绿木
霉(Trichoderma atroviride)等真菌能够有效抑制腐
烂病菌生长 , 展丽然等 [8]和郜佐鹏等 [9]则从土壤和
中药材中分离出多株对苹果树腐烂病菌有显著抑制
效果的内生放线菌菌株, 蔡光华等[10]和王彩霞等 [11]
发现拮抗细菌PG-10-8-11V和微嗜酸寡氧单胞菌
(Stenotrophomonas acidaminiphila)对苹果树腐烂病
也有明显的防治效果, 但是关于利用生防细菌防治
苹果树腐烂病的报道较少。因此, 本试验对苹果树
腐烂病菌的拮抗细菌进行了筛选、抑菌活性和鉴定
等方面的研究, 以期为苹果树腐烂病的生物防治提
供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
供试菌株: 苹果树腐烂病菌(Cytospora spp.)由
甘肃农业大学草业学院植物病原学实验室保存。
培养基: 拮抗菌的分离及平板对峙培养采用 NA
培养基[12], 拮抗菌的液体培养采用 NB培养基[13]; 苹
果树腐烂病菌的培养及对峙试验采用 PDA培养[14]。
样本采集: 于 2012年 9—10月从兰州、天水、
平凉、庆阳和武威各市‘富士’苹果园采集苹果树根际
土壤和感染苹果树腐烂病的枝条。
1.2 拮抗菌的分离
称取风干过筛后的各地土壤 10 g加入 90 mL无
菌水, 28 ℃、180 r·min−1摇床振荡 2 h, 静置澄清。
刮取并称量感染苹果树腐烂病的树皮 1 g 研磨至匀
浆, 加入 9 mL无菌水振荡 30 min, 静置澄清。用接
种环蘸取上清液, 采用划线法分离, 28 ℃培养 24 h
后, 对菌落大小、色泽、表面光滑度及边缘形状等
进行观察并记录, 并挑取单菌落进行纯化, 4 ℃保存
备用。
1.3 拮抗菌的筛选
采用平板对峙法进行拮抗菌的筛选[15]。用打孔
器(Ф=5 mm)在培养 5 d的苹果树腐烂病菌菌落边缘
打取菌饼, 接于 PDA 平板中央, 在其四周距培养皿
边缘 25 mm 处接种拮抗菌, 以不接拮抗菌为对照,
于 25 ℃恒温箱中培养, 每个处理 5个重复。待对照
菌落将长满平板时 , 测量各处理病原菌菌落直径 ,
计算其抑菌率, 并根据抑菌率进行拮抗菌的筛选。
100%
5
−= ×−
对照病原菌直径 处理病原菌直径抑菌率 对照病原菌直径 (1)
1.4 离体枝条抑菌活性的测定
参考臧睿[16]的烫伤接种法对 1.3 节筛选的两株
拮抗菌进行抑菌活性测定。选取 2年生苹果品种‘新
红星’枝条, 截成 15 cm 小段, 端口封蜡, 先用自来
水冲洗 2 次, 再用 75%酒精擦洗枝条表面进行消毒,
最后用无菌水冲洗 3次、晾干。用铁钉冒(Ф=5 mm)
烫伤树皮, 在烫伤处涂抹 500 μL稀释倍数为 0、10
倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍的拮抗菌的
无菌滤液, 晾干, 以涂抹无菌水为对照。在烫伤处接
种苹果树腐烂病菌菌饼(Ф=5 mm), 每个枝条 1个接
种点, 接种 5个枝条, 25 ℃黑暗保湿培养, 观察记录
枝条发病情况, 7 d后测量病斑大小, 按照椭面面积
计算病斑面积, 并计算防治效果。
100%= ×对照病斑面积－处理病斑面积防治效果 对照病斑面积 (2)
1.5 拮抗菌培养液对苹果腐烂病菌抑制作用测定
1.5.1 对苹果树腐烂病菌孢子萌发的影响
采用凹玻片法[12], 将采集的苹果树腐烂病树皮
保湿, 待分生孢子角溢出后, 用灭菌针挑取孢子角,
将其加入稀释倍数分别为 20倍、40倍、80倍、160
倍、320 倍无菌滤液中, 配成浓度约为 106 个·mL−1
的孢子悬浮液, 以苹果汁配置的悬浮液作对照, 25 ℃
1216 中国生态农业学报 2014 第 22卷


黑暗条件下保湿培养 36 h后统计分生孢子的萌发情
况, 每个处理观察 5 个视野, 每个视野统计 30 个分
生孢子, 计算分生孢子萌发抑制率(以芽管长至超过
分生孢子短径的 1/2为萌发标准)。
抑制率= 100%
1
− ×−
对照萌发率 处理萌发率
对照萌发率 (3)
1.5.2 拮抗菌培养液对苹果树腐烂病菌菌丝生长的
抑制作用及机制
用打孔器(Ф=5 mm)在培养 5 d的苹果树腐烂病
菌菌落边缘打取菌饼, 分别接于无菌滤液原液和用
PDB稀释至 20倍、40倍、80倍、160倍、320倍的
150 mL培养液中, 以 PDB作对照, 25 ℃摇床中震荡
培养 7 d后过滤, 晾干称量菌丝干重, 计算菌丝生长
量抑制率。
抑制率 = 100%− ×对照菌丝生长量 处理菌丝生长量对照菌丝生长量
(4)
参考王彩霞等[11]的方法。在活化的苹果树腐烂
病菌菌落边缘打取菌饼, 接于 PDA 平板中央, 在其
四周距培养皿边缘 25 mm处接种拮抗菌, 以不接拮
抗菌为对照, 3 d后挑取菌丝在光学显微镜下观察其
形态变化, 连续观察 7 d。
1.6 拮抗菌的鉴定
1.6.1 形态及培养特征观察
参照邓刚等[17]方法观察拮抗菌株在 NA 平板上
的生长特征和显微形态特征。
1.6.2 生理生化性状
生理生化测定参照《常用细菌系统鉴定手册》[18]
和《伯杰细菌鉴定手册》[19]等书中介绍的方法进行。
1.6.3 16s r-DNA分子鉴定
以细菌基因组柱式提取试剂盒提取的基因组
DNA 为模板, 以 Primer7F: CAGAGTTTGATCCTG
GCT 和 Primer1054R: AGGAGGTGATCCAGCCG
CA为引物, 进行扩增。PCR反应体系为 25 μL: 模
板 DNA1 μL, Primer7F 和 Primer1054R 各 0.5 μL,
dNTP 0.5 μL, 10×Taq reaction Buffer 2.5 μL, Taq
(5 u·µL−1)0.2 μL, ddH2O 19.8 μL。反应条件: 94 ℃预
变性 5 min; 94 ℃变性 30 s, 55 ℃退火 35 s, 72 ℃延伸
1 min, 35个循环; 72 ℃延伸 8 min。PCR产物经 1%
琼脂糖凝胶电泳检测, 切胶回收并将其送上海生工
生物工程有限公司测序, 测序结果在 Gen Bank中进
行同源性比对, 并利用软件DNA Star进行聚类分析,
构建系统发育树。
1.7 数据处理
采用Excel 2003进行数据处理 , 并采用SPSS
17.0软件进行单因素方差分析, Duncan氏新复极差
法进行处理间差异显著性检验。
2 结果与分析
2.1 拮抗菌的分离与筛选
从供试的土壤和枝条样品中分离到 23 株细菌
菌株(表 1), 通过与苹果树腐烂病菌对峙培养, 筛选
得到 13株均有拮抗作用的菌株, 其中 2株具有较好
拮抗作用(图 1), 分别为菌株 LZ-1201 和 TS-1203,
其抑菌率分别为 79.00%和 85.00%(表 1), 对峙抑菌
率显著高于其他菌株 , 因此选取菌株 LZ-1201 和
TS-1203做进一步研究。
表 1 从苹果园土壤和苹果枝条分离的细菌菌株对苹果
树腐烂病菌的抑制作用
Table 1 Inhibitory efficiency on Cytospora spp. growth of
different bacteria strains isolated from apple garden soil and
apple tree branches
菌株
Strain
采集地点
Collection site
菌株来源
Location of
strain
抑菌率
Inhibition rate
(%)
LZ-1201 兰州 Lanzhou 枝条 Branch 79.00±4.00bA
LZ-1202 兰州 Lanzhou 土壤 Soil 0.00±0.00fE
LZ-1203 兰州 Lanzhou 土壤 Soil 2.00±1.13efDE
LZ-1204 兰州 Lanzhou 枝条 Branch 0.00±0.00fE
LZ-1205 兰州 Lanzhou 土壤 Soil 0.00±0.00fE
PL-1201 平凉 Pingliang 土壤 Soil 10.00±1.15dCD
PL-1202 平凉 Pingliang 土壤 Soil 0.00±0.00fE
PL-1203 平凉 Pingliang 枝条 Branch 12.00±2.31dC
PL-1204 平凉 Pingliang 枝条 Branch 3.00±1.15efDE
PL-1205 平凉 Pingliang 枝条 Branch 10.00±2.31dCD
TS-1201 天水 Tianshui 土壤 Soil 7.00±2.89deCDE
TS-1202 天水 Tianshui 土壤 Soil 0.00±0.00fE
TS-1203 天水 Tianshui 土壤 Soil 85.00±3.46aA
TS-1204 天水 Tianshui 土壤 Soil 0.00±0.00fE
TS-1205 天水 Tianshui 土壤 Soil 4.00±0.58efDE
TS-1206 天水 Tianshui 枝条 Branch 12.00±2.31dC
TS-1207 天水 Tianshui 枝条 Branch 0.00±0.00fE
TS-1208 天水 Tianshui 枝条 Branch 4.00±1.15efDE
WW-1201 武威 Wuwei 土壤 Soil 0.00±0.00fE
WW-1202 武威 Wuwei 土壤 Soil 34.00±2.31cB
QY-1201 庆阳 Qingyang 土壤 Soil 0.00±0.00fE
QY-1202 庆阳 Qingyang 土壤 Soil 12.00±1.15dC
QY-1203 庆阳 Qingyang 枝条 Branch 0.00±0.00fE
同列数据后不同小、大写字母分别表示在 P<0.05 和 P<0.01 水
平差异显著(Duncan氏新复极差法)。下同。Different small and capital
letters in the same column indicate significant differences at 0.05 and
0.01 levels, respectively, by Duncan’s new multiple range test. The
same below.

2.2 离体枝条抑菌活性测定
采用离体枝条接种法测定拮抗菌株 LZ-1201 和
TS-1203 无菌滤液对苹果树腐烂病菌的抑菌活性 ,
结果(表 2)表明 , 菌株 LZ-1201 和 TS-1203 无菌滤
液在离体枝条上均有抑菌活性 , 且抑菌率随稀释
倍数的增大逐渐减小, 其中在 7 d 时原液的抑制率
第 10期 王卫雄等: 苹果树腐烂病拮抗细菌鉴定及其抑菌作用效果测定 1217



图 1 拮抗菌与苹果树腐烂病菌对峙效果
Fig. 1 Confrontation effect of selected antagonistic bacteria strains against Cytospora spp.
A: LZ-1201; B: TS-1203; C: CK.

表 2 筛选出的拮抗菌的无菌滤液在苹果离体枝条
上对腐烂病的防效
Table 2 Control efficiency of fermentation filtrate of selected
antagonistic bacteria strains on excised apple twigs inoculated
with Cytospora spp.
拮抗菌
Strain
稀释倍数
Dilution time
病斑面积
Scab area (cm2)
抑制率
Inhibition rate (%)
原液 Stoste 2.51±0.68ghG 74.43±2.47abAB
10 2.69±0.46ghFG 73.66±1.28abAB
20 2.15±0.48hG 71.73±1.65bcB
30 3.58±0.37fF 62.42±1.53dC
40 4.40±0.27eD 53.82±0.98eD
50 6.66±0.18cC 29.98±0.38hG
LZ-1201
60 8.40±0.26bB 11.78±0.96jH
原液 Stoste 2.50±0.24ghG 77.07±0.91aA
10 2.87±0.05gEFG 73.78±0.19abAB
20 3.45±0.48fEF 69.82±1.29cB
30 2.18±0.21hG 63.71± 0.90dC
40 5.00±0.25dD 47.47±0.96fE
50 6.19±0.36cC 34.92±1.21gF
TS-1203
60 7.95±0.17bB 16.48±0.29iH
CK — 9.52±0.29aA —

最大, 分别达 74.43%和 77.07%, 稀释 50 倍和 60
倍时 , 菌株 LZ-1201和 TS-1203的无菌滤液在离体
枝条上的抑制率小于 50.00%, 2株拮抗菌无菌滤液
在相同的稀释倍数时对苹果树腐烂病的抑制率基
本一致。
2.3 拮抗菌无菌滤液的抑菌作用
拮抗菌无菌滤液在不同稀释倍数下对苹果树腐
烂病菌分生孢子萌发和菌丝生长抑制作用见表 3。
从表 3 可知, 拮抗菌无菌滤液对分生孢子萌发和菌
丝生长均有较好抑制效果。2 株拮抗菌的无菌滤液
对分生孢子萌发和菌丝生长均随着稀释倍数增大而
抑制率降低, 苹果树腐烂病菌的分生孢子培养 36 h
时在拮抗菌无菌滤液的原液中不能萌发, 无菌滤液
在稀释 80倍和 160倍时对分生孢子萌发的抑制率分别
达 54.46%和 53.18%。苹果树腐烂病菌菌丝在 2 株拮
抗菌的无菌滤液原液中不能生长; 菌株 LZ-1201 和
TS-1203 无菌滤液在稀释 40 倍时, 对苹果树腐烂病
菌菌丝生长量的抑制率均大于 60%。两株拮抗菌无
菌滤液对苹果树腐烂病孢子萌发和菌丝生长的抑制
效果基本一致。
表 3 筛选出的拮抗菌菌株的无菌滤液对苹果腐烂病菌
分生孢子萌发和菌丝生长量的抑制效果
Table 3 Inhibition effect of fermentation filtrate of selected
antagonistic bacteria strains against conidium germination and
hypha growth of Cytospora spp.
菌株
Strain
稀释倍数
Dilution
time
分生孢子萌发抑
制率(36 h)
Inhibition rate of
conidium germination
(%)
菌丝生长
抑制率(7 d)
Inhibition rate of
hypha growth
(%)
原液 Stoste 100.00±0.00aA 100.00±0.00aA
20 83.58±2.58bB 76.91±1.24bB
40 64.01±2.94cC 60.70±1.10cC
80 54.46±1.83dD 42.27±0.54dD
160 44.05±1.21eE 40.15±1.50dDE
LZ-1201
320 38.93±2.50efEF 30.78±0.53eDEF
原液 Stoste 100.00±0.00aA 100.00±0.00aA
20 86.02±1.93bB 78.36±0.14bB
40 64.72±1.59cC 62.91±0.87cC
80 59.96±2.35cCD 40.94±9.03dD
160 53.18±0.28dD 28.44±2.52eEF
TS-1203
320 34.41±1.05fF 25.17±2.40eF

2.4 拮抗菌对苹果树腐烂病菌菌丝生长的影响
对照菌丝和受抑制菌丝的显微形态观察结果
(图 2)表明 , 苹果树腐烂病菌丝受拮抗菌 TS1203
和 LZ-1201 抑制后菌丝形态均出现异常。对照菌
丝在生长过程中颜色较浅, 菌丝基部粗细一致, 顶
端逐渐变细; 而受抑制菌丝在培养 3~5 d时均表现
出菌丝细胞原生质浓缩, 菌丝变粗并出现颜色分段
加深的现象, 7~10 d时菌丝顶端和颜色加深处膨大
畸形, 10 d 后部分菌丝膨大处内含物外渗, 菌丝开
始溶解。
2.5 拮抗菌的鉴定
2.5.1 形态特征及理化测定
图 3 和图 4 结果表明, LZ-1201 和 TS-1203在
1218 中国生态农业学报 2014 第 22卷



图 2 筛选出的拮抗菌菌株对苹果树腐烂病菌菌丝
形态的影响
Fig. 2 Effect of selected antagonistic bacteria strains on the
hypha morphology of Cytospora spp.
A: 对照; B: 受抑制菌丝内含物浓缩; C: 受抑制菌丝膨大
畸形; D: 受抑制菌丝内含物释放。A: CK; B: the content of
inhibiting hypha concentrated; C: the inhibited hypha enlargement
and deformity; D: the contents of inhibited hypha released.
NA培养基上生长良好, 28 ℃下培养 2 d可出现明显
菌落。菌株 LZ-1201菌落近圆形、乳白色、不透明、
表面粗糙、背面呈褐色, 革兰氏染色阳性, 菌体杆状,
大小 2.22 μm×6.15 μm。菌株 TS-1203菌落近圆形、
乳白色、具光泽, 不透明、表面有褶皱、背面呈白
色, 革兰氏染色阳性, 大小 1.77 μm × 5.88 μm。生理
生化测定指标结果见表 4。

图 3 筛选出的拮抗菌菌株 LZ-1201(A)和 TS-1203(B)菌
体形态特征
Fig. 3 Thalli morphological characteristics of selected
antagonistic bacteria of LZ-1201 (A) and TS-1203 (B) strains

图 4 筛选出的拮抗菌菌株 LZ-1201和 TS-1203菌落形态特征
Fig. 4 Colonial morphologies of selected antagonistic bacteria of LZ-1201 and TS-1203 strains
A和 B分别为 LZ-1201和 TS-1203在平板培养的性状, C和 D分别为 LZ-1201和 TS-1203在 NA试管斜面培养的形态。A and B are
the colonial morphology characters of LZ-1201 and TS-1203 on plate cultivation; C and D are the colonial morphology of LZ-1201and
TS-1203 on slant cultivation.
表 4 筛选出的拮抗菌菌株 LZ-1201和 TS-1203的生理生化测定结果
Table 4 Physical and biochemical properties of selected antagonistic bacteria of LZ-1201 and TS-1203 strains
菌株 Strain 菌株 Strain 测试指标
Text index LZ-1201 TS-1203
测试指标
Text index LZ-1201 TS-1203
接触酶反应 Contact enzyme + + 硝酸还原 Nitrate reduction + +
甲基红反应 Methyl red reaction + + 淀粉水解 Starch hydrolysis + +
V-P反应 V-P reaction + + 吲哚形成 Indole formation − −
运动性 Move ability + + 1 g·100mL−1 NaCl + +
葡萄糖产气 Glucose gas − − 2 g·100mL−1NaCl + +
柠檬酸利用 Citrate utilization + + 5 g·100mL−1NaCl + +
明胶水解 Gelatin hydrolysis + + 7 g·100mL−1NaCl − +
D-葡萄糖 D-glucose + + 10 g·100mL−1NaCl − −
D-甘露醇 D-mannitol + + 生长温度: 5 Growth temperature: 5 ℃ ℃ − −
麦芽糖 Maltose + + 生长温度: 30 Growth temperature: 30 ℃ ℃ + +
蔗糖 Saccharose + + 生长温度: 50 Growth temperature: 50℃ ℃ − +
+: 阳性反应; −: 阴性反应。+: positive reaction; −: negative reaction.
第 10期 王卫雄等: 苹果树腐烂病拮抗细菌鉴定及其抑菌作用效果测定 1219


2.5.2 PCR检测及 16S rDNA测序
将 2 株拮抗菌送上海生工生物工程有限公司进
行 DNA提取及测序, 得到两株拮抗菌的 16S rDNA
序列长度均为 1 542 bp(图 5)。

图 5 筛选出的拮抗菌菌株 LZ-1201和 TS-1203的
PCR扩增产物电泳图
Fig. 5 PCR amplification product electrophoretograms of
selected antagonistic bacteria of LZ-1201 and TS-1203 strains
2.5.3 16S rDNA序列分析
测序结果在GenBank比对表明: TS-1203与多株
B. amyloliquefaciens的 16S rDNA核苷酸序列同源
性较高, LZ-1201与多株的核苷酸序列同源性较高,
分别选取同源性不低于 99%的序列 , 利用 DNA
Star 软件构建同源性树。结果表明: TS-1203 与 B.
amyloliquefaciens(JF499655)的亲缘关系最近(图 6),
聚为一类, 位于聚类图中的同一分支; LZ-1201 与
B. subtilis(JQ435698)的亲缘关系较近(图 6), 为同一
分支, 聚为一类, 结合形态学特征, 初步确定 TS-1203
为解淀粉芽孢杆菌 (B. amyloliquefaciens), LZ-1201
为枯草芽孢杆菌(B. subtilis)。
3 讨论与结论
目前, 人们对苹果树腐烂病的防治主要采用化
学药剂, 但化学药剂在防治病害的同时也对果园生
态产生严重的影响, 因此高效低毒的生防制剂产品

图 6 筛选出的拮抗菌菌株 LZ-1201和 TS-1203遗传聚类分析
Fig. 6 Genetic cluster analysis of selected antagonistic bacteria of LZ-1201 and TS-1203 strains
成为苹果生产发展的迫切需要[11,20]。本试验从苹果
树的根际土壤和枝条中分离筛选到 2 株对苹果树腐
烂病菌具有较好拮抗作用的拮抗细菌, 这为苹果树
腐烂病生防制剂开发提供了材料。
植物根际土壤和植物内部存在大量微生物, 这
些微生物在长期的进化中与植物和病原菌形成了密
切关系, 其中一些微生物对病原菌产生抑制作用[21]。
黄昌华等[22]从土壤中分离出 1 株对小麦赤霉病具有
良好防效的芽孢杆菌。王彩霞等[11]从土壤分离出对
苹果树腐烂病具有较好拮抗作用的微嗜酸寡氧单胞
菌。本试验通过对拮抗菌菌落形态观察、生理生化
测定和 16S rDNA 序列分析, 将分离的 2 株拮抗菌
LZ-1201和 TS-1203鉴定为枯草芽孢杆菌(B. subtilis)
和解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)。关于芽孢杆
菌防治苹果树腐烂病的研究在国内尚鲜见相关报道。
拮抗细菌对病原真菌的抑制作用主要是通过抑
制病原菌孢子萌发和菌丝生长[23−24]。王彩霞等[11]通
过显微观察拮抗细菌对苹果树腐烂病菌菌丝形态的
影响时发现, 拮抗细菌可以导致苹果树病菌菌丝膨
大畸形、内含物外渗及菌丝溶解, 本试验显微观察
抑菌作用的结果与这一结果基本一致。
本试验通过对拮抗菌无菌滤液的抑制作用测
定表明, 2 株拮抗菌无菌滤液能够显著抑制苹果树
腐烂病菌分生孢子萌发和菌丝生长, 这说明拮抗菌
在培养过程中产生能够抑制苹果树腐烂病菌分生
孢子萌发和菌丝生长的次生物, 由此表明 2 株拮抗
菌在大量发酵后对苹果树腐烂病的防治具有很好
应用价值。植物病害的防治受植物、病原物、生防
菌及环境条件多方面因素的共同作用。本试验对 2
株拮抗菌进行了鉴定、拮抗作用及离体枝条防效的
初步研究, 而对其发酵条件的优化、抗菌活性物质
的提取鉴定及田间防效还有待于进一步深入研究。
1220 中国生态农业学报 2014 第 22卷


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Faculty positions: Center for Agricultural Resources Research,
Chinese Academy of Sciences

The Center for Agricultural Resources Research (CARR), the Institute of Genetics and Developmental Biology (IGDB),
Chinese Academy of Sciences, invites applicants for several research group leader positions.
CARR is one of the research organizations in Chinese Academy of Sciences (CAS). We seek nominations and applications
from individuals who have expertise and a record of accomplishment in research areas related to ecology, agro-hydrology,
agro-biology, crop genetics and breeding, and agro-informatics. The successful candidates for the research group leader
positions will be expected particularly to farmland water transfer and development of water saving technologies, farmland
related groundwater management and hydrochemistry, hydrology, agricultural water resource management, remote sensing
application in agriculture, soil microbiology, agro-ecosystems, plant physiology of drought tolerance, and molecular genetics
and breeding to address fundamental and application agricultural questions.
The appointment of all positions will be at Principal Investigator (full professor) level. Candidates are expected to hold a Ph.D.
degree and postdoctoral experience. Start-up package will be accompanied by either the “One-Hundred Talents Program of
CAS” (minimal four-year postdoctoral required) or the “One-Thousand Youth Talents Program of China” (three-year
postdoctoral required). Very compatible salary, benefits, and research funding will be provided based on the qualifications of
selected candidates. More information about CARR can be found at http://www.sjziam.cas.cn.
Interested candidates should submit a cover letter, curriculum vitae, representative publications, a statement of research
experiences and interests as well as the names and contact information of two referees to:

Dr. Yibo Han, or Chunsheng Hu, Co-Chair of the Research Committee
Center for Agricultural Resources Research
Institute of Genetics and Developmental Biology
Chinese Academy of Sciences
Shijiazhuang, Hebei 050022, China
E-mail: ybhan@genetics.ac.cn or cshu@sjziam.ac.cn